盐生杜氏藻烯醇酶及其编码序列的制作方法

专利名称：盐生杜氏藻烯醇酶及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物学领域，具体地说，本发明涉及新的编码盐生杜氏藻(Dunaliella salina)耐盐相关蛋白-烯醇酶的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的耐盐相关蛋白。
背景技术：
目前，世界人口不断增加，而可耕种土地却不断减少。然而，地球上还有许多因盐碱化而无法有效利用的土地资源。为了有效地利用这些盐碱化的土地资源，人们一直在寻找既适应生长而具有较高经济价值的植物品种。然而，迄今为止没有十分合适的植物品种。
另一种开发耐盐碱植物的方法是对已有的植物品种，尤其是具有较高经济价值的植物品种进行改良。然而，传统的植物改良方法费时、费力、并且缺乏针对性。
为了有效地、针对性地改善植物品种的耐盐性，本领域迫切需要开发与耐盐性有关的基因和蛋白。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的盐生杜氏藻耐盐相关蛋白烯醇酶以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在提高植物耐盐性方面的用途。
盐生杜氏藻(Dunaliella salina)属绿藻门、绿藻纲、团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，主要生长于高盐度水体中。细胞形态通常为卵圆形，当外界渗透压发生变化时，其形态可变为球形至纺锤形。它具有两条等长的鞭毛和一个杯状叶绿体，在叶绿体的外缘可积累大量的β-胡萝卜素小滴，是细胞呈橙红色。细胞无细胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。盐生杜氏藻与衣藻(Chlamydomonas)具有较近的亲缘关系。本发明通过多年对盐生杜氏藻的研究，发现了盐生杜氏藻中与耐盐性有关的蛋白-烯醇酶，在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的烯醇酶多肽，该多肽源自盐生杜氏藻，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述盐生杜氏藻烯醇酶多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中544-1566位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1827位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有盐生杜氏藻烯醇酶活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达盐生杜氏藻烯醇酶的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有盐生杜氏藻烯醇酶活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的盐生杜氏藻烯醇酶多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-1827个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗盐生杜氏藻烯醇酶多肽活性的化合物，以及抑制盐生杜氏藻烯醇酶多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在烯醇酶的方法，它包括将样品与烯醇酶的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在烯醇酶。
在本发明的第八方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进盐生杜氏藻烯醇酶多肽活性的激动剂，或者筛选抑制盐生杜氏藻烯醇酶多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的盐生杜氏藻烯醇酶的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第九方面，提供了一种改善植物耐盐性的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有烯醇酶多肽DNA编码序列，所述的烯醇酶多肽具有SEQ ID NO2氨基酸序列；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使烯醇酶多肽DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入烯醇酶多肽DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施例方式
在本发明中，术语“烯醇酶”、“烯醇酶多肽”或“耐盐相关蛋白烯醇酶”可互换使用，都指具有盐生杜氏藻耐盐相关蛋白烯醇酶氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的耐盐相关蛋白烯醇酶。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的烯醇酶或多肽”是指烯醇酶多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化烯醇酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括盐生杜氏藻烯醇酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然盐生杜氏藻烯醇酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“盐生杜氏藻烯醇酶多肽”指具有盐生杜氏藻烯醇酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与盐生杜氏藻烯醇酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括盐生杜氏藻烯醇酶的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与盐生杜氏藻烯醇酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗盐生杜氏藻烯醇酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含盐生杜氏藻烯醇酶多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了盐生杜氏藻烯醇酶多肽的可溶性片段。