专利名称：碱性磷酸酶在酵母中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组生产和表达真核碱性磷酸酶的方法。本发明还涉及密码子优化的DNA，其编码比活性在3000U/mg以上的高活性真核碱性磷酸酶。另外，本发明也涉及将DNA插入在酵母细胞中表达的载体中的方法。
背景技术：
碱性磷酸酶(AP)是二聚体、含锌的非特异性磷酸单酯酶，在诸如大肠杆菌和哺乳动物的原核及真核生物中均存在(McComb et al.，《碱性磷酸酶》Plenum Press，New York)。多种碱性磷酸酶的一级结构比较显示了高度同源性(大肠杆菌和哺乳动物AP间的同源性为25-30％；Millan，1988 Anticancer Res.8，995-1004；Harris，1989 Clin.Chim.Acta 186，133-150)。
在人和高等动物中，AP家族包括位于不同基因座的四个成员(Millan，1988 Anticancer Res.8，995-1004；Harris 1989 Clin.Chim.Acta186，133-150)。碱性磷酸酶家族包括组织特异性AP(胎盘AP(PLAP)，生殖细胞AP(GCAP)和肠AP(IAP))和主要位于肝脏、肾脏和骨骼的非组织特异性AP(TnAP)。
已知的AP的一个决定性的特征是哺乳动物AP催化活性的高可变性，其kcat值高于大肠杆菌AP的10到100倍。在哺乳动物AP中，来自牛肠(bIAP)的AP具有最高的比活性。该特性使得bIAP对于生化应用颇具吸引力，如使用相应的酶辍合物作为诊断试剂，或使DNA脱磷酸化。在EP0955369和Manes等(Manes et al.(1998)，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)的文章中报导，存在各种具有不同比活性的牛肠碱性磷酸酶。目前，重组表达低活性(最高3000U/mg)真核碱性磷酸酶已经在CHO细胞(bIAP I/WO 93/18139；Weissig et al.1993，Biochem.J.260，503-508)和COS细胞(人胎盘AP/Berger et a.，1987，Biochemistry 84，4885-4889)等多种真核细胞系或杆状病毒表达系统(人胎盘AP/Davis et al.1992，Biotechnology 10，1149-1150)中实现。在CHO细胞中表达更高活性牛肠AP(比活性大于3000U/mg)也有报导(bIAPII，III和IV/Manes et al.1998，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)。但是，在这些表达系统中表达碱性磷酸酶的缺点是低表达量，这使得重组生产高活性AP尤为不经济。
尽管，从理论上说，可以在大肠杆菌等原核宿主中表达真核碱性磷酸酶(人胎盘AP/Beck and Burtscher，1994蛋白表达和纯化5，192-197)，但在原核生物中表达的碱性磷酸酶没有糖基化，而这对制备酶辍合物尤为重要。
发明内容
因此，本发明的目的是发展一种高效稳定的表达方法，用以生产具有高比活性的糖基化真核碱性磷酸酶，由于该方法的表达量高，可以经济地生产这种碱性磷酸酶，并且产生比活性和热稳定性等特性与天然高活性或低活性碱性磷酸酶(可向Roche Diagnostics GmbH，Biozyme，Oriental Yeast等商购)相当的酶。
本发明的目的通过在酵母特别是甲基营养型酵母中生产高比活性真核碱性磷酸酶的方法得以实现，该方法包括如下步骤a)克隆一种基因序列进入不同的载体b)转化酵母c)表达，以及d)纯化碱性磷酸酶，其特征在于(i)第一载体具有针对第一选择标记的抗性基因，(ii)抗性基因和基因序列已经整合到基因组的转化子通过在含有低浓度第一选择标记的营养培养基中生长来选择，(iii)基因拷贝数通过多重转化增加，其中多重转化子通过在选择压力增加的营养培养基中生长来选择，(iv)加入除基因序列外还有针对第二选择标记的抗性基因的第二载体，(v)基因拷贝数通过第二载体的多重转化增加，其中多重转化子通过在选择压力增加的营养培养基中生长来选择，
(vi)选择几个拷贝的基因序列和选择标记抗性基因已经以稳定方式整合进基因组的克隆。
优选的基因序列是编码比活性超过3000U/mg、特殊情况下超过7000U/mg到约10000U/mg的真核碱性磷酸酶的DNA序列。例如，已经证实SEQ ID NO1的DNA序列适合用于本发明。在氨基酸水平上相应于SEQ ID NO1的密码子优化的DNA序列是特别优选的。密码子优化是指SEQ ID NO1的每个密码子已经通过静默突变优化，根据选定表达宿主增加翻译，从而产生SEQ ID NO5的序列，静默突变是指DNA水平改变但氨基酸水平没有改变。但是，也可以将与SEQ IDNO1不同、编码碱性磷酸酶的序列插入载体，所述序列可选地是密码子优化的，如bIAPI，III，IV(DE 198 19 962和EP 0 955 369)。本发明的方法特别优选使用SEQ ID NO5的密码子优化的基因序列。相应基因序列然后被克隆进一个或几个载体，载体根据待转化的宿主选择。
