专利名称：产生黄原胶的无毒力野油菜黄单胞菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及丧失了致植物病性质但基本上保持了产生外多糖(exopolysaccharide)，尤其是黄原胶能力的新型细菌菌株，特别是黄单胞菌属(Xanthomonas)的菌株，尤其是野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)。
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X.campestris pv.campestris)是十字花科植物的致植物病的革兰氏阴性细菌，它用于黄原胶的工业生产(Martin，1994，微生物学研究(Res.Microbiol.)1459 93-97)。
这种外多糖经济上的重要性引起了许多关于参与此合成的基因的研究(Martin，1994，如上所述)。
已经对致病性的许多决定因素作了描述(Dow和Daniels，1994，植物与动物中的细菌致病原因(In bacterial pathogenesis of plants andanimals)，JL Dangl编，Springer Verlag，Heidelberg)。其中有对植物组织具有水解活性的胞外酶。当负责这些酶输出的分泌系统失活时，野油菜黄单胞菌的菌株就失去了其致植物病的表型，而此与植物中非常减弱的症状有关(Dow和Daniels，1994，如上所述)。所描述的致病性决定因素中，外多糖似乎在疾病的早期显示出作用(Dow和Daniels，1994，如上所述；Katzen等人，1998，细菌学杂志(J.Bacteriol.)1801607-1617)。同样地，野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中描述的hrpXc基因(Kamoun等人，分子植物微生物相互作用(Mol.Plant MicrobeInteract)522-33)参与抑制相容宿主植物的防御反应，因为这个基因的突变会导致特征性的坏死反应(过敏性反应，HR)。多种野油菜黄单胞菌致病变种中所描述的无毒力基因也参与细菌的致病性，因为含有对应于和引起HR反应的抗性基因的植物能够识别它们(Dow和Daniels，1994，如上所述；Yang等人，1995，分子植物微生物相互作用8627-631)。在参与黄单胞菌属致病性的其它基因中(Dow和Daniels，1994，如上所述)，已经描述了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的两个基因，它们的突变将引起其致病性的减弱，并且没有改变胞外酶和外多糖的累积水平(Osbourn等人，1990，分子植物微生物相互作用3280-285)。其它致病性决定因素包括多组调节胞外酶和外多糖合成的独立基因，其中有rpfA至H基因，它们的突变引起外多糖产生的降低；rpfN基因，是这些酶和外多糖合成的阻遏基因(repressor)；clp基因，它的突变引起致病性的下降以及外多糖产物的降低(Dow和Daniels，1994，如上所述)。最后，致病性的其它决定因素包括hrp基因。
hrp(过敏性反应和致病性)基因对与相容植物有关的致病性和与抗性宿主有关的过敏性反应是至关重要的(Alfano和Collmer，1997，细菌学杂志1795655-5662)。在欧文氏菌属、假单胞菌属、Ralstonia属和黄单胞菌属的多种致植物病的细菌中，已经克隆了这些基因，并在不同程度上描绘了其特性，它们是相对保守的(Zurek和Bukowski，1998，Acta Microbiologica Polonica，47227-241；Alfano和Collmer，如上所述)，尤其是在野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(X.campestrispv vesicatoria)中(Huguet等人，1998，分子微生物学(Molec.Microbiol)291379-1390；Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396；Bonas，1994，如上所述)。而且已经将其中最保守的改名为hrc基因(Bogdanove等人，1996，分子微生物学，20681-683)。迄今为止所描述的hrp基因的功能中有它们的表达调控、引起宿主反应的蛋白质的产生、特异的分泌系统(“III型” )的组成以及周质葡聚糖的合成(Zurek et Bukowski，1998，Acta MicrobiologicaPolonica，47227-241；Mudgett et Staskawicz，1998，微生物学的当前观点(Current Opinion in Microbiology)1109-114；Lindgren，1997，植物病原学年评(Annu.Rev.Phytopathol.)35129-152；Alfano和Collmer，1997，如上所述；Bonas，1994，如上所述)。已经克隆了一组野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的hrp基因(Arlat等人，1991，分子植物微生物相互作用，4593-601)，但是没有测序。也已经报道，根据平板上菌落的外观，认为由转座子引起这些基因发生突变的菌株具有正常外多糖的产生。但是没有公布这些菌株中更为精确定量的黄原胶产生能力。