通常，该片段具有盐生杜氏藻烯醇酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供盐生杜氏藻烯醇酶或多肽的类似物。这些类似物与天然盐生杜氏藻烯醇酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“盐生杜氏藻烯醇酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码烯醇酶的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的盐生杜氏藻烯醇酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或烯醇酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的烯醇酶多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码盐生杜氏藻烯醇酶多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，盐生杜氏藻烯醇酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含盐生杜氏藻烯醇酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐盐性提高的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的盐生杜氏藻烯醇酶或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗烯醇酶功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组盐生杜氏藻烯醇酶筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激盐生杜氏藻烯醇酶功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对盐生杜氏藻烯醇酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与盐生杜氏藻烯醇酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制盐生杜氏藻烯醇酶的分子，也包括那些并不影响盐生杜氏藻烯醇酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的盐生杜氏藻烯醇酶基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的盐生杜氏藻烯醇酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达盐生杜氏藻烯醇酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用盐生杜氏藻烯醇酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与盐生杜氏藻烯醇酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗盐生杜氏藻烯醇酶的抗体可用于检测样品中的盐生杜氏藻烯醇酶。例如通过定量检测盐生杜氏藻烯醇酶，并利用烯醇酶与盐浓度的相关性，可以确定盐生杜氏藻生产环境中盐浓度。
多克隆抗体的生产可用盐生杜氏藻烯醇酶或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还涉及定量和定位检测盐生杜氏藻烯醇酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的盐生杜氏藻烯醇酶水平，可用于解释盐生杜氏藻烯醇酶在耐盐性方面重要性。
一种检测检测样品中是否存在烯醇酶的方法是利用烯醇酶的特异性抗体进行检测，它包括将样品与烯醇酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在烯醇酶。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用烯醇酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测烯醇酶的转录产物。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从盐生杜氏藻cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1827个碱基，其开放读框位于544-1566位，编码全长为340个氨基酸的盐生杜氏藻烯醇酶(SEQ ID NO2)。烯醇酶为改善植物的耐盐性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1盐生杜氏藻烯醇酶基因的克隆1.盐生杜氏藻的采集(Collection)盐生杜氏藻(Dunaliella salina)购自武汉水生生物研究所藻种库。
2.Poly A+RNA的分离(Poly A+RNA isolation)用Trizol试剂(Gibco，NY，USA)提取盐生杜氏藻的总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的试剂盒操作说明书抽取盐生杜氏藻的mRNA。
3.盐生杜氏藻cDNA文库的构建(Cloning of Full-length cDNA)使用Smart cDNA Library Construction Kit(ClonTech)提供的试剂盒说明书，以λTriplEX2为载体，构建盐生杜氏藻的cDNA噬菌体文库。
4.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)根据盐生杜氏藻及衣藻等烯醇酶氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Gibco试剂盒，NY，USA)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)使用简并引物，以Poly A+RNA为模板，进行RT-PCR扩增以寡核苷酸ATATCTGTCCCGGAGCGGCT(SEQ ID NO3)为正向引物；寡核苷酸GCTCACCACAGCACTCAGCACA(SEQ ID NO4)为反向引物，以Poly A+RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃5分钟，随后94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得片段的长度为0.45kb，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测得一个443bp序列。