甲基营养型酵母如巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母以及其它酵母如酿酒酵母、Yarrowia lipolytica或粟酒裂殖酵母特别适合作为酵母宿主。合适的载体对本领域技术人员是已知的，如pPICZαA，pIIC9K，Yes载体，pTEF1/Zeo，pYDI(如Invitrogen)。优选以此方式形成的表达载体以稳定方式转化进巴斯德毕赤酵母的各种菌株并整合进基因组。稳定整合进酵母基因组的优势在于在随后大体积发酵生产例如真核高活性碱性磷酸酶时无需选择压力。稳定整合进基因组是指表达载体通过同源重组等插入例如巴斯德毕赤酵母的基因组中，从而作为永久性成分通过遗传代代相传(Cregg，J.M.et al.，Mol.Cell.Biol.5(1985)，3376-3385)。
基因拷贝数在甲基营养型酵母中通过多重转化增加，同时以合适的选择标记如Zeocin或遗传霉素(G418)或营养缺陷型标记增加选择压力，然后，只有几个拷贝的表达载体稳定整合进基因组的克隆可以存活。要对较高浓度的用作选择标记的抗生素有抗性，该克隆必须产生更多的抗性蛋白。这可以通过表达载体的多重整合实现，所述表达载体含有高活性碱性磷酸酶表达盒和用作选择标记的抗生素的抗性基因。
以具有高表达量的高效稳定的表达方法经济地生产真核碱性磷酸酶的目的只有同时采取(i)到(vi)的措施才可实现。因此，不采取这些措施用含有SEQ ID NO1的bIAPII基因的表达载体转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33(见实施例1和2)不会得到所需的结果。尽管该方法使得表达量相对于在CHO细胞中表达bIAPII(Manes et al.，1998，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)有显著增加，但该方法仍无法经济地生产重组碱性磷酸酶。
本发明的方法的一个必需措施是合成密码子优化的基因序列。为了优化酵母中表达的每个密码子，需要全部从头合成编码高活性真核碱性磷酸酶的约1.5kbp长的基因。可以通过重新翻译SEQ ID NO4的高活性真核碱性磷酸酶(bIAP-II)的氨基酸序列并使用简并密码优化需要优化的每个密码子。为此目的，该基因被分成长度为54到82个核苷酸的28个寡核苷酸。寡核苷酸被设计成5′和3′末端彼此以互补方式与相邻寡核苷酸重叠的有义链和反义链片段的交替序列。各例中重叠区域经过选择，使得在随后的PCR反应中退火过程中非特异性结合大部分被阻止。基因5′和3′末端的寡核苷酸有编码区上游和下游的限制性内切酶的识别位点，它可以用于随后将SEQ ID NO5的合成基因插入表达载体中。因此，限制性内切酶EcoRI的识别位点插入上游，限制性内切酶Asp718的识别位点插入下游。寡核苷酸序列示于SEQ ID NO6到33。
基因合成通过PCR反应进行。为此目的，编码区首先被分成3个区段(寡核苷酸6到15，16到23、24到33)，这些区段在独立的PCR反应中产生。在使用重叠互补寡核苷酸通过PCR反应进行基因合成时，基因片段逐步延长，以形成全长产物，在随后的循环中该产物再扩增。该方法中的退火温度取决于融解温度最低的重叠区。
3个区段然后通过琼脂糖凝胶电泳分析，具有预期长度的产物通过QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离，在随后的PCR反应中合成，以形成完整的基因产物。在该方法中，前5个循环的PCR反应中不加入完整基因的5′和3′末端引物，使得只有一些具有预期长度的基因产物的片段首先从3个区段形成。退火温度取决于融解温度最低的重叠区。随后，加入终末引物，相应于融解温度最低的引物的退火温度增加退火温度。具有预期长度的基因片段在随后的25个循环中高度扩增。
PCR混合物通过琼脂糖凝胶电泳分析，分离出具有预期到大小的基因片段(QIAquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)。
这种PCR片段的克隆、转化进巴斯德毕赤酵母和表达如实施例3所述。
高活性碱性磷酸酶的密码子优化的基因使得表达量相对于以野生型基因进行的第一次实验增加了3倍。
但是，这些克隆并未提供生产高活性碱性磷酸酶的经济方法。
增加巴斯德笔触毕赤酵母中异源和同源蛋白的表达量的一个措施是通过多重转化增加细胞中的基因拷贝数。该措施可增加靶基因的转录产物即mRNA。基因拷贝数通过含有表达载体的克隆的多重转化同时在随后转化子在含有浓度更高的用作选择标记的抗生素的营养平板上生长时增加选择压力而增加。在该方法中，由第一轮转化中获得了至少一个拷贝的表达载体的表达克隆再次成为感受态(见实施例1)，再次用表达载体转化。通过涂布于含有更高浓度选择压力的营养平板即含有比第一轮转化更高浓度的作为选择标记的抗生素(如Zeocin)的平板上来选择已经有几个拷贝的表达载体整合进基因组的转化子。为此，确定由第一轮转化获得的克隆仍能生长的作为选择标记的抗生素的最高浓度，再次转化后，YPDS琼脂平板中作为选择标记的抗生素的浓度相应增加到高于确定的阈值。增加表达载体的拷贝数也同时增加了作为表达载体一种成分的抗性基因的拷贝数，因此也增加了对更高浓度作为选择标记的抗生素的抗性。也可以通过改变营养平板中作为选择标记的抗生素的浓度来选择基因组中含有不同拷贝数表达载体的克隆(约100到2000μg/ml，见实施例4)。
另一个可以用来增加巴斯德毕赤酵母等酵母中的异源和同源蛋白的表达量的措施时通过多重选择来增加基因拷贝数。为此，已经通过含有靶基因表达盒(例如SEQ ID NO5的编码高活性碱性磷酸酶的基因)和用作选择标记的第一种抗生素(如Zeocin)的抗性基因的表达载体的多重转化优化的表达克隆用第二种表达载体转化，第二种载体含有靶基因(例如SEQ ID NO5的编码高活性碱性磷酸酶的基因)和用作选择标记的第二种抗生素(如遗传霉素(G418))的抗性基因。当转化子随后在含有用作选择标记的第二种抗生素的异源平板上铺平板时，选择出来的克隆除了含有用作选择标记的第一种抗生素的抗性基因的表达载体的拷贝外，也获得了至少一个拷贝含有作为选择标记的第二种抗生素的抗性基因的表达载体。这些表达克隆然后就可以用含有作为选择标记的第二种抗生素的抗性基因的表达载体进一步进行多重转化(见实施例5)。
