专利名称：一全合成培养基及其应用方法
技术领域：
本发明涉及一种甲醇营养型毕赤酵母(Methylotrophic yeast Pichia pastoris)培养基及其应用方法。
甲醇营养型毕赤酵母(Methylotrophic yeast Pichia pastoris)已经被公认为外源分泌蛋白和胞内蛋白生产的一优秀的表达系统，并且由于其强劲的生长和一些独特的特性已开发成外源蛋白商业生产的重组表达系统。由于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在酿造上的地位和历史原因，人们对其遗传学和生物学方面了解的比较全面，且其安全性也被人们容易接受，但随着人们对甲醇营养型毕赤酵母的研究，认为该菌在以下方面比酿酒酵母更具优势(1)具有日益成熟的高密度发酵工艺。已经有了大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞密度达到150g(DCW)/L，以及廉价的原料配方。
(2)具有甲醇精确调控的强启动子(PAOX)。它受甘油、乙醇或葡萄糖等碳源的阻遏，而受甲醇的诱导且诱导准确。
(3)外源蛋白分泌的高效率性。为了使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，需要一信号肽序列(Signal Sequence)。最方便的是利用外源蛋白本身的信号序列，但大多数情况下，甲醇营养型毕赤酵母不能有效地识别这些信号肽以指导分泌，而采用了酿酒酵母α交配因子(α-mating factor)前89个氨基酸残基引导或用酸性磷酸酶1(PH01)中21个氨基酸残基的信号肽融合到外源蛋白的N端，均能极有效地指导外源蛋白分泌，还有采用间质金属蛋白酶(NMP)/间质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)信号序列等。据报道用酿酒酵母的交配因子信号序列可使甲醇营养型毕赤酵母分泌人血清蛋白达10g/L的水平。
(4)外源蛋白基因遗传高稳定性。由于外源目的蛋白载体以线性质粒整合到甲醇营养型毕赤酵母染色体上，随染色体的复制而复制，因此外源目的基因在世系传代中异常稳定，不易丢失。
(5)外源目的蛋白的高表达率。甲醇营养型毕赤酵母在甲醇诱导下迅速形成过氧化物酶体(Peroxisome)，它是一种合成储存蛋白质的区域化结构，可使表达的外源蛋白免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害，从而提高了目的蛋白的表达产量。
甲醇加入毕赤酵母的培养基后，能迅速诱导合成大量的醇氧化酶(AlcoholOxidase,AOX)，而AOX的合成在含甘油培养基中生长的细胞中受到抑制。AOX是甲醇利用途径的第一个酶，它催化甲醇氧化成甲酸，进而氧化释放出二氧化碳。
由于AOX与氧的亲和力低，所以毕赤酵母代偿性产生大量的AOX，约占全部可溶性蛋白质的30％。毕赤酵母含有两个醇氧化酶基因，分别为AOX1、AOX2基因(aox1,aox2)，二者的编码序列相似，有92％同源性，其蛋白质产物则有97％的同源性。aox1的蛋白质产物在氧化过程中起主要作用。aox1的转录水平大大高于aox2，且aox1在转录水平上受到严格的双重调控甲醇诱导AOX合成，一般的碳分解代谢产物抑制AOX产生。在碳饥饿状态下，只有在甲醇诱导后，才能启动aox1的信号转录、翻译。
以甲醇诱导强启动子PAOX1而起动基因转录这一特性对于利用毕赤酵母生产外源蛋白是十分重要的。由于重组蛋白对细胞有毒性作用，在大容量、高密度培养过程中，需要将细胞繁殖阶段与表达阶段分开。其它表达系统需极高浓度的抑制物来阻遏表达，诱导前又需将之除去。对于毕赤酵母的生物量增长阶段，只需少量的抑制物，通常为甘油，即可满足细胞生长并有效地抑制外源基因的表达；在表达阶段，只需让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导即可，这样高密度连续培养可以使表达产量提高。