将该序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与衣藻的烯醇酶存在较高的同源性。证实了简并引物设计正确。
(2).RACE根 据 以 上 序 列 分 别 设 计 5’ RACE 引 物 GCGATGAAGCAGTCCTCAGTCTCACCAG(SEQ ID NO5)；3’RACE引物ATTCAGTTTACATTTCAGGCCCGAGCGG(SEQ ID NO6)，使用Smart RACEcDNA Amplification Kit(Clontech)，按操作手册操作，得到盐生杜氏藻烯醇酶基因的5’及3’端序列。
(3).PCR扩增得到烯醇酶基因编码区(过程同(1))。
在拼接得到全长(包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物ATTCAGTTTA CATTTCAGGC CCGAGCGG(SEQ ID NO7)为正向引物，寡核苷酸CCACTCAGGA CACAAGCAAG GGCATTT(SEQ ID NO8)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序。结果验证了盐生杜氏藻烯醇酶蛋白的全长编码序列的正确性。
盐生杜氏藻烯醇酶基因的全长序列如SEQ ID NO1所示，其中其中读框位置是544-1566位。
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LYGTPNKAKL GANAILAVSL ATAKAGAAEK EVPLYRHIAD LAGNPKLYLP 50VPAFNIINGG SHAGNALAMQ EFMILPTGAS SFSEAMRMGT EVYHTLKGII 100KAKYGQDATN VGDEGGFAPN IQSNDDGLSL VTDAIEKAGY TGKVKIGMDV 150AASEFITEDK MYDLNLKQQP NDGSHKKTAA QMLEMYKEFC TKYPVISIED 200PFEQDDWEPA KSLTAENICQ VVGDDMLVTN PIRVKRGIEQ KAVNSLLLKV 250NQIGSLTESI EAVRMSKEAG WGVMTSHRSG ETEDCFIADL AVGLSTGQIK 300TGAPCRSERN AKYNQLLRIE EELGENAVYA GEKWRFIEWQ 340(SEQ ID NO2)
实施例2盐生杜氏藻烯醇酶蛋白的结构和功能将盐生杜氏藻烯醇酶全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与秀丽线虫(C.elegan)的烯醇酶mRNA全编码序列(GenBankAccession No.X66412)有83％的相同性，在氨基酸水平上，它与莱因衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的烯醇酶蛋白(GenPept Accession No.P31683)有84％的相同性和89％的相似性。
将盐生杜氏藻烯醇酶蛋白的氨基酸在blocks数据库(http//www.blocks.fhcrc.org)中检索结构域，发现在氨基酸序列中存在烯醇酶蛋白的以下结构域区IPB000941C 175-220aaIPB000941D 230-266aaIPB000941E 290-321aaIPB0009410 374-391aaIPB000941G 400-435aaIPB000941H 468-505aa在该氨基酸序列中存在烯醇酶蛋白功能模块，因此可预见其具有烯醇酶蛋白的相应功能。
实施例3盐生杜氏藻cDNA文库大规模测序和表达谱芯片的构建(High ThroughputSequencing of cDNA Library and Construction of Expression Microarray)对所得的盐生杜氏藻cDNA文库中的克隆进行序列测定，用所测得的靶序列构建表达谱芯片。将测序所得的克隆子溶解于3×SSC溶液中，使用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片，按公司提供的使用说明书操作。点样后玻片经水合、干燥、UV交连，再分别用SDS、水处理10分钟，晾干备用。
实施例4盐生杜氏藻表达谱芯片的筛选(Screening of the Expression Microarry)使用0.5mol/l、1.5mol/l、4.5mol/l浓度的NaCl溶液分别处理盐生杜氏藻2小时后，提取不同盐浓度处理后的盐生杜氏藻mRNA，分别用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记，与表达谱芯片杂交，用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片，用Axon公司的Genepix 3.01软件分析荧光信号强度。
表达谱芯片杂交结果显示有若干基因的表达量与盐生杜氏藻的生长盐浓度呈高度相关。其中，烯醇酶基因为其中一条。其具体数据分为三组第一组为cy5(4M)、cy3(1.5M)标记的；第二组为cy5(4M)、cy3(0.5M)标记的；第三组为cy5(1.5M)、cy3(0.5M)标记的。三组标记荧光信号强度的自然对数ln(cy5/cy3)的平均值为0.292，说明随着盐浓度的变化，该基因的表达差异在5倍左右。
综上所述，盐生杜氏藻烯醇酶为一未见报道的新型耐盐相关蛋白。
实施例5盐生杜氏藻烯醇酶基因表达载体的构建根据盐生杜氏藻烯醇酶基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这视选用的载体而定)，以便构建表达载体。经PCR扩增后，将盐生杜氏藻烯醇酶cDNA克隆至中间载体(pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(pBI 121)，在保证阅读框的前提下鉴定好的表达载体，在将其转入农杆菌中，用于转化模式植物烟草。