通过综合多重转化和双重选择，可以使表达量相对于含有密码子优化基因的第一轮转化克隆增加4倍。
重组进行磷酸酶可以通过本领域技术人员已知的提取方法由生物体中提取，提取方法例见《蛋白纯化》，Springer Verlag，编辑RobertScopes(1982)。比活性大于7000U/mg的纯化带产物通过色谱分离方法获得，特别是使用疏水柱材料和阳离子交换剂的方法。
纯化产物进行N末端测序，以鉴定重组的高活性碱性磷酸酶。
确定的主要序列是EAEAEFLIPA(SEQ ID NO36)。该序列明显与AP＂LIPA＂(SEQ ID NO37)的N末端序列和构建体EAEAEF连接肽(SEQ ID NO38)有关，所述构建体是通过克隆基因序列至载体中的策略和通过Kex2信号肽酶(如Invitrogen)切割α因子信号肽而形成。
重组碱性磷酸酶产物的稳定性与天然碱性磷酸酶进行比较。当溶液经受热胁迫时(55℃)，样品产生相当的结果。
因此，本发明首次公开了一种方法，它可以由哺乳动物细胞如牛肠经济地生产重组碱性磷酸酶，所述重组酶具有与来自牛肠的天然高活性碱性磷酸酶相当的特性，并被糖基化。
本发明也涉及SEQ ID NO5的DNA序列，其用作在巴斯德毕赤酵母中表达高活性碱性磷酸酶基因的密码子优化基因序列。
本发明的另一个主题是含有SEQ ID NO5的载体，特别优选的是图2的pHAP10-3载体。pHAP10-3载体时可商购的载体pPICZαA，含有AOX1启动子控制下的SEQ ID NO5的本发明基因。
本发明的另一个主题是已用本发明的载体转化的宿主菌株。特别优选的是用载体pHAP10-3转化的巴斯德毕赤酵母X-33菌株。
另一种优选的载体是含有来自pHAP10-3的整个表达盒的载体，它基本上含有AOX1启动子；来自酿酒酵母的α因子的信号肽，它以正确的读框克隆在信号肽之后；SEQ ID NO5的密码子优化的靶基因，它编码高活性碱性磷酸酶；以及AOX1转录终止区(见图3)。载体pHAP10-3/9K是特别优选的，它含有可商购的载体pPIC9K(Invitrogen)和来自pHAP10-3的表达盒，包括SEQ ID NO5的合成基因。
载体pHAP10-3和pHAP10-3/9K同等相关，因为最终生产克隆含有两个载体的拷贝。
本发明的另一个主题是已经用pHAP10-3/9K载体转化的宿主菌株。但是，本领域技术人员已知的其它载体和宿主对本发明也是合适的，如YES载体、pYD1、pTEF1/ZEO(Invitrogen)和酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、多形汉逊酵母、Yarrowia lipolytica，特别是巴斯德毕赤酵母X-33。本发明特别优选用载体pHAP10-3/9K转化的巴斯德毕赤酵母X-33菌株。
因此，本发明的另一个主题是生产高活性真核碱性磷酸酶的方法，通过在已经用本发明的一个或几个载体特别是用pHAP 10-3或pHAP10-3/9K载体转化的宿主菌株表达蛋白来生产。已经用本发明的载体转化的巴斯德毕赤酵母菌株对本发明的方法是特别优选的。已经用pHAP10-3和pHAP10-3/9K载体转化的巴斯德毕赤酵母菌株X-33尤为优选。
图1在pICZαA(Invitrogen)中含有bIAPII基因的表达载体pHAP1的质粒图。
图2在pPIC9K(Invitrogen)中含有合成基因的表达载体pHAP10-3的质粒图。
图3在pPIC9K(Invitrogen)中含有合成基因的表达载体pHAP10-3/9K的质粒图。
缩写YPD酵母蛋白胨葡萄糖YPDS酵母蛋白胨葡萄糖山梨糖醇BMGY缓冲甘油复合培养基BMMY缓冲甲醇复合培养基
具体实施例方式
实施例1克隆bIAPII基因首先在SEQ ID NO1的bIAPII基因(EP 0955 369；Manes et al.，1989，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)的上游和下游提供限制性内切酶切割位点，该切割位点适合用于通过PCR和选择SEQ ID NO2和3的合适引物克隆进巴斯德毕赤酵母表达载体。因此，EcoRI限制性内切酶切割位点连接在上游，Asp718I限制性内切酶切割位点连接在下游。
PCR片段用EcoRI和Asp718I(Roche Diagnostics GmbH)重新切割，再次分离(QIAquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)，然后再连接至已经用EcoRI和Asp718I(Roche Diagnostics GmbH)线性化的表达载体pPICZαA(Invitrogen)的载体片段，并分离(QIAquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)。在该载体中，bIAPII基因处于AOX1(巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1启动子，可以用甲醇诱导)启动子控制之下，并以正确的读框克隆在酿酒酵母α因子信号肽之后。然后，通过限制性内切酶分析和测序分析以此方式插入的基因片段是否无误。以此方式形成的含有编码高活性真核碱性磷酸酶的bIAPII基因的表达载体被称为pHAP-1(见图1)。