另外，这些菌株中产生的突变在性质上不十分稳定，不适用于生产黄原胶的工业用途。具体地，所使用的转座子含有编码转座酶的基因(Simon等人，1989，基因(Gene)80161-169)，不排除估计大约以每世代10-6至10-3的频率发生转座子的切除事件(Berg等人，1989，Berg和Howe编著，可移动DNA(Mobible DNA)，美国微生物学会，华盛顿，879-926页；Craig，大肠杆菌和沙门氏菌(Escherichia coli andSalmonella)，Neidhardt编著，ASM出版社，华盛顿，2339-2362页)。另外，所使用的转座子含有抗生素新霉素和卡那霉素的抗性基因。最后，插入到这些菌株基因组中的转座子构成非同源性DNA元件，因为它不是该菌株基因组自身的元件。
虽然，目前在欧洲没有因野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的致植物病性质而施加特殊的管理法规，但是由于与环境有关的原因，使用非致植物病的野油菜黄单胞菌来降低可能污染附近农学目的栽培的风险是非常可取的。使用常规的随机诱变技术来选择用于生产的这样的菌株是一个冗长乏味的过程，因为它必须包括分离非致植物病但又保持生产能力特性(即无次级突变)的菌株的高通量筛选。
此外，使用产生改造的黄原胶(如US 5,514,791所描述的)或者已经提高了生产力的遗传修饰菌株是经过严格规定的(Theilleux 1998，Dictionnaire permanent bioéthique et biotechnologies[生物伦理学和生物技术的永久条例]，ed Législatives[立法机关编]，第1595-1648页)。后者要求，尤其是对菌株中产生的对植物有危害的结构，在生产地区必须采用严格的防止扩散措施。因此，必要花费将具有负面的经济后果。
因此，要求用于工业生产的野油菜黄单胞菌菌株稳定地缺失致植物病性质，但保留其黄原胶的生产能力特性。另外，由于法规以及为了简化由生物质中分离黄原胶所带来的垃圾处理，使用不含有编码抗生素抗性的异源基因的菌株是有用的。最后，根据法国和欧洲立法，优选使用通过自体克隆(autocloning)构建得到的菌株，即是它不含有自身遗传以外的任何DNA元件。
本发明人的研究已经可以构建具有所要求特性的野油菜黄单胞菌菌株。
令人惊讶的是，本发明显示，通过缺失影响到毒力有关基因的几千个碱基的相当大的片段，得到稳定地非致植物病的细菌，但是它仍然能够生产黄原胶。
更为令人惊讶的是，本发明所改造的菌株产生的黄原胶在数量和质量的所有方面都能够与产生该结构的野生型菌株所产生的黄原胶相比。
本发明的一个主题是通过失活至少一个毒力基因而丧失致植物病性质、并且保持产生外多糖能力的细菌菌株。
根据本发明，通过缺失hrp或hrc基因群的至少一个基因，有利的是至少两个基因，优选至少三个基因，优选hrp或hrc基因群的5至9个基因，可有利地获得稳定地非致植物病的细菌菌株。
措辞“稳定地缺乏致植物病性质”是指在经过至少20代，有利的是至少30代，优选至少40代的细胞周期以后仍然保留着这个特性。
在丧失了致植物病性质并能够有利地用于外多糖工业生产的细菌中，尤其要提到以下属欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Ralstonia以及黄单胞菌属。
本发明的一个主题，尤其是本质上稳定地缺乏致植物病性质并且基本保持产生外多糖能力的黄单胞菌属菌株。
措辞“本质上非致植物病的”是指在通过损害叶片的中脉进行接种至少15天后，在宿主十字花科植物，尤其是甘蓝(Brassica oleracera)的叶上没有扩散损伤和/或枯萎。
有利地，黄单胞菌属菌株是野油菜黄单胞菌的，尤其是野油菜致病变种的。
所述基因的失活优选通过缺失hrp或hrc基因群中至少1kb，优选至少3kb，有利地至少5kb，优选hrp或hrc基因群中的9kb，并可长达40kb来获得。
在一个优选的实施方案中，通过缺失野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致植物病的野生型菌株的hrpA1至hrpC2基因得到根据本发明的本质上非致植物病的黄单胞菌属菌株，尤其是野油菜黄单胞菌菌株。
本发明黄单胞菌属菌株所产生的黄原胶与野生型产生的是基本相同的，换句话说，它具有基本相同的分子量分布，还有相同程度的修饰，尤其是乙酰化和丙酰化(pyruvylation)的程度。
本发明的主题还有一种制备以上所定义菌株的方法，其特征在于是通过与含有hrp或hrc基因的全部或部分缺失的质粒进行同源重组来获得的。
本发明的主题还有一种制备细菌外多糖，尤其是黄原胶的方法，其特征在于将以上所定义的细菌菌株，适当地，黄单胞菌属菌株，优选野油菜黄单胞菌菌株，在允许于发酵培养基中产生外多糖的条件下进行培养。
下面的实施例将举例说明对应于本发明特征的野油菜黄单胞菌菌株的构建。
在这些实施例中，使用通过筛选黄原胶所获得的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种菌株来进行构建。
不用说，根据所述技术领域中的一般知识以及以下所给出的说明，尤其是当菌株属于野油菜黄单胞菌时参考部分所报道的序列，黄单胞菌属和不同属中产生外多糖的、本领域技术人员可获得的其它细菌菌株也可用作产生非致植物病菌株的出发原始材料，为理解实施例，将参考附图，其中-
图1用图解法表示构建携带hrp基因缺失的野油菜黄单胞菌RPA-BIOCAT826菌株衍生物的策略。
Fenselau和Bonas(1995，分子植物微生物相互作用，8(6)845-854)和Fenselau等人，(1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)描述了野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种中hrp基因的组成，在Genebank中是可部分获得，其登录编号为U33548。按照克隆它们的质粒的名称，对从RPA-BIOCAT826菌株中克隆的同源区进行了描述。Arlat等人(分子植物微生物相互作用，1991，4593-601)公布了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中hrp区的限制性图谱，并在实施例1到4中给出了所完成的结果。经过双重同源重组将实施例中所描述的pRPA-BCAT140质粒携带的ΔhrpA1-C2缺失引入到基因组中。
