专利名称：用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于低温保存脐带血造血干细胞的保存剂。
脐带血含有丰富的造血干/祖细胞，其增殖与分化能力，体外集落形成能力，刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力等均强于骨髓及外周造血干/祖细胞，并且其免疫细胞的抗原性较弱，CTL祖细胞较少，移植相关GVHD的发生相对骨髓和外周血少而轻，被认为是一种极具潜力的造血干细胞来源。为更广泛地开展脐带血造血干细胞移植，必须要建立大规模的脐带血库，而安全、有效的保存方法是建立脐带血库的关键技术。目前脐带血造血干细胞通常采用液氮低温冻存的保存方式，对于可供液氮保存时使用的冷冻保存剂也已有所研究和报导。如，在《中华器官移植杂志》Vol.15，3(1994)中有由二甲基亚砜(DMSO)、羟乙基淀粉(HES)和白蛋白组成的联合保存剂与传统的由二甲基亚砜和人血清组成的冷冻保护液进行比较的报导。《临床血液学杂志》Vol.12，5(1999)对在液氮中使用由二甲基亚砜和右旋糖酐(LMD)组成的联合保护剂进行了探讨。《中华血液学杂志》Vol.16，6(1995)中报导了使用二甲基亚砜与AB型血清组成的冷冻保护剂保存脐血单个核细胞(MNC)的效果。《中华输血杂志》Vol.9，2(1996)对使用由HES、AB型血清、二甲基亚砜和RMPI1640组成的联合低温保护剂进行了探讨。这些保护剂中除必须的DMSO外，大多还含有外源性成份，如羟乙基淀粉、右旋糖酐、RMPI1640、AB血清、白蛋白等。就右旋糖酐来讲，它是一种由葡萄糖基聚合成的多糖高分子物质，它是由肠膜状明串珠菌发酵蔗糖产生，再经过解聚和用乙醇分级处理后得到的较低分子量的右旋糖酐制剂，其对于长期冷冻保存造血干/祖细胞是否有副作用尚在研究和有待证实。由HES、AB型血清(或人白蛋白)、二甲基亚砜及RMPI1640组成的联合低温保护剂则因其用量大，使用时会使冻存体积成倍增加，操作繁琐，不利于冷冻和复温。
鉴于此，本发明的目的是提供一种既可减少保护剂的使用量，又特别有利于脐带血造血干细胞保存的效果好且使用方便的用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂。
本发明用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂，是由该脐带血的自身脐血浆和二甲基亚砜组成，其体积比为自身脐血浆 1二甲基亚砜 1～1.5.
由于二甲基亚砜的浓度高，加入待冻存的造血干/祖细胞悬液中释放的热量越大，若加入速度和悬液混合不好，易引起细胞损伤。因此在该保存剂的组成中，尤以采用由等体积或基本等体积的自身脐血浆和二甲基亚砜混合组成的形式为佳，这样既保证了冻存效果，又减少了冻存体积。研究显示，一般来讲二甲基亚砜的终浓度以控制在7.5-10％为好，因此将二甲基亚砜用自身脐血稀释成～50％，这样加入待冻存的造血干/祖细胞悬液中，就减少了加入冻存剂的量。实践表明，本发明上述形式保存剂的用量可仅为上述已知保存剂的1/4。
所说的自身脐血浆的制备，可由脐带血经离心分离处理后得到的。例如，置备时可先用转速为～1000转/分，10℃，5分钟，然后～4000转/分，10℃，5分钟即可分离制得符合使用要求的自身脐血浆。
使用本发明上述组成形式的保存剂，不仅能显著减少冻存体积，减少了每份脐血冷冻所占的空间，提高了单位液氮体积内储存脐血的数量，而且有助于保持冷冻和复温过程中脐血各部分的均一性，减少了造血干/祖细胞的损伤，也减少复温后发生细胞聚集的频率。同时，由于该自身脐血浆是脐带血造血干/祖细胞生存的自然环境，含有蛋白质、糖、脂类、激素、血清酶以及鲜为人知的造血活性物质和免疫活性物质，因此将脐带血造血干/祖细胞保存在自身脐血浆中是最有效和最安全的。
使用本发明上述冷冻剂时，可将冷冻保存剂与待冻存的脐血有核细胞悬液按1∶4比例在冷冻袋内混匀，4℃平衡，上程序降温仪，降至-100℃，取出放入液氮液相中。
以下通过具体的实例对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
将自身脐带血在离心机上作分离处理，先用转速为～1000转/分，10℃，5分钟，然后～4000转/分，10℃，5分钟，分离得到自身脐血浆。将该自身脐血浆与二甲基亚砜按等体积或基本等体积的量混合均匀，即为可供保存脐带血造血干细胞的低温保存剂。
将按上述方法制备的本发明低温保存剂与若干目前已有报导的保存脐带血造血干细胞的低温保存剂进行的保存脐带血造血干/祖细胞的效果比较情况如下，并可由此对本发明上述低温保存剂的优越性能有更清楚的了解A.使用本发明保存剂对脐带血造血干/祖细胞保存6个月后总有核细胞数(TNC)回收率 90.46±4.2％，台盼兰拒染率 93.20±6.7％，CFU-GM回收率 89.02±3.8％。
B.20％DMSO+20％人AB型血清+60％RPMI1640(保存3个月后)
MNC回收率 89.4±14.8％，台盼兰拒染率 76.4±8.62％，CFU-GM回收率 51.00±11.39％。
C.20％DMSO+40％人AB型血清+40％RPMI1640MNC活力 73.9±3.9％，CFU-GM回收率 60.8±11.0％。
D.12％HES+10％AB型血清+10％DMSO+68％RMPI1640液有核细胞回收率 82.5±19.4％，细胞活率(台盼兰拒染率) 83.0±5.9％，CFU-GM回收率 60.5±16.0％。
E.5％DMSO+60(克/升)HES+40(克/升)白蛋白细胞回收率 91.9±5.3％，台盼兰拒染率 89.6±4.1％，CFU-GM回收率 70.6±20.2％。
F.50％DMSO+50％LMD(右旋糖酐)细胞回收率 90.2±5.7％，台盼兰拒染率 90.7±5.0％，CFU-GM 回收率 86.8±11.0％。
权利要求
1.一种用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂，其特征在于由待冻存的自身脐血浆和二甲基亚砜组成，其体积比为自身脐血浆 1二甲基亚砜 1～1.5.
2.如权利要求1所述的用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂，其特征在于由等体积或基本等体积的自身脐血浆和二甲基亚砜混合组成。
全文摘要
本发明涉及一种用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂,其特征在于由自身脐血浆和二甲基亚砜组成,其体积比为:1∶(1～1.5)。
文档编号C12N5/02GK1347983SQ0011616
公开日2002年5月8日 申请日期2000年10月11日 优先权日2000年10月11日
发明者陈强, 谭卫东, 杨雪梅, 李政, 陈宪辉, 梁知恒 申请人:四川省脐血干细胞中心有限公司