在巴斯德毕赤酵母中pHAP-1的转化为了在巴斯德毕赤酵母X-33中转化pHAP-1并随后整合进基因组中，载体首先用SacI(Roche Diagnostics GmbH)线性化。转化使用GenePulserII(Biorad)通过电穿孔进行。
将5毫升YPD培养基(Invitorgen)中接种巴斯德毕赤酵母野生型菌株菌落，30℃振荡温育过夜。然后用过夜培养物以1∶2000接种200毫升新鲜YPD培养基(Invitrogen)，30℃振荡温育过夜，直至OD600达到1-3到1.5。将细胞离心(1500×g/5分钟)，沉淀重悬于200毫升冰冷无菌水中(0℃)。细胞再次离心(1500×g/5分钟)，重悬于100毫升冰冷无菌水中(0℃)。细胞再次离心并重悬于10毫升冰冷(0℃)的1M山梨糖醇(ICN)中。以此方式获得的细胞保持在冰上，立即用于转化。
约1μg线性化pHAP-1载体DNA加入80μl细胞，将整个混合物转移到冰冷(0℃)的电穿孔池中，冰上温育5分钟。随后，将电穿孔池转移到Gene PulserII(Biorad)中，在1kV/1kΩ/25μF下进行转化。电穿孔后，将1毫升1M山梨糖醇(ICN)加入混合物，然后取100到150μl涂布于含有100μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS琼脂平板(Invitrogen)上。平板然后在30℃温育2-4天。
Raster MD(基本葡萄糖)平板用克隆接种，然后进一步进行分析。选出生长的克隆，重悬于20μl无菌水中，用17.5U溶细胞酶(RocheDiagnostics GmbH)(1h，37℃)裂解，通过PCR直接检查bIAPII表达盒是否正确整合。
转化过程中完整表达盒整合进基因组的克隆用于表达实验。
高活性碱性磷酸酶的表达3ml BMGY培养基(Invitrogen)用阳性克隆接种，30℃振荡温育过夜。随后，在600nm处确定OD，转接10毫升BMMY培养基(Invitrogen)使其OD600为1。BMMY培养基(Invitrogen)含有甲醇(Mallinckrodt BakerB.V.)，它通过AOX1启动子诱导高活性碱性磷酸酶的表达。
摇瓶30℃振荡温育，每24小时取样，确定OD600，测定高活性碱性磷酸酶的表达活性，加入0.5％甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)进行进一步诱导。表达实验进行96小时。
实施例2高活性碱性磷酸酶活性测定取出500μl实施例1的表达混合物，确定OD600，将细胞离心。储存上清，细胞沉淀重悬，以相应于OD600的一定量Y-PERTM(50到300μl/Pierce)裂解，室温振荡1小时。随后，裂解物离心除去细胞沉淀(15000×g/5分钟)，上清转移到新鲜反应容器中。5μl裂解物用于活性检测。
活性检测的原理如下测定405纳米的吸光度增加值。
50μl 4-硝基苯磷酸溶液(0.67mol/14-硝基苯磷酸，钠盐(RocheDiagnostics GmbH))加入至3毫升二乙醇胺缓冲液(1mol/l二乙醇胺(Merck)pH9.8，0.5mmol/1 MgCl2(Riedelde Haen))，混合物于37℃温育。然后加入5μl裂解物起始反应，持续3分钟测定37℃吸光度变化，由此计算ΔA/min。
根据下式计算活性 ε＝18.2[1×mmol-1×cm-1]因子X＝细胞裂解后浓度因子表达培养物培养基上清的活性以类似方式确定。这种情况下反应也通过加入5μl上清起始，另外还加入0.5mM Zncl2。计算时不考虑因子X。
实施例3克隆基因合成的PCR片段用EcoRI和Asp718(Roche Diagnostics GmbH)再次切割PCR片段，再次分离(QIAquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)，然后连接至已用EcoRI和Asp718(Roche Diagnostics GmbH)线性化处理的表达载体pPICZαA(Invitrogen)的载体片段，再分离(QIAquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)。在此载体中，合成基因处于AOX1启动子(巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1启动子，可用甲醇诱导，Malinckrodt Baker B.V.)控制之下，以正确的读框克隆在酿酒酵母α因子的信号肽之后。然后通过限制性分析和测序检查以此方式插入的基因片段是否无误。以此方式形成的含有编码高活性真核碱性磷酸酶的合成基因的表达载体被称为pHAP10-3(见图2)。
在巴斯德毕赤酵母中pHAP10-3的转化为了在巴斯德毕赤酵母中进行pHAP10-3的转化并整合进基因组中，载体首先用SacI(Roche Diagnostics GmbH)线性化处理。使用GenePulser II(Biorad)通过电穿孔进行转化。将5毫升YPD培养基(Invitrogen)接种巴斯德毕赤酵母菌落，30℃振荡温育过夜。然后用过夜培养物以1∶2000转接200毫升新鲜YPD培养基(Invitrogen)，30℃振荡温育过夜，直至OD600达到1.3到1.5。将细胞离心(1500×g/5分钟)，沉淀重悬于200毫升冰冷无菌水中(0℃)。细胞再次离心(1500×g/5分钟)，重悬于100毫升冰冷无菌水中(0℃)。细胞再次离心并重悬于10毫升冰冷(0℃)的1M山梨糖醇(ICN)中。以此方式获得的细胞保持在冰上，立即用于转化。