-图2表示使用以下所描述的HRPB5探针和RPA-BIOCAT826菌株以及该菌株的两个已经整合了ΔhrpA1-C2缺失的衍生物的基因组DNA，通过DNA印迹法所得到的杂交信号。分子量大小标记条带的位置是通过与转移以前经溴化乙锭染色的凝胶上的移动距离比较而得到的。这些大小用千碱基(kb)来表示。
-图3表示使用以下所描述的HRPC2探针和RPA-BIOCAT826菌株以及该菌株的五个已经整合了ΔhrpA1-C2缺失的衍生物的基因组DNA，通过DNA印迹法所得到的杂交信号。分子量大小标记条带的位置是通过转移以前经溴化乙锭染色的凝胶上的移动距离比较而得到的。这些大小用kb来表示。
材料和方法除非另外说明，所使用的技术都是本领域技术人员所公知的常规分子生物学和微生物学的技术，例如Ausubel等人1987年(分子生物学当代方法(Current Protocol in Molecular Biology)，John Wiley andSons，纽约；Maniatis等人，1982，分子克隆实验室手册(MolecularCloninga laboratory manual)，冷泉港实验室，纽约)和Coligan等人1997年(蛋白质科学当代方法(Current Protocol in Protein Science)John Wiley & Sons公司)所描述的。
1.原始菌株RPA-BIOCAT826菌株来自Rhodia Chimie的保藏中心(Melle factory，RTAM)，根据它的白色形态外观而不是通常的黄色外观来加以选择。RPA-BIOCAT1016、1017、1019和1021菌株保藏在CBS，各自的编号为CBS101940、CBS 101941、CBS 101942、CBS 101943和CBS 101944。
2.MSX培养基培养黄单胞菌属的MSX培养基含有0.2g/l酵母提取物；1.2g/lNH4NO3；7.3g/l K2HPO4；0.25g/l MgSO4.7H2O，1g/l葡萄糖和15g/l细菌用琼脂(Bacto-Agar)用于琼脂培养基；10g/l葡萄糖用于液体培养基。将硫酸镁和葡萄糖分别灭菌并临时加入。灭菌之前，用稀释到10％的硫酸将培养基的pH平衡到pH7.2。
基因组DNA是由MSX中新鲜的液体培养物制备的(OD660小于0.4)。将40ml培养物离心后，用11.9ml TE缓冲液悬浮细胞沉淀(分子生物学当代方法，John Wiley and Sons，纽约)，加入630μl 10％SDS(十二烷基硫酸钠)，然后再加入63μl 20mg/ml的蛋白酶K。37℃孵育1小时后，加入2.1ml 5M的NaCl溶液，然后加入1.7ml溶解于0.7M NaCl溶液中的10％CTAB，将整个混合物在65℃孵育10分钟。用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混合物第一次抽提后，再用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合物进行第二次抽提，将上清中加入0.6体积的异丙醇。离心(10000转/分5分钟)后，将得到的沉淀用70％的乙醇洗涤后干燥，再溶解到至少2ml的TE中，然后再加入25μl 5mg/ml的核糖核酸酶溶液。37℃孵育1小时后，用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，通过加入0.1体积的3M醋酸钠和2.5体积的乙醇将上清中的DNA沉淀出来。将14 000转/分离心5分钟得到的沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥后，重新悬浮在至少0.5ml的TE中。
实施例1RPA-BIOCAT826的hrpC2区的克隆使用引物XcC2.3(SEQ ID No.1)和XcC2.4(SEQ ID No.2)从RPA-BIOCAT826的基因组DNA起始通过PCR扩增目的片段。抽提RPA-BIOCAT826菌株的基因组DNA，并在PCR反应中使用，其中含有100ng基因组DNA，40pmol的每一种引物，0.2mM dNTP和1.25U Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)，终体积为50μl这种酶的缓冲液。95℃孵育5分钟后，混合物首先经过30个循环，每个循环包括94℃孵育1分钟，然后在温度63℃-48℃(每一循环变化0.5℃)下1分钟，以及72℃1分钟。接下来的15个循环包括94℃孵育1分钟，48℃1分钟以及72℃1分钟。最后是72℃10分钟。将大小接近1.2kb的扩增产物通过在琼脂糖凝胶上的移动和接下来使用的Qiaex试剂盒(Quiagen)来进行纯化。然后将它克隆到用EcoRV打开的pZERO-1载体(Invitrogen BV)中。转化大肠杆菌(E.coli)菌株JM110后，选择含有已经整合了1.2kb片段的质粒的克隆。将这个质粒命名为pRPA-BCAT91并将它所含有的插入片段进行测序(GenomeExpress，Grenoble，法国)。将所得到的序列(SEQ ID No.3)与野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的hrpC2基因序列(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)进行对比。与代表61％hrpC2基因的1188bp的序列有87％的一致性。由核苷酸序列所推测的氨基酸序列与野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的HrpC2蛋白序列的相应部分显示出92％的一致百分比。