大多数研究者一般使用美国Invitrogen公司提供的方法来进行摇瓶培养诱导外源蛋白的表达，其中含有蛋白胨，YNB等有机复合培养基，与在发酵罐上进行发酵的合成培养基相差甚远，这对采用摇瓶发酵表达外源蛋白优化条件来应用于发酵罐上发酵，其指导意义不大，甚至结果大相径庭。而最近一些研究者采用SM合成培养基，如Kaoru K等培养基(Journ.of Biosci.Bioeng.2000,Vol.89(5),479-484)，来进行摇瓶发酵条件优化研究，其主要缺点是1碳源(甲醇等)一次性加入，当甲醇浓度过高时，造成细胞甲醇中毒，不利于表达；而当甲醇适当时，因碳源不足发酵时间不能足够长，影响摇瓶发酵结果。2其没有采用pH缓冲系统。因为不同的外源蛋白活性要求一定的pH条件，如鼠表皮生长因子(EGF)表达时，要求pH为3.0左右，而重组人血清白蛋白表达的较适pH范围是5.5～6.4。当细胞生长时其pH必定下降，这对目的蛋白的表达是不利的。
为了使在小量培养基中(如摇瓶规模)与大批量发酵(如发酵罐规模)的外源蛋白表达发酵工艺相一致，避免繁琐的重复实验和/或重新的探索试验，小量培养基必须有充足的缓冲能力、保证最大通气量和与大批量发酵培养基相同或极近似的培养基等发酵条件。为此，提供一种新的毕赤酵母培养基是基因工程所十分期望的。
本发明的目的在于公开一种根据在FUS-50(A)多参数全自动发酵罐上对C、N、P、O源等在线检测数据和根据细胞代谢物流平衡的原理、适用于基因工程巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)摇瓶表达外源蛋白的全合成培养基，它既能满足把摇瓶发酵结果放大到发酵罐上的需要，也克服了许多研究者采用Invitrogen Kit提供的与发酵罐发酵不同的复合摇瓶培养基的困难，同时为在摇瓶发酵规模优化表达外源蛋白条件提供了更简单、更有效的方法。
本发明的目的之二在于公开上述培养基在基因工程方面的应用。
本发明的技术构思是这样的(1)通过优化培养基pH值的范围和选择合适的缓冲系统，使蛋白质降解减到最低程度；(2)通过添加充足的碳源、氮源和磷源，以利于外源蛋白的高表达；(3)通过添加充足的无机盐、维生素、生物促进剂等，以利于外源蛋白的高表达；实现本发明目的的技术方案本发明所说的培养基包括碳源、氮源、磷源、无机盐、PTM1和pH缓冲溶液，其含量为碳源0.1-3.0％(v/v)氮源0.1-12g/L磷源磷酸根(PO43-)浓度为0.01-1.0moL/L无机盐 0.002-3.0g/LSO42+0.001-0.4mol/LPTM11-16mL/L
pH缓冲溶液的加入量使培养基的pH保持为2.5-9.0。
所说的碳源为甲醇、甲醇混含山梨醇或甘油等；所说的氮源为(NH4)SO4、NH4Cl、NH4NO3、NH4OH、尿素或CH3COONH4等；所说的磷源为磷酸和磷酸盐，包括磷酸钾、磷酸二氢钾(钠)、磷酸氢二钾(钠)等；所说的无机盐为钙(Ca2+)、镁(Mg2+)、铁(Fe2+,Fe3+)、铜(Cu2+)或锌(Zn2+)的无机盐，如氯化钙、硫酸钙、硫酸镁、氯化镁、氯化(亚)铁、硫酸(亚)铁、硫酸铜、氯化铜、氯化锌或硫酸锌等中的一种或一种以上；所说的SO42+选自硫酸盐，包括硫酸钙、硫酸镁、硫酸(亚)铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸钠、硫酸钾或硫酸等中的一种或一种以上；所说的PTM1是采用Invitrogen公司产品(货号Cat.No.Q300-12或Q300-13其中含有CuSO4,NaI,MnSO4,Na2MoO4,H3BO3,CoCl2,ZnCl2,FeSO4,H2SO4和生物素。
所说的pH缓冲可采用柠檬酸缓冲系统、克拉克-卢勃斯(Clark-Lubs)缓冲液和磷酸盐缓冲系统等。