约1μg线性化pHAP10-3载体DNA加入80μl细胞，将整个混合物转移到冰冷(0℃)的电穿孔池中，冰上温育5分钟。随后，将电穿孔池转移到Gene PulserII(Biorad)中，在1kV/1kΩ/25μF下进行转化。电穿孔后，将1毫升1M山梨糖醇(ICN)加入混合物，然后取100到150μl涂布于含有100μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS琼脂平板(Invitrogen)上。平板然后在30℃温育2-4天。
Raster MD(基本葡萄糖)平板用克隆接种，然后进一步进行分析。选出生长的克隆，重悬于20μl无菌水中，用17.5U溶细胞酶(RocheDiagnostics GmbH)(1h，37℃)裂解，通过PCR直接检查合成AP表达盒是否正确整合。
转化过程中完整表达盒整合进基因组的克隆用于表达实验。
高活性碱性磷酸酶的表达3ml BMGY培养基(Invitrogen)用阳性克隆接种，30℃振荡温育过夜。随后，在600nm处确定OD，转接10毫升BMMY培养基(Invitrogen)使其OD600为1。BMMY培养基(Invitrogen)含有甲醇(Mallinckrodt BakerB.V.)，它通过AOX1启动子诱导高活性碱性磷酸酶的表达。
摇瓶30℃振荡温育，每24小时取样，确定OD600，测定高活性碱性磷酸酶的表达活性，加入0.5％甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)进行进一步诱导。表达实验进行96小时。
高活性碱性磷酸酶活性测定取出500μl表达混合物，确定OD600，将细胞离心。储存上清，细胞沉淀重悬，以相应于OD600的一定量Y-PERTM(50到300μl/Pierce)裂解，室温振荡1小时。随后，裂解物离心除去细胞沉淀(15000×g/5分钟)，上清转移到新鲜反应容器中。5μl裂解物用于活性检测。
活性检测如上所述进行。
实施例4
通过多重转化增加表达量制备表达实验的最佳克隆用于如上所述的外推法，并以1μg线性化pHAP10-3载体DNA再次转化，转化混合物涂布于含有1000到2000μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS琼脂平板(Invitrogen)上。结果，选择压力增加，使得只有基因组中整合了几个拷贝的表达载体pHAP10-3因而也有几个拷贝的相应抗性基因(本例中为Zeocin)的克隆才能生长。Zeocin抗性蛋白是印度斯坦链异壁菌的博来霉素基因产物(Chalmels，T.et al.，Curr.Genet.20(1991)，309-314；Drocourt，D.et al.，Nucleic Acid Research 18(1990)，4009)，它以化学计量浓度比结合Zeocin，因此使细胞对Zeocin有抗性。YPDS琼脂平板中Zeocin的浓度越高，为了定量结合Zeocin从而能够生长，细胞需要产生更多的抗性蛋白。例如当多个拷贝的抗性基因整合进基因组时，这就有可能。如上所述，光栅(raster)MD平板用克隆转接，如上所述通过PCR分析再次检查haAP表达盒是否正确整合。随后，这些克隆如上所述测定haAP活性。
实施例5通过使用第二种选择压力增加表达量增加Zeocin浓度到高于2000μg/ml不会导致高活性进行磷酸酶的表达量增加。为了进一步增加表达克隆中SEQ ID NO5的基因的拷贝数，通过第二种选择压力(优选为G418(Roche Diagnostics GmbH)由实施例3和4产生的克隆中选择有其它表达载体整合进基因组、表达量最高的克隆，所述SEQ ID NO5的基因编码高活性进行磷酸酶，为在酵母中表达已经过密码子优化。为此，来自pHAP10-3的完整表达盒被克隆进载体pIC9K，通过G418(Roche Diagnostics GmbH)选择该载体整合进基因组中的克隆，所述pHAP10-3表达盒包括AOX1启动子、酿酒酵母α因子的信号肽、SEQ ID NO5的高活性碱性磷酸酶的密码子优化的基因、和如下所述使用合适的引物通过PCR分离的AOX1转录终止区。引物示于SEQ ID NO34和35。
PCR混合物通过琼脂糖凝胶电泳分析，分离具有预期大小的基因片段(QIAquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)，用SacI和NotI(RocheDiagnostics GmbH)再次切割，然后再从琼脂糖凝胶中分离(QIAquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)，连接至由pIC9K分离的、已经用SacI/NotI(Roche Diagnostics GmbH)线性化的载体片段。这确保来自pHAP10-3的完整表达盒以pPIC9K的相同形式存在。通过限制性分析和旁侧区测序检查插入的片段。以此方式形成的表达载体被称为pHAP10-3/9K(见图3)。
如上所述制备来自pHAP10-3(Zeocin抗性)的多重转化、具有最高haAP表达量的克隆用于电穿孔，如上所述用来自SacI(RocheDiagnostics GmbH)线性化处理的pHAP10-3/9K的载体片段1μg转化。转化混合物随后在4℃下在1M山梨糖醇(ICN)中储存1到3天(以形成G418抗性)，取100到200μl涂布于含有1、2和4mg/ml G418(Roche Diagnostics GmbH)的YPD平板(Invitrogen)上，30℃温育3到5天。如上所述通过活性检测再次检查所得克隆的高活性真核碱性磷酸酶的表达增加。