实施例2RPA-BIOCAT826 HrpA区的克隆使用对应于野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种菌株等同区域的探针，通过筛选RPA-BIOCAT826菌株的部分基因组文库来克隆该区。在名为pL3o的质粒中可得到该区域，该质粒含有包括野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的hrpB8和hrpA1基因6.6kb的EcoRV插入片段(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)。
使用引物XcvA15(SEQ ID No.4)和XcvA18(SEQ ID No.5)各40pmol，pL3o质粒模板(40ng)，0.2mM dNTP和1.25U Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)，终体积为50μl的这种酶的缓冲液，通过PCR来制备HRPA1探针。95℃孵育5分钟后，混合物经过30个循环，各循环包括94℃孵育30秒钟，然后在55℃下1分钟，以及72℃1.5分钟。最后72℃孵育10分钟后，将扩增的664bp产物先在琼脂糖凝胶上，然后再使用Qiaex试剂盒(Quiagen)进行纯化。
用100单位的EcoRI将大约10μg的BIOCAT826菌株基因组DNA在37℃消化16小时。然后使用常规的DNA印迹技术，目的是测定与上述的HRPA1探针杂交的EcoRI片段的大小。将上述的EcoRI消化物在琼脂糖凝胶上移动后，转移到Hybond N+膜(Amersham)上，使用按照制造商的说明用Ready-To-Go试剂盒(Pharmacia Biotech)得到的磷32标记的HRPA1探针，在水性杂交溶液(0.55％SDS；6％SSC；0.25％脱脂奶粉)中，55℃进行杂交19小时，并用0.2SSC和0.1％SDS溶液在55℃下洗涤，将膜在-80℃下放射自显影19小时。胶片的显影表明杂交信号的大小接近7.3kb。
因此，用1000单位的EcoRI将100μg的RPA BIOCAT826菌株基因组DNA在37℃消化20小时后，产生该菌株的部分基因组文库。在琼脂糖凝胶上移动后，将大小在7kb到8kb片段所对应的区域切下，在透析袋(购自Spectrum Medical Industries公司的Spectra/Por膜)中通过电洗脱将DNA从胶中抽提出来。乙醇沉淀后，将DNA与经EcoRI酶切后用虾碱性磷酸酶(美国生物化学(United States Biochemicals))去磷酸化的pBlueScript II SK载体(Stratagene)在终体积10μl中连接。将连接化合物在16℃孵育14小时后，用1/10的混合物通过电穿孔转化大肠杆菌DH5alpha细胞。使用HRPA1探针与转移到尼龙膜上的菌落进行杂交来分析大约3 000个转化体。将12个产生阳性杂交信号的菌落在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上进行纯化。抽提12个纯化菌落的质粒，使用HRPA1探针，通过DNA印迹法来分析这些质粒的EcoRI消化物，目的是确认与该探针杂交的大约7.3kb片段的存在。使用多种酶进行限制性内切酶分析后，将2.7kb的SacII片段和1.6kb的SacII片段亚克隆到用SacII酶切后的pBlueScript II SK载体上，分别产生pRPA-BCAT135和pRPA-BCAT134载体。将这两个载体进行部分测序(GenomeEopress，Grenoble)，结果表明存在1818bp的可读框(SEQ ID No.6)，推断的多肽序列与野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的HrpA1蛋白(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)具有85％的一致性。
实施例3来自RPA BIOCAT826、含有ΔhrpA1-C2缺失的菌株的构建通过将pRPA-BCAT134的一个片段和pRPA-BCAT91的一个片段(参照
图1)克隆到质粒pJQ200SK(Quandt和Hynes，1993，基因(Gene)12715-21)中来体外构建ΔhrpA1-C2缺失。用NcoI打开pRPA-BCAT91质粒，然后用多聚酶I(Klenow片段)在25μM dNTP存在下，30℃处理15分钟。用酚/氯仿/异戊醇进行抽提后，再用乙醇沉淀。将样品溶解到40μl水中，用20单位XbaI 37℃处理样品，接下来再用20单位ApoI 50℃处理。然后用胶分离出大约1.2kb的片段，并用Quiex II试剂盒(Quiagen)回收。用同样的方法纯化大约1.3kb的pBCAT134的RsaI-SacII片段。将这两个片段连接到用SacII和XbaI打开的pBlueScript II SK载体中，产生pRPA-BCAT139质粒。然后，从这个质粒中能够抽提出携带ΔhrpA1-C2缺失的大约2.5kb的SacI-XbaI片段以便克隆到用SacI和XbaI酶打开的质粒pJQ200KS中。得到的质粒命名为pRPA-BCAT140。这个质粒在野油菜黄单胞菌中是不能复制的，它携带的庆大霉素抗性标记可用于选择已经通过同源重组整合了该质粒的野油菜黄单胞菌克隆，而且它所携带的sacB正向选择标记可用于选择发生第二次同源重组事件后去除了庆大霉素抗性标记的克隆。