本发明优选的含量为碳源0.1-4.0％(v/v)，较优为0.1-1.0％；氮源0.1-20g/L，较优为5-10g/L；磷源磷酸根(PO43-)浓度为0.01-2.0moL/L，较优为0.1-1.0moL/L；无机盐 0.002-3.0g/L，较优为0.1-1.5g/L；SO42+0.001-0.5mol/L，较优为0.1-0.1moL/L；PTM11-16mL/L，较优为4-12mL/L；pH缓冲溶液的加入量使培养基的pH保持为3.0-7.5，较优为5.0-7.0。
本发明所说的培养基的制备是一种常规的方法。
本发明的培养基适用于①基因工程甲醇营养型酵母(Methylotrophic yeastPichia pastoris)的不同遗传表型(Mut+His+,MutsHis+等)、不同的启动子(PAOX1、PAOX2)、不同的表达载体(如PIC4.5等)以及载体的不同存在方式(如附加型、整合型等)；②采用PAOX1、PAOX2启动子等的其它基因工程酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等的外源蛋白表达摇瓶培养。
本发明的毕赤酵母适用菌株包括(以下菌株Invitrogen公司均有售或构建方法)(1)NRRL Y-11430-SC5(Mut+)；(2)GS115(his4)或GTS115(3)KM71(his4,aox1::ARG4)；(4)PPF1(his4,arg4)；(5)SMD1163(his4,pep4,prB1)；(6)SMD1165(his4,prB1)；(7)SMD1168(his4,pep4)；(8)其它采用PAOX1或PAOX2启动子构建的基因工程菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等。
毕赤酵母常用表达载体由于毕赤酵母是广泛应用的宿主细胞，至今已构建了许多表达载体来使用，常用表达载体见下表。载体名称克隆位点 选择标记 特点pPIC3 BamHⅠ.NcoⅠSnaBⅠ His4 多克隆位点载体G418EcoRⅠAvrⅢ.NotⅠpPSC3 BamHⅠ.NcoⅠSnaBⅠHis4 Kan 多克隆位点载体，并可EcoRⅠ AvrⅢ.NotⅠ 用选择多拷贝克隆pPSC3 EcoRⅠ His4 His4 KanpHIL-D1 EcoRⅠ His4 原始构建的载体pAO815 EcoRⅠ His4 用于体外构建多拷贝的载体pPIC9 EcoRⅠ AvrⅡXhoⅠSnaBⅠ His4 分泌表达NotⅠpPIC9K XhoⅠ SnaBⅠHis4 Kan 分泌表达和并可用G418EcoRⅠ AvrⅡ NotⅠ 选择多拷贝克隆表达载体构建巴氏毕赤酵母表达载体通常是穿梭质粒(Shuttle plasmid)，典型的表达载体含有醇氧化酶基因(5′AOX1启动子、3′AOX1终止序列、3′AOX1序列)，其中含多克隆位点(如BamHⅠ,NcoⅠ,SnaBⅠ,EcoRⅠ,AvrⅢ,NotⅠ,XhoⅠ等)供外源基因插入；以组氨酸脱氢酶基因(his4)作为互补性筛选标志或其它筛选标记，如eptone,Zeocinr,his6等；如作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322或pUC18、pUC19、pBR329、pKK232-3等)的序列。表达载体转化到酵母宿主系统有二种方式，即附加型(Episome)和整合型(Integration)。附加型的重组质粒存在于细胞质内，则重组质粒在构建时要插入自主复制序列(Autonomous Replication Sequence,ARS)，如大肠杆菌的复制序列(CoIE1 ori)，以利于在酵母胞内自主复制。整合型表达载体中无酵母复制起点，它是靠同源重组整合入酵母染色体DNA中，并随酵母的生长传代稳定地存在。将表达载体用不同的酶切(如BglⅡ、NotⅠ或SalⅠ、StuⅠ等)后线性化，使之整合于酵母基因组中的aox1或his4的位点。整合的方式通常有四种一是双位点互换(Double Cross-over),发生在染色体阿AOX1位点和表达载体的PAOX1及转录终止区，含PAOX1、外源基因和转录终止区的表达单元置换染色体上有完整功能的aox1，产生的菌株表型为MutsHis+(aox1-aox2-)。