序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<120>碱性磷酸酶在酵母中的表达<130>5387/00/<140><141><160>38<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1476<212>DNA<213>牛<400>1gaattcctca tcccagctga ggaggaaaac cccgccttct ggaaccgcca ggcagcccag 60gcccttgatg tagccaagaa gttgcagccg atccagacag ctgccaagaa tgtcatcctc 120ttcttggggg atgggatggg ggtgcctacg gtgacagcca ctcggatcct aaaggggcag 180atgaatggca aactgggacc tgagacaccc ctggccatgg accagttccc atacgtggct 240ctgtccaaga catacaacgt ggacagacag gtgccagaca gcgcaggcac tgccactgcc 300tacctgtgtg gggtcaaggg caactacaga accatcggtg taagtgcagc cgcccgctac 360aatcagtgca acacgacacg tgggaatgag gtcacgtctg tgatcaaccg ggccaagaaa 420gcagggaagg ccgtgggagt ggtgaccacc accagggtgc agcatgcctc cccagccggg 480gcctacgcgc acacggtgaa ccgaaactgg tactcagacg ccgacctgcc tgctgatgca 540cagaagaatg gctgccagga catcgccgca cagctggtct acaacatgga tattgacgtg 600atcctgggtg gaggccgaat gtacatgttt cctgagggga ccccagaccc tgaataccca 660gatgatgcca gtgtgaatgg agtccggaag gacaagcaga acctggtgca ggaatggcag 720gccaagcacc agggagccca gtatgtgtgg aaccgcactg cgctccttca ggcggccgat 780gactccagtg taacacacct catgggcctc tttgagccgg cagacatgaa gtataatgtt 840cagcaagacc acaccaagga cccgaccctg gcggagatga cggaggcggc cctgcaagtg 900ctgagcagga acccccgggg cttctacctc ttcgtggagg gaggccgcat tgaccacggt 960caccatgacg gcaaagctta tatggcactg actgaggcga tcatgtttga caatgccatc 1020gccaaggcta acgagctcac tagcgaactg gacacgctga tccttgtcac tgcagaccac 1080tcccatgtct tctcttttgg tggctacaca ctgcgtggga cctccatttt cggtctggcc 1140cccggcaagg ccttagacag caagtcctac acctccatcc tctatggcaa tggcccaggc 1200tatgcgcttg gcgggggctc gaggcccgat gttaatggca gcacaagcga ggaaccctca 1260taccggcagc aggcggccgt gcccctggct agcgagaccc acgggggcga agacgtggcg 1320gtgttcgcgc gaggcccgca ggcgcacctg gtgcacggcg tgcaggagga gaccttcgtg 1380gcgcacatca tggcctttgc gggctgcgtg gagccctaca ccgactgcaa tctgccagcc 1440cccgccaccg ccaccagcat ccccgactag ggtacc 1476<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人工的<400>2gcgcgaattc ctcatcccag ctgaggagga aaaccccgcc 40<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人工的<400>3cgcgggtacc ctagtcgggg atgctggtgg cggtgg 36<210>4<211>487<212>PRT<213>牛<400>4Leu Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn Arg Gln Ala1 5 10 15Ala Gln Ala Leu Asp Val Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile Gln Thr Ala20 25 30Ala Lys Asn Val Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Pro