通过接合将pRPA-BCAT140质粒引入到RPA BIOCAT826菌株中。为此，将MSX培养基中含有pRPA-BCAT140的DH5alpha菌株指数生长期的培养物40μl，含有pRK2013质粒的HB101菌株指数生长期的培养物40μl(Ditta等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 777347-7351)和指数生长期的RPA-BIOCAT826菌株培养物40μl，在MSK琼脂培养基上混合。30℃孵育24小时后，将已经整合了pRPA-BCAT140质粒的野油菜黄单胞菌克隆在含有15μg/ml庆大霉素的MSX琼脂培养基上连续纯化两次。在约1平方厘米的含有5％蔗糖的MSX琼脂培养基表面平板接种8个克隆。30℃孵育72小时后，通过在MSX琼脂培养基上两次连续的纯化来分离菌落。然后，为鉴别45庆大霉素敏感的克隆(根据此实验90到100％的克隆)，将大约300个菌落在含有15μg/ml庆大霉素的MSX琼脂培养基上进行传代培养。然后用EcoRI-BamHI消化的其基因组与HRPA1探针进行DNA印迹法来分析大约40个这样。大约有25％的克隆表现出与野生型RPA-BIOCAT826菌株不同并与ΔhrpA1-C2缺失的整合一致的信号。选择了5个克隆用于后面的实验RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022。
实施例4来自RPA-BIOCAT826并含有ΔhrpA1-C2缺失的菌株的DNA印迹法鉴定通过分析EcoRI、BamHI和EcoRI-BamHI消化的基因组DNA与HRP3’A1、HRPB5和HRPC2探针的杂交图谱来分析鉴定RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022。
HRP3’A1探针是通过将pRPA-BCAT134质粒的1.6kb SacII片段在琼脂糖凝胶上移动，然后再使用Qiaex试剂盒进行纯化而得到的。
HRPC2探针是通过将pRPA-BCAT91质粒的1.2kb EcoRI-XbaI片段在琼脂糖凝胶上移动，然后再使用Qiaex试剂盒进行纯化而得到的。
HRPB5探针是通过将pRPA-BCAT129质粒的1.5kb BamHI片段在琼脂糖凝胶上移动，然后再使用Qiaex试剂盒进行纯化而得到的。尤其该插入片段的测序表明有一个可读框(SEQ ID No.7)，推断的肽序列与野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的HrpB5蛋白(Fenselau等人，1995，分子植物微生物相互作用，8845-854)具有77％的一致性。通过将大小在1.3至1.9kb的RPA BIOCAT826菌株的BamHI基因组DNA片段克隆到pBlueScript II SK载体中，并按照实施例2中所描述的相似方法用HRPB探针筛选菌落来得到pRPA-BCAT129质粒。使用引物RST2和RST3(Leite等人，1994，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)601068-1077)与质粒模板pB10g(U.Bonas，个人联系)通过PCR来获得HRPB探针。质粒pB10g相当与其中克隆了含有野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的hrpB区域和hrpA1基因的7.3kb BamHI片段的pBlueScript KS质粒(Fenselau等人，1995，分子植物微生物相互作用，8845-854)。使用40pmol的每一种引物，50ng pB10g，0.2mM dNTP和1.25U Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)，在终体积为50μl这种酶的缓冲液中进行PCR反应。95℃孵育5分钟后，混合物首先经过24个循环，每个循环包括95℃孵育30秒钟，然后在温度70℃-63℃(每一循环变化0.3℃)下40秒钟，以及72℃1分钟，接下来的6个循环包括95℃孵育30秒钟，63℃40秒钟以及72℃1分钟，最后是72℃5分钟。将大约840bp的扩增产物在琼脂糖凝胶上和使用Qiaex试剂盒(Quiagen)来进行纯化。
根据提供的说明，使用“Megaprime DNA标记系统”试剂盒(Amersham)标记探针来进行DNA印迹法分析。按照所提供的说明，将基因组DNA的消化物在琼脂糖凝胶上移动后，转移到Hybond N+膜(Amersham)上，在由0.5M磷酸盐缓冲液和7％SDS(115ml 1M Na2HPO4，84.6ml[脱漏]MNaH2PO4，200ml水和28克SDS)组成的杂交溶液中孵育。将标记的探针在100℃孵育5分钟，再在室温下孵育5分钟，然后稀释在12ml杂交溶液中，100℃孵育5分钟。接下来将混合物与膜在65℃接触6到20个小时，将膜在含有1％SDS的0.1M磷酸盐缓冲液(42.3ml 1MNa2HPO4，57.7ml1M NaH2PO4，900ml水和10克SDS)中洗涤10到15分钟后，曝光。
用HRPB5探针所得到的结果(图2)表明，对于RPA-BIOCAT826菌株，使用EcoRI消化的杂交信号在大约4.8kb，用BamHI消化和EcoRI-BamHI消化的信号在1.6kb。这些结果与Arlat等人(分子植物微生物相互作用，1991，4593-601)所得到的图谱和以上所描述的hrpB5基因的定位是一致的。所研究的RPA-BIOCAT菌株中没有显示出与HRPB5的杂交信号，这与这些RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022的基因组中整合了ΔhrpA1-C2缺失是一致的(图2只显示了RPA-BIOCAT菌株所得到的杂交结果)。