实施例6利用叶盘法转化烟草按如下步骤转化烟草(1)用无菌牙签挑取YEB选择平板上的实施例5中制备的阳性克隆，接种于2M LYEB液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；(2)室温下4,000g离心10分钟；(3)弃上清，菌体用1/2 MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600在0.5左右；(4)取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1cm2见方的小叶片；(5)将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；(6)把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；(7)将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+羧卞青霉素250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；(8)约20天后可见分化芽长出，带芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>四川川大光耀生物工程有限公司<120>盐生杜氏藻烯醇酶及其编码序列<130>015471<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1827<212>DNA<213>盐生杜氏藻(Dunaliella salina)<220><221>CDS<222>(544)..(1566)<400>1ggacagataa aacaattcag tttacatttc aggcccgagc ggctggctgg aggagctttc60aaccgcgcag cagcccaaca cccctcttaa gcagcagcaa ggcgctcccc ccccaacgca120gcacaatggc caccgtgcag gagtacatcg acaagcacca gctgcagaaa aagacggagg180acgtgctcaa catcgcggtg aagtccaagc ccgatgagcc actgtccttc ctggccaagg240agctgctcag gatggctcca tcagagatct tgaaggttgt aggccgtcag atcattgact300ctcgcggcaa ccccactgtg gaggcagacg tgcacaccca taagggcatg ttccgtgctg360ctgtgccctc cggtgcctcc actggcatcc acgaggcagt tgagctgcgt gatggcgaca420agaccaagtt cctgggcaag ggtgtgcaga aggctgtgga gagcatcaac accatcatca480gccccgccct gaagggcatg gaccccaaga accagagcga ggtggaccag aagatgatcg540acc ttg tat ggc act ccc aac aag gcc aag ctg ggt gcc aat gca att 588Leu Tyr Gly Thr Pro Asn Lys Ala Lys Leu Gly Ala Asn Ala Ile1 5 10 15ctg gcc gtc tcc ctg gcc act gcc aag gct ggt gct gcc gag aag gaa 636Leu Ala Val Ser Leu Ala Thr Ala Lys Ala Gly Ala Ala Glu Lys Glu20 25 30gtg cct ctg tac agg cac att gct gac ctg gcc ggc aac ccc aag ctg 684Val Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Asp Leu Ala Gly Asn Pro Lys Leu35 40 45tac ttg ccc gtg cca gcg ttc aac atc atc aac ggc ggc agc cac gca 732Tyr Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Ile Ile Asn Gly Gly Ser His Ala50 55 60ggc aac gcc ctt gcc atg cag gag ttc atg atc tta ccc act gga gca 780Gly Asn Ala Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Thr Gly Ala65 70 75tca tct ttc tct gag gcc atg cgc atg ggc act gag gtg tac cac aca 828Ser Ser Phe Ser Glu Ala Met Arg Met Gly Thr Glu Val Tyr His Thr80 85 90 95ctg aag ggc atc atc aag gcc aag tac ggc cag gat gct acc aac gtt 876Leu Lys Gly Ile Ile Lys Ala Lys Tyr Gly Gln Asp Ala Thr Asn Val100 105 110ggt gat gag ggt ggc ttt gcc ccc aac atc caa tcc aat gat gat ggt 924Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Gln Ser Asn Asp Asp Gly115 120 125ctg tcc ttg gtc acc gat gcc att gag aag gca gga tac act ggc aag 972Leu Ser Leu Val Thr Asp Ala Ile Glu Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Lys130 135 140gtc aag atc ggc atg gac gtg gct gcg tca gag ttc att acc gag gac 1020Val Lys Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Ile Thr Glu Asp145 150 155aag atg tac gac ctg aac ctc aag cag cag ccc aac gat ggc tcc cac 1068Lys Met Tyr Asp Leu Asn Leu Lys Gln Gln Pro Asn Asp Gly Ser His160 165 170 175aag aag aca gct gcc caa atg ctg gag atg tac aag gag ttc tgc acc 1116Lys Lys Thr Ala Ala Gln Met Leu Glu Met Tyr Lys Glu Phe Cys Thr180 185 190aag tac ccc gtc atc tcc atc gag gat