当酵母的aox1基因被替换而丢失后，就产生了Muts表型(Methanol utilization slow)，此时它们将利用弱的aox2基因启动合成AOX，故在含甲醇的培养基中生长缓慢。二是aox1单位点互换(Single Cross-over)，发生在染色体aox1位点和表达载体的aox1区。外源基因的表达盒插在aox1基因的上游或下游，aox1基因仍然有活性，菌株的表型为Mut+His+(aox1+aox2+)，这种转化子仍然利用甲醇；三是his4单位点置换，发生在染色体his4位点和表达载体的his4位点，使得一个或多个表达盒插入在his4位点，获得的菌株表型是Mut+His+(aox1+aox2+)；四是His4双交换，结果菌株表型为Mut+His+(aox1+aox2+)，不过这种转化子不能被检出而已。
图1为摇瓶诱导表达外源目的蛋白电泳图。
图2为不同甲醇浓度摇瓶培养诱导恶性疟原虫融合抗原电泳图。
本发明根据在FUS-50(A)多参数全自动发酵罐上对C、N、P、O源等在线检测数据和根据细胞代谢物流平衡的原理提出的适用于基因工程巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)摇瓶表达外源蛋白的全合成培养基，既能满足把摇瓶发酵结果放大到发酵罐上的需要，也克服了许多研究者采用Invertogen Kit提供的与发酵罐发酵使用的复合摇瓶培养基的困难，同时为在摇瓶发酵规模优化表达外源蛋白条件提供了更简单、更有效的方法。
实施例1将0.5％甲醇(体积)、150g/L(NH4)2SO4、0.5g/L氯化钙、30g/L硫酸钾(SO42+)、4mL/L PTM1和pH为6.0的磷酸缓冲液置于去离子水中，即获得所说的培养基。
实施例2基因工程巴氏毕赤酵母摇瓶培养表达重组人血清白蛋白1.1菌株巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115 HSA-1菌株，遗传表型为Mut+his+，启动子为PAOX1，表达载体pPIC9K，蛋白信号肽序列为来自酿酒酵母的α-杂交因子AMF，外源基因为人血清白蛋cDNA，载体呈线型整合在染色体上(基因构建方法和重组菌株筛选按有关的克隆手册进行)。1.2摇瓶培养方法以在YPD培养基平板30度培养5至7天的单菌落挑至MGY种子培养基(20mL/250mL三角瓶)中，MGY培养基组分及含量见下表，30℃，220r/min培养22h，OD600约20左右。离心摇瓶生长培养基，弃去上清液，按摇瓶生长培养基体积与本发明全合成培养基之比为1∶1，接入实施例1的全合成培养基(20mL/250mL三角瓶)，30℃,200-220r/min培养120h。每24h补加100％甲醇(A.R)至一定终浓度。放瓶离心后，取上清液进行分析，总蛋白为考马斯亮兰染色法，目的蛋白分析方法为SDS-PAGE凝胶电泳，然后电泳胶经计算机扫描根据电泳带染色强度进行定量分析(GIS-1000数码凝胶图像分析系统，2.0版本，按说明书操作，背景消除按自动进行，低分子标准蛋白为上海丽珠东风生物技术有限公司产品。
MGY种子培养基
注生物素单独过滤除菌，其它混匀后8磅灭菌15分钟。1.3摇瓶诱导表达外源目的蛋白结果从电泳结果(
图1)可明显看出以本发明的全合成摇瓶表达培养基在不同的诱导的时间内目的蛋白即重组人血清白蛋白(rHSA)的表达是十分明显的，在不同的摇瓶培养时间有不同的目的蛋白表达量。虽然从摇瓶培养12小时到72小时均有目的蛋白表达，但不同的目的蛋白(如分子量大小、氨基酸组成以及蛋白质的立体空间结构的不同)就应有不同的摇瓶诱导培养时间，最好为48h-120h。