用HRPC2探针所得到的结果(图3)表明，对于RPA-BIOCAT826菌株，使用EcoRI消化的杂交信号在大约5.5kb，用EcoRI-BamHI消化的信号在2.6kb。这些结果与Arlat等人(分子植物微生物相互作用，1991，4593-601)所得到的图谱，野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的hrp基因的组构(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)和以上所描述的hrpB5基因的定位是一致的。由RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019和1021所得到的结果，使用EcoRI消化的杂交信号在7到8kb之间，用EcoRI-BamHI消化的信号在4.4kb。如
图1所显示的图谱，这些结果与RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022的基因组中整合了ΔhrpA1-C2缺失是一致的。
最后，用HRP3’A1探针所得到的结果表明，对于RPA-BIOCAT826菌株，使用EcoRI-BamHI消化的杂交信号在7.3kb。使用RPA-BIOCAT菌株1016、1017、1019和1021，该杂交信号在4.4kb。这与这些菌株基因组中整合了ΔhrpA1-C2缺失是一致的。
实施例5来自RPA-BIOCAT826并含有ΔhrpA1-C2缺失的菌株的毒力在甘蓝植物(Brassica oleracera var.captiva eultivar Siria)上进行毒力试验，从Clause Semences(av.Lucien Clause，91221Brétigny-sur-Orge，法国)获得其种子。根据以下的常数在人工气候室中种植这种植物25℃14小时、55％温度、饱和的光强度(4000W/m)；25℃10小时，60％湿度。在两叶阶段进行感染，例如播种后大约13天。对每一种菌株都使用8株植物，在第一片叶子的中脉末端部分使用感染的牙签进行穿刺。通过将牙签的顶部浸入到MSK培养基中所研究的菌株的2天培养物(大约108细菌/ml)中来使之得到污染。阴性对照包括使胡椒发生植物病害的、在Clause Semences分离到的野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种的参考菌株混合物(B229RI菌株＝RPA-BIOCAT381，B230RII菌株＝RPA-BIOCAT382)。阳性对照包括使甘蓝发生植物病害的，在ClauseSemences分离到的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的参考菌株混合物(2963菌株＝RPA-BIOCAT379，63C2AM菌株＝RPA-BIOCAT380)。观察症状(V形黄色损伤)，并在感染12和14天后测量。对应以下0，没有症状；1，感染点的附近有褪色；2，坏死小于0.5平方厘米；3，坏死在0.5到1.5平方厘米；4，坏死大于1.5平方厘米；5，叶片的广泛坏死，对每一株植物进行打分。用同一种菌株感染的8株植物的分数总和是该菌株的致病性分数(表1)。表1黄单胞菌属菌株的致植物病性
虽然RPA-BIOCAT826菌株能够引起叶片的不断枯萎，但所构建的菌株至多只能引起局部的坏死干枯，从而反映出无致病性。
序列表<110>RHODIA CHIMIE<120>产生黄原胶的无毒力野油菜黄单胞菌菌株<130>BFF 99/0315<140>FR 9907963<141>1999-06-22<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>1aaattcgtca agggtgatgc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>2gttccacctg gtcgacaagc20<210>3<211>1189<212>DNA<213>野油菜黄单胞菌<400>3aaattcgtca agggtgatgc gatcgccggc ctggtgatca ccatggtcaa catcttggcc 60ggcatcgtgg taggcgtgac ctaccacggc atgagcgcgg gcgaggccgc caaccgcttt 120gcgatcctgt cggtaggcga tgcgatggtg tcgcagatcg cctcgctgct gatctcggtg 180gcggccggcg tcatgatcac ccgcgtcgcc aacgagaatg aaaccaagat cagctcgctc 240gggctcgaca tcggccgcca gctcaccagc aacgcacgtg ccttgatggc agcgagtgtg 300ctgctggcct gctttgcgtt cgtgccggga tttccggcgc tgctgttcct gctgctggca 360gcggcggtcg gtgccggggg ctatacgatc tggcgcaagc aacgcgacac cagcgggagc 420gatcagcccg cactgccatc aaccagccgc aaaggtgcca aaggcgatgc gccgcacatc 480cgcaagagcg ccccggattt cgcctcgccc ttgtcgatgc ggctttcgcc gcaactggct 540gcacggctcg acccggcgct gctggatcag gcgatcgaaa gcgagcggag gcaattggtc 600gagctgctgg gattgccgtt cccggggatc gcgatatggc agagcgaatc cctgcagggc 660ctgcagtacg aagtgttgat ccacgatgtg ccggaaaccc gcagcgcgtt gagcgatacg 720gcggacatgc agaaagcgct ggcccaacaa gccatcgcac cgttgcatgc