专利名称：一种聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法。
聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，简称PVA)是一种新型的酶/微生物包埋固定化载体，具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料，近年来在国内外获得了较广泛的研究。
聚乙烯醇在加热后溶于水，在其水溶液中加入添加剂后发生凝胶化，或在低温下(-10℃)冷冻形成凝胶，从而将微生物包埋固定在凝胶网络中。常用的添加剂有硼酸和硼砂，在聚乙烯醇水溶液中加入硼酸或硼砂，通过化学反应形成凝胶，其制作步骤为(1)将聚乙烯醇与水以1∶5-1∶10比例相混合，水浴加热至聚乙烯醇溶化，然后静置降至常温。
(2)将离心后酶/微生物悬浮于0.9％NaCl溶液中，酶/微生物湿重与NaCl溶液的重量比为1∶1-1∶2。将此酶/微生物悬浮液与聚乙烯醇溶液以一定比例相混合。
(3)用注射器将混合溶液滴加到冷却的饱和硼酸溶液中，形成直径几毫米的白色球型颗粒。
(4)将颗粒在饱和硼酸溶液中浸泡一段时间，然后用生理盐水洗涤。
但目前这种聚乙烯醇固定化方法中存在的主要问题是其一，聚乙烯醇是一种高粘性物质，并且聚乙烯醇与硼酸反应较慢，滴下时间相差不大的两液滴相碰时会粘结在一起，并逐步溶合成一团，即聚乙烯醇颗粒有非常强的附聚倾向，使聚乙烯醇凝胶成球困难；其二，聚乙烯醇与硼酸进行反应固定时，硼酸上的三个羟基只部分地进行了反应，反应后形成的高聚物凝胶上还残留有亲水性的羟基，使得固定化颗粒在应用中存在很大的水溶膨胀性，随着使用时间的增长，强度大大减弱，在实际应用中极为不利。
本发明的目的是解决已有的聚乙烯醇固定化技术中存在的固定化颗粒制备过程中成形困难和使用过程中由于水溶膨胀性而导致机械强度降低的问题，提出一种实用的聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法，使其具有制备简单，颗粒的机械强度高，使用寿命长的特点。
本发明提出的一种聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法，包括以下步骤(1)将聚乙烯醇、海藻酸钠、丙烯酰胺与水相混合，水浴加热至溶化，然后静置降至常温成为聚乙烯醇溶液；其中，聚乙烯醇加入量为10-20％；海藻酸钠加入量为0.1-2.0％；丙烯酰胺加入量为0.5-9.0％；其余量为水；(2)将酶/微生物悬浮液与所说的聚乙烯醇溶液以一定比例相混合；(3)将饱和硼酸溶液加入1-2％氯化钙和0.1-1.0％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺制备交联剂溶液；(4)用注射器或滴管将第(3)步制备的混合溶液滴加到冷却的交联剂溶液中，使其形成白色球型颗粒，并在其中浸泡若干小时，然后用生理盐水洗涤。
本发明的特点及效果(1)通过在聚乙烯醇-硼酸交联过程中引入少量的(0.1-1.0％)海藻酸钠成功地解决了聚乙烯醇颗粒的附聚问题，增强了聚乙烯醇凝胶的成球能力；(2)通过在聚乙烯醇-硼酸聚合反应过程中引入丙烯酰胺聚合反应，使之在聚乙烯醇凝胶颗粒内部及表面形成聚丙烯酰胺网状结构，有效地改善了聚乙烯醇凝胶的水溶膨胀性。聚合单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)的加入量分别为0.5-9.0％和0.1-1.0％。
(3)本发明的聚乙烯醇固定化技术，可以使固定化颗粒制备简单，颗粒的机械强度明显提高，使用寿命延长。
实施例1制备步骤(1)将10g聚乙烯醇、0.5g海藻酸钠、6.0g丙烯酰胺与100mL水相混合，水浴加热至溶化，然后静置降至常温；(2)纤维素酶湿重5g，悬浮于10mL 0.9％NaCl中，与12.5mL上述溶液相混合。
(3)将饱和硼酸溶液加入1％CaCl2和0.3％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺制备成都交联剂溶液；(4)用0.40mm ID的注射器将(2)中的混合液滴加到冷却的交联剂溶液中，使其形成2mm直径的白色球型小珠，并在其中浸泡20h，然后用生理盐水洗涤。
实施例2制备步骤(1)将15g聚乙烯醇、1.0g海藻酸钠、4.0g丙烯酰胺与100mL水相混合，水浴加热至溶化，然后静置降至常温；(2)丝孢酵母细胞湿重5g，悬浮于12mL 0.9％NaCl中，与10mL上述溶液相混合。
(3)将饱和硼酸溶液加入2％CaCl2和0.6％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺制备成都交联剂溶液；(4)用胶皮吸管将(2)中的混合液滴加到冷却的交联剂溶液中，使其形成3mm直径的白色球型小珠，并在其中浸泡24h，然后用生理盐水洗涤。
权利要求
1.一种聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法，包括以下步骤(1)将聚乙烯醇、海藻酸钠、丙烯酰胺与水相混合，水浴加热至溶化，然后静置降至常温成为聚乙烯醇溶液；其中，聚乙烯醇加入量为10-20％；海藻酸钠加入量为0.1-2.0％；丙烯酰胺加入量为0.5-9.0％；其余量为水；(2)将酶/微生物悬浮液与所说的聚乙烯醇溶液以一定比例相混合；(3)将饱和硼酸溶液加入1-2％氯化钙和0.1-1.0％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺制备交联剂溶液；(4)用注射器或滴管将第(3)步制备的混合溶液滴加到冷却的交联剂溶液中，使其形成白色球型颗粒，并在其中浸泡若干小时，然后用生理盐水洗涤。
全文摘要
本发明属于生物技术领域,包括:将聚乙烯醇、海藻酸钠、丙烯酰胺与水相混合,水浴加热至溶化,然后静置降至常温成为聚乙烯醇溶液;将酶/微生物悬浮液与聚乙烯醇溶液以一定比例相混合;将饱和硼酸溶液加入氯化钙和N,N’—亚甲基双丙烯酰胺制备交联剂溶液;用注射器或滴管将混合溶液滴加到冷却的交联剂溶液中,使其形成白色球型颗粒,并在其中浸泡若干小时,然后用生理盐水洗涤。本发明具有制备简单,颗粒的机械强度高,使用寿命长的特点。
文档编号C12N1/10GK1302863SQ0013212
公开日2001年7月11日 申请日期2000年12月15日 优先权日2000年12月15日
发明者王建龙, 文湘华, 施汉昌, 钱易 申请人:清华大学