ccc ttc gag cag gat gac tgg 1164Lys Tyr Pro Val Ile Ser Ile Glu Asp Pro Phe Glu Gln Asp Asp Trp195 200 205gag cct gcc aag tcc ctg act gca gag aac atc tgc cag gtg gtt ggc 1212Glu Pro Ala Lys Ser Leu Thr Ala Glu Asn Ile Cys Gln Val Val Gly210 215 220gat gac atg ctg gtg acg aac ccc atc cgc gtc aag cgc ggc att gag 1260Asp Asp Met Leu Val Thr Asn Pro Ile Arg Val Lys Arg Gly Ile Glu225 230 235cag aag gca gtc aac tcc ttg ctc ctg aag gtc aac cag att ggc tcc1308Gln Lys Ala Val Asn Ser Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser240 245 250 255ctg act gag tcc atc gag gcc gtg agg atg tcc aag gag gca ggc tgg1356Leu Thr Glu Ser Ile Glu Ala Val Arg Met Ser Lys Glu Ala Gly Trp260 265 270ggt gtg atg acc agc cac agg tct ggt gag act gag gac tgc ttc atc1404Gly Val Met Thr Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Cys Phe Ile275 280 285gca gac ttg gca gtt ggc ctg tcc aca ggc cag atc aag act ggt gct1452Ala Asp Leu Ala Val Gly Leu Ser Thr Gly Gln Ile Lys Thr G1y Ala290 295 300cct tgc cgc tct gag cgc aat gct aag tac aac cag ctg ctc cgc att1500Pro Cys Arg Ser Glu Arg Asn Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile305 310 315gag gag gag ctt ggc gag aat gca gtg tac gct ggt gag aag tgg cgc1548Glu Glu Glu Leu Gly Glu Asn Ala Val Tyr Ala Gly Glu Lys Trp Arg320 325 330 335ttc att gag tgg cag tga attgtcatgg agtagactta tgttgcttgg 1596Phe Ile Glu Trp Gln340tggaaatgtt gggctgcaaa tgcccttgct tgtgtcctga gtggagtgtg tctcgtgggt 1656taatcggata gcttcagcat aatgctccta gagagctcac acttcacctg tgtgatccaa 1716acccttggtt tgctgaaatt ctagacgaat aatggtgtaa caaacagggc tctgaagaaa 1776aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaca tgtcggccgc ctcggcctat g 1827<210>2<211>340<212>PRT<213>盐生杜氏藻(Dunaliella salina)<400>2Leu Tyr Gly Thr Pro Asn Lys Ala Lys Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu15 10 15Ala Val Ser Leu Ala Thr Ala Lys Ala Gly Ala Ala Glu Lys Glu Val20 25 30Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Asp Leu Ala Gly Asn Pro Lys Leu Tyr
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1.一种分离的盐生杜氏藻烯醇酶多肽，其特征在于，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中544-1566位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1827位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种具有盐生杜氏藻烯醇酶活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达盐生杜氏藻烯醇酶的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有盐生杜氏藻烯醇酶活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的盐生杜氏藻烯醇酶特异性结合的抗体。
10.一种改善植物耐盐性的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有烯醇酶多肽DNA编码序列，所述的烯醇酶多肽具有SEQ ID NO2氨基酸序列；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使烯醇酶多肽DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入烯醇酶多肽DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供了一种新的耐盐相关蛋白－盐生杜氏藻烯醇酶，编码该烯醇酶的多核苷酸和经重组技术产生这种烯醇酶的方法。本发明还公开了编码这种烯醇酶的多核苷酸的用途。本发明还公开了此烯醇酶用于改善植物耐盐性的方法。
文档编号C12N9/00GK1408852SQ0112692
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月29日 优先权日2001年9月29日
发明者曹毅, 蒋彦, 唐克轩, 杨滔, 曾昌耀 申请人:四川川大光耀生物工程有限公司