acgcgcgcat 780ctgttcgtcg gcatccagga gacgcagtgg atgctggaac aggtgggcgc ggactatccc 840gggctggttg cagaggtcaa caaggccatg ccagcccaac gcatcgccga tgtgttgcgg 900cgactgctgg aagaacgcat cccggtgcgc aacatcaaga gcatcctgga gagcctggtg 960gtgtggggac cgaaggaaaa ggatctgctg atgctgaccg agtatgtgcg ctgcgatctc 1020ggccgctatc ttgcgcacac cgcgaccgca ggcaccggac agctgcctgc ggtgatgctc 1080gaccacgccg tggaacagtt gatccggcag tcgattcgcg ccacaccggc cggcaatttc 1140ctggcgctgc caccggagca ggccaatcag cttgtcgacc aggtggaaa 1189<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>4gatccaacag ctggacaacc20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>5aacggaatct tcgacaggcc20<210>6<211>1818<212>DNA<213>野油菜黄单胞菌<400>6atggcatacg cctgtcctcc agttcaccgc catcgacgcg cgccgttggc cgctgccttg 60ttgcttggct tgctgccgct gctgccgccg catgccaacg ccgcgtcggt gccgtggcac 120tcgcgcagct tcaaatacgt tgccgaccgc aaggatctca aggaggtgct gcgcgacctg 180tccgccagcc aatccatcac cacctggatt tcaccggagg tgaccggcac gctcagtggc 240aaattcgaag ccactccgca gaagtttctc gacgatctat cgggcacgtt cggttttgtc 300tggtattacg atggctcggt gctcagaatc tggggcgcga acgagaccaa gaatgcgacc 360ttgagtttgg gcgctgcatc gacgagtgcg ctgcgcgatg cgcttgcgcg catgcggctg 420gacgatccgc gctttccggt ccgttatgac gagacagcgc acctggcggt ggtgtcgggc 480ccgccgggtt atgtggatac cgtcgcggcg atcgccaagc aggtcgagca ggtcgcgcgc 540caacgcgacg ccaccgaagt gcaggtgttt cagctgcatt atgcgcaggc ggccgaccac 600accacccgca tcggtggtca agacatccag gtgccgggca tggccagcct gttgcgcaac 660atatacggcg tgcgtggcgc gcccactgcg gcgctgcccg ggccaggcgc gaatttcggg 720cgtgtgcaac cgatcggcgg tggctcgtcc aataccttcg gcaacagcgg tcagcgccag 780agtggcggca gcggcattct cggtttgcct gcgtcgtggt tcggcgctgg gtcgccgtcc 840gagcgggtgc cggtcagtcc gccgttgccg ggcagtggca atagcgccaa tgcgccggcc 900agcgtgtggc cggagatgag ccaggccaga cgcgatgcgc cgctggcggt ggacgccggc 960agcggcggtg agctggcatc cgacgcgccg gtgatcgaag ccgacccgcg caccaacggc 1020attctcattc gcgaccgccc cgagcggatg gccgcctatg gcacgttgat ccagcagctc 1080gacaaccgtc ccaagctgct gcagatcgat gccaccatca tcgagatccg cgacggcgcc 1140ctgcaggatc tcggcgtgga ctggcggttc cacagccggc gtgtggatgt gcagaccggc 1200gacgggcgtg gtggccagct tggctacgat ggcagcttga gcggtgcagc agccgccggt 1260gcagccgcgc cgttgggcgg gacgttgacc gctgtcctgg gcgatgcagg gcgttacctg 1320atgacgcgcg tctcggcgct cgagcagacc aacaaggcca agatcgtctc caccccgcag 1380gtggcgacgc tggacaacgt ggaagcggtg atggaccaca agcaacaggc attcgtgcgt 1440gtcagcggtt atgcatccgc cgacctctac aacctgtccg cgggtgtatc gctacgcgta 1500ttgccaagtg tggtgccggg gtcgccaaat ggtcagatgc gcctggatgt gcgtatcgaa 1560gacgggcagt tgggcgccaa taccgtcgat ggcattcccg