Thr35 40 45Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Met Asn Gly Lys Leu Gly50 55 60Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Gln Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser65 70 75 80Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala85 90 95Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr Arg Thr Ile Gly Val100 105 110Ser Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu
115 120 125Val Thr Ser Val Ile Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ala Val Gly130 135 140Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Ala Tyr145 150 155 160Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Leu Pro Ala165 170 175Asp Ala Gln Lys Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala Ala Gln Leu Val Tyr180 185 190Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Met Tyr Met Phe195 200 205Pro Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Ala Ser Val Asn210 215 220Gly Val Arg Lys Asp Lys Gln Asn Leu Val Gln Glu Trp Gln Ala Lys225 230 235 240His Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr Ala Leu Leu Gln Ala245 250 255Ala Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Ala260 265 270Asp Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr Lys Asp Pro Thr Leu275 280 285Ala Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Pro Arg290 295 300Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His305 310 315 320Asp Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Glu Ala Ile Met Phe Asp Asn325 330 335Ala Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile340 345 350Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Thr355 360 365Leu Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Leu Asp370 375 380Ser Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Ala385 390 395 400Leu Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Gly Ser Thr Ser Glu Glu405 410 415Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ala Ser Glu Thr His420 425 430Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu435 440 445Val His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala His Ile Met Ala Phe450 455 460Ala Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn Leu Pro Ala Pro Ala465 470 475 480Thr Ala Thr Ser Ile Pro Asp485<210>5<211>1476<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人工的<400>5gaattcttga ttccagctga agaagaaaat ccagcttttt ggaatagaca agctgctcaa 60gctttggatg ttgctaagaa