实施例3基因工程巴氏毕赤酵母摇瓶培养表达恶性疟原虫融合抗原1.1菌种毕赤氏酵母GS115/pfcp菌株，遗传表型为Mut+His-,启动子为PAOX1，重组质粒为pPIC3.5/pfcp，外源蛋白为恶性疟原虫融合cDNA，线性整合在染色体上。1.2摇瓶培养方法同实施例2.1.3摇瓶培养不同甲醇浓度诱导表达恶性疟原虫融合抗原蛋白电泳分析根据本发明的全合成培养基在不同的甲醇诱导浓度摇瓶培养诱导恶性疟原虫融合抗原蛋白，甲醇浓度范围为0.5％-3.0％均有目的蛋表达，但最好的甲醇浓度范围为1.5-2.0％。由甲醇残留浓度和细胞菌浓可知，当甲醇浓度较低时，因甲醇限制了细胞的能量代谢和碳源代谢，而引起目的蛋白表达量不高；当甲醇浓度较高时，有可能是甲醇使细胞代谢有抑制作用，从而导致目的蛋白表达浓度下降。其结果见下表及图2。
不同甲醇浓度摇瓶培养诱导恶件疟原虫融合抗原
权利要求
1．一全合成培养基，其特征在于组分和含量包括碳源0.1-3.0％(v/v)氮源0.1-12g/L磷源(PO43-)浓度为0.01-1.0moL/L无机盐 0.002-3.0g/LSO42+0.001-0.4mol/LPTM11-16mL/LpH缓冲溶液的加入量使培养基的pH保持为2.5-9.0；所说的无机盐为钙(Ca2+)、镁(Mg2+)、铁(Fe2+,Fe3+)、铜(Cu2+)或锌(Zn2+)的无机盐；所说的SO42+选自硫酸盐或硫酸；所说的PTM1为Invitrogen公司产品货号Cat.No.Q300-12或Q300-13。
2．如权利要求1所述的培养基，其特征在于，组分和含量包括碳源0.1-1.0％；氮源5-10g/L；磷源0.1-1.0moL/L；无机盐 0.1-1.5g/L；SO42+0.1-0.1moL/L；PTM14-12mL/L；pH缓冲溶液的加入量使培养基的pH保持为3.0-7.5。
3．如权利要求2所述的培养基，其特征在于，组分和含量包括碳源0.1-1.0％；氮源5-10g/L；磷源0.1-1.0moL/L；无机盐 0.1-1.5g/L；SO42+0.1-0.1moL/L；PTM14-12mL/L。pH缓冲溶液的加入量使培养基的pH保持为5.0-7.0。
4．如权利要求1、2或3任一所述的培养基，其特征在于所说的碳源为甲醇、甲醇混含山梨醇或甘油；所说的氮源为(NH4)SO4、NH4Cl、NH4NO3、NH4OH、尿素或CH3COONH4；所说的磷源为磷酸或磷酸盐；所说的无机盐为氯化钙、硫酸钙、硫酸镁、氯化镁、氯化(亚)铁、硫酸(亚)铁、硫酸铜、氯化铜、氯化锌或硫酸锌等中的一种或一种以上；所说的SO42+选自硫酸钙、硫酸镁、硫酸(亚)铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸钠或硫酸钾中的一种或一种以上；所说的pH缓冲系统可采用柠檬酸缓冲系统、克拉克-卢勃斯(Clark-Lubs)缓冲液和磷酸盐缓冲系统。
5．如权利要求4所述的培养基，其特征在于，磷酸盐为磷酸钾、磷酸二氢钾(钠)或磷酸氢二钾(钠)。
6．如权利要求1～3任一所述的培养基的应用，其特征在于，可用于基因工程甲醇营养型酵母或采用PAOX1、PAOX2启动子的基因工程酵母的外源蛋白表达摇瓶培养。
7．如权利要求4所述的培养基的应用，其特征在于，可用于基因工程甲醇营养型酵母或采用PAOX1、PAOX2启动子的基因工程酵母的外源蛋白表达摇瓶培养。
8．如权利要求5所述的培养基的应用，其特征在于，可用于基因工程甲醇营养型酵母或采用PAOX1、PAOX2启动子的基因工程酵母的外源蛋白表达摇瓶培养。
全文摘要
本发明公开了一种一全合成培养基及其应用方法。本发明根据在FUS－50(A)多参数全自动发酵罐上对C、N、P、O源等在线检测数据和根据细胞代谢物流平衡的原理,通过优化培养基pH值的范围和选择合适的缓冲系统、通过添加充足的碳源、氮源和磷源、通过添加充足的无机盐、维生素、生物促进剂等方法以利于外源蛋白的高表达的适用于基因工程巴氏毕赤酵母摇瓶表达外源蛋白的全合成培养基,为摇瓶发酵规模优化表达外源蛋白条件提供了更简单、更有效的方法。
文档编号C12N15/81GK1309178SQ01105699
公开日2001年8月22日 申请日期2001年3月20日 优先权日2001年3月20日
发明者张嗣良, 郭美锦, 储炬, 庄英萍, 杭海峰 申请人:华东理工大学