tcatcacctc cagcgagatc 1620accacgcagg ccttcgtcaa cgagggccag agcctgctga tcgccggtta tgcttccgac 1680accgatcaga cagatctgaa caacgtcccc gggctgtcca ggattccatt ggtcggcaac 1740ctgttcaagc atcgccagca gagcgggtcg cggttgcagc ggttgttcct gctgaccccg 1800catatcgtct cgccctga 1818<210>7<211>702<212>DNA<213>野油菜黄单胞菌<400>7atgcgtcttt ggctgaggtc cacaccggaa gcggtcggcc ttgactgcga ggtcatccca 60cgcgaggcat tggcctgtgt gctggaactg gacgcagcgg gtgcacaggt gcacgcgcgt 120tgcgcgcagg cgctggcgga cgcccagacg cgtgcgcagg cgctgctcga cgctgcccaa 180cggcaggccg aggccatcct tcaggatgcc cacgacaggg ccgagcgcag tgcacgcctg 240ggctatgccg ccgggctgcg ccgtcagctc gacgcgtgga acgagcgcgg cgtgcggcat 300gccttcgcgg cccaggacgc cgcacggcgc gcccgcgagc gcctggccga gatcgtcgcg 360cacgcctgcg agcaggttct gcacgggcac gatcctgcgg cgctgtacgc gcgcgccgca 420caggcgctgg acggcgccct ggacgaggcg aacgccctgc aggtgagcgt gcatcccgat 480gcgctggacg atgcacggcg cgccttcgat gcggccgcag cggccggcgg atggagcatg 540ccggtggaac tgtgcggtga tacgactctg gccttgggtg cctgcgtgtg cgaatgggat 600accggcgtgt tcgagaccga tctgcgtgat cagctgcgca gtctccggcg cgtcattcgc 660cgcgtgttgg ccacgccgca ggcggtgccg gatgcttgct ga70权利要求
1.细菌菌株，其已通过失活至少一个毒力基因而丧失致植物病性质，并保留产生外多糖的能力。
2.权利要求1所要求保护的细菌菌株，其特征在于已通过失活hrp或hrc基因群的至少一个基因，有利的是至少两个基因，优选至少三个基因使其成为稳定地非致植物病的细菌菌株。
3.权利要求1或2所要求保护的细菌菌株，其特征在于已通过失活hrp或hrc基因群的5至9个基因使其成为稳定地非致植物病的细菌菌株。
4.权利要求1所要求保护的细菌菌株，其特征在于它是通过失活至少一个毒力基因而丧失致植物病性质但保留产生外多糖能力的黄单胞菌属菌株。
5.权利要求4所要求保护的黄单胞菌属菌株，其特征在于它是野油菜黄单胞菌的菌株。
6.权利要求5所要求保护的黄单胞菌属菌株，其特征在于它是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种。
7.以上任一个权利要求所要求保护的黄单胞菌属菌株，其特征在于通过缺失hrp或hrc基因群中至少1kb，优选至少3kb，有利的是至少5kb的DNA区来获得所述基因的失活，并且该菌株保持产生外多糖的能力。
8.以上任一个权利所述要求所要求保护的黄单胞菌属菌株，其特征在于它包含了至多40kb的DNA区的缺失。
9.权利要求8所要求保护的黄单胞菌属菌株，其特征在于其是通过缺失hrpA1到hrpC2基因的全部或部分来获得的。
10.本质上非致植物病的黄单胞菌属菌株，其特征在于它包含hrp或hrc基因群中至少1kb，优选至少3kb，有利的是至少5kb的DNA区域的缺失，并且它保留了产生外多糖的能力。
11.本质上非致植物病的黄单胞菌属菌株，其特征在于它是通过hrpA1-C2基因的全部或部分缺失来获得的。
12.本质上非致植物病的野油菜黄单胞菌菌株，其选自BIOCAT 1016、BIOCAT 1017、BIOCAT 1019、BIOCAT 1021和BIOCAT 1022菌株，其中这些菌株分别以编号CBS 101940、CBS 101941、CBS 101942、CBS 101943和CBS 101944保藏在CBS。
13.权利要求4到13的任一个所要求保护的黄单胞菌属菌株，其特征在于外多糖是黄原胶。
14.pRPA-BCAT质粒，用于产生权利要求9到13所要求保护的菌株。
15.制备权利要求7到13之任一个所要求保护的菌株的方法，其特征在于通过与含有hrp或hrc基因的全部或部分缺失的质粒进行同源重组来获得该菌株。
16.制备细菌外多糖，尤其是黄原胶的方法，其特征在于将权利要求1到13之任一个所要求保护的细菌菌株，适当地，黄单胞菌属的细菌菌株，优选野油菜黄单胞菌的细菌菌株，在允许于发酵培养基中产生外多糖的条件下进行培养。
17.一种核酸，其特征在于它包含核苷酸序列SEQ ID No.3。
18.一种核酸，其特征在于它包含核苷酸序列SEQ ID No.6。
19.一种核酸，其特征在于它包含核苷酸序列SEQ ID No.7。
全文摘要
本发明涉及通过失活至少一个毒力基因而丧失致植物病性质的细菌菌株,它保持着产生外多糖的能力。
文档编号C12N15/31GK1357043SQ0080932
公开日2002年7月3日 申请日期2000年6月21日 优先权日1999年6月22日
发明者J·皮尔拉德, J－L·西蒙, P·切瓦勒里奥 申请人:罗狄亚化学公司