gttgcaacca attcaaactg ctgctaagaa tgttattttg 120tttttgggtg atggtatggg tgttccaact gttactgcta ctagaatttt gaagggtcaa 180atgaatggta agttgggtcc agaaactcca ttggctatgg 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1080agtcatgttt tttcttttgg tggttacact ttgagaggta cttctatttt tggtttggct 1140ccaggtaagg ctttggatag taagtcttac acttctattt tgtatggtaa tggtccaggt 1200tatgctttgg gtggtggttc tagaccagat gttaatggta gtactagtga agaaccatct 1260tacagacaac aagctgctgt tccattggct agtgaaactc atggtggtga agatgttgct 1320gtttttgcta gaggtccaca agctcatttg gttcatggtg ttcaagaaga aacttttgtt 1380gctcatatta tggcttttgc tggttgtgtt gaaccataca ctgattgtaa tttgccagct 1440ccagctactg ctactagtat tccagattaa ggtacc 1476<210>6<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人工的<400>6gcgcgaattc ttgattccag ctgaagaaga aaatccagct ttttggaata gacaagctgc 60tcaagctttg gatgttgc78<210>7<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人工的<400>7ccaaaaacaa aataacattc ttagcagcag tttgaattgg ttgcaacttc ttagcaacat 60ccaaagcttg 70<210>8<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人工的<400>8gaatgttatt ttgtttttgg gtgatggtat gggtgttcca actgttactg ctactagaat 60tttgaaggg 69<210>9<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人工的<400>9ggaaattgat ccatagccaa tggagtttct ggacccaact taccattcat 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1.在酵母细胞中生产真核碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤a)克隆一种基因序列进入不同的载体，b)转化酵母，c)表达，以及d)纯化碱性磷酸酶，其中-第一载体具有针对第一选择标记的抗性基因，-抗性基因和基因序列已经整合到基因组的转化子通过在含有低浓度第一选择标记的营养培养基中生长来选择，-基因拷贝数通过多重转化增加，其中多重转化子通过在选择压力增加的营养培养基中生长来选择，-加入具有针对第二选择标记的抗性基因的第二载体，-基因拷贝数通过第二载体的多重转化增加，其中多重转化子通过在选择压力增加的营养培养基中生长来选择，-选择几个拷贝的基因序列和选择标记抗性基因已经以稳定方式整合进基因组的克隆。
2.根据本发明的方法，其中基因序列相应于SEQ ID NO1。
3.权利要求1或2的方法，其中基因序列相应于SEQ ID NO5。
4.权利要求1到3任一项的方法，其中使用甲基营养型酵母细胞。
5.权利要求1到4任一项的方法，其中使用巴斯德毕赤酵母或多形汉逊酵母作为酵母菌株。
6.SEQ ID NO5的DNA。
7.含有SEQ ID NO5的载体。
8.权利要求7的载体，其基本上相应于pHAP10-3。
9.含有来自pHAP10-3的完整表达盒的载体。
10.权利要求9的载体，其基本上相应于pHAP10-3/9K。
11.用权利要求9或10的载体转化的宿主菌株。
12.用载体pHAP10-3/9K和/或权利要求7或8的载体转化的宿主菌株。
13.权利要求12的宿主菌株，其中巴斯德毕赤酵母或多形汉逊酵母被用作宿主菌株。
14.用权利要求8到10的载体转化的巴斯德毕赤酵母X-33菌株。
15.生产高活性真核碱性磷酸酶的方法，其中所述酶在 11到14任一项的宿主菌株中表达。
全文摘要
本发明涉及在酵母细胞中重组生产和表达真核碱性磷酸酶的方法,其中使用编码比活性高于3000U/mg的高活性真核碱性磷酸酶的DNA。本发明还涉及将相应核酸序列插入在甲基营养型酵母菌株中表达的载体中的方法,以及合适的载体和宿主菌株。
文档编号C12N15/53GK1334341SQ0112324
公开日2002年2月6日 申请日期2001年7月20日 优先权日2000年7月25日
发明者R·米勒, J·-P·塔尔霍菲, F·盖佩, W·赫尔克, S·格拉泽, H·埃克斯坦, T·基尔施鲍姆, B·波马里乌斯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司