专利名称：棉花纤维可逆糖基化蛋白酶基因及其编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及棉花的一种基因及其所编码的蛋白质。
由于膜结合酶很不稳定，对去污剂极敏感，容易失去活性，很难分离纯化得到有活性的酶，长期以来严重地限制了研究的深入。直到1991年，Dhugga等(1997)在研究豌豆的高尔基体膜合成多糖时，鉴定出一个41kD的蛋白二聚体，能被放射性标记的UDP-Glu糖基化，这种糖基化能被非放射性标记的UDP-Glu、UDP-Xyl、UDP-Gal可逆地竞争结合，因而将这种蛋白质命名为可逆糖基化蛋白酶(reversiblyglycosylated polypeptide，RGP)。豌豆PsRGP的糖基化条件与GS I活性条件相同。为了研究RGP在多糖合成中的作用，Dhugga等(1997)纯化了PsRGP，制备抗血清。通过免疫筛选豌豆cDNA表达文库，克隆了PsRGP的cDNA。他们的研究表明PsRGP具有酶学活性，金标免疫将其定位于高尔基体的trans面。Delgado等(1998)从模式植物拟南芥中克隆了AtRGP1，获得了具有与PsRGP相似功能的基因，但不同之处在于AtRGP1是一个单体蛋白，而PsRGP是个二体蛋白。
本发明的棉花可逆糖基化蛋白酶的基因由1331个碱基组成，含一个完整的开放阅读框架，为序列表中的1号序列，命名为GhRGP1。
棉花可逆糖化蛋白酶的基因由5’端50bp的非编码区、1080bp的阅读框架编码区和201bp的3’非编码区组成。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。
本发明的棉花可逆糖基化蛋白酶由359个氨基酸残基组成，为序列表中的序列2。
棉花可逆糖基化蛋白酶的理论分子量为40.78Da，等电点为6.01。
棉花可逆糖基化蛋白酶是可溶性的膜相关蛋白，定位于细胞内高尔基体的trans面，参与细胞壁多糖的生物合成。可逆糖基化蛋白酶能可逆地被UDP-Glu、UDP-Xyl、UDP-Gal所糖基化，其糖基化比例为UDP-Glu∶-Xyl∶-Gal10∶7∶3，该比例与木葡聚糖的组成成分非常相似。
如
图1所示，将本发明全长1331bp的cDNA序列编码的GhRGP1与其它植物的RGP进行同源性比较，其中，Gh为棉花，Ps为豌豆，At为拟南芥，Os为水稻，Ta为小麦，Zm为玉米，Vu为豇豆，结果表明棉花可逆糖基化蛋白酶氨基酸序列与玉米、小麦、豌豆、豇豆、水稻和拟南芥RGP的同源性分别为86％、85％、85％、84％、84％和78％。用分子生物学软件(pSORT，http//psort.nibb.ac.jp)预测分析GhRGP1缺乏信号肽，疏水性分析表明GhRGP1无跨膜区域，是可溶性蛋白，这与其它植物(豌豆和拟南芥)中分离纯化到的同源蛋白的情形一致。GhRGP1具有非加工型糖基转移酶的保守残基(D，位于44位)和结构域(DXD，位于102位)，是UDP-糖潜在的结合位点，糖化残基(R)位于150位。这些保守残基和结构域及糖化残基所在位置与已有的RGP不同，因此GhRGP1 cDNA编码一个新的植物RGP基因，在细胞壁多糖的生物合成中能起核苷糖转运体或中间体的作用。
实验表明，GhRGP1在异源四倍体AD基因组中是单一拷贝基因，可能含有内含子。具体实验过程是，从棉花品种中棉所12正在伸展的叶片中提取基因组DNA。用GhRGP1基因内部没有切割位点的限制性内切酶BamHI，EcoRI，EcoRV，KpnI和XbaI分别酶解20μg基因组DNA，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离后，将DNA转至尼龙膜Hybond-N+上。按Northern2Southern HRP标记检测试剂盒(Pierce，USA)的方法，将该膜在55℃下预杂交0.5小时后，加入标记的GhRGP1 cDNA探针，于55℃杂交2小时。杂交后用含有0.1％SDS和2×SSC的洗膜液在55℃下漂洗3次，每次5分钟；然后再用2×SSC的洗膜液于室温洗膜3次，每次5分钟；最后加入显色液，室温放置10分钟，弃去显色液，暴X光片。结果如图2所示，其中，BBamHI；EIEcoRI；KKpnI；EVEcoRV，4种内切酶的酶解产物杂交后均显示1条带，说明GhRGP1在异源四倍体AD基因组中是单一拷贝；而在XbaI酶切产物中出现了2条带表明可能含有内含子或异源四倍体AD基因组间该酶切位点的变异。
为了鉴定GhRGP1基因的组织分布特征，以纤维、茎、根、叶、花、胚珠和种子为材料进行Northern杂交。杂交方法与Southern杂交法相同。结果如图3-A及图3-B所示，其中，图3-A中Fb发育10天的纤维；Rt幼根；St茎；Lf叶；Fl花；Ov胚珠；Sd发育30天的种子。图3-B中数字表示开花后纤维发育的天数。从图中可以看出，GhRGP1在纤维细胞中强优势表达，其次在幼根中也有较高表达，在花、胚珠和种子低量表达，而在茎和叶中无表达。这暗示GhRGP1的大量表达是与细胞或组织的快速生长相联系的。
棉花可逆糖基化蛋白基因的发现及克隆，使通过基因工程手段调控棉花纤维中多糖物质的积累成为可能，并为培育高产优质的转基因棉花奠定了基础。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
图2为GhRGP1的Southern杂交。
图3-A为GhRGP1 mRNA的Northern杂交，显示GhRGP1 mRNA在棉花不同组织的分布特征。
图3-B为GhRGP1 mRNA的Northern杂交，显示GhRGP1 mRNA在棉纤维发育过程中的表达特征。
图4-A为GhRGP1的5’RACE-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。
图4-B为pGEM-T easy-GhRGP1的酶切鉴定。
图5为GhRGP1的表达载体pQE-30-GhRGP1。
图6为pQE-30-GhRGP1在M15中的表达。
1、总RNA的提取提取缓冲液硼酸钠pH 9.00.2MEGTA30mMSDS 1.0％DOC 1.0％PVP-40 2.0％DTT 0.1M步骤(1)80℃预热提取液10ml。
(2)棉花组织2g，液氮研磨成粉末。
(3)将粉末投入预热的提取液10ml(5ml/1g)，均质化2min。
(4)用4层灭菌纱布过滤后，加400l蛋白酶K混匀，37℃，1～1.5hr，200rpm。
(5)加0.8ml 2 M KCl，冰上放置1hr；4℃，12000rpm，20min。
(6)加入1/4体积的10 M LiCl，至终浓度2M，4℃沉淀过夜。
(7)12000rpm，4℃，离心20min，弃上清。
(8)用冷的2M LiCl洗涤2次，每次10000rpm离心10min。
(9)用800l TE溶解沉淀，10000rpm离心5min，取上清。
(10)加2M KAc至终浓度0.2M，冰上放置15min；10000rpm离心10min，取上清。
(11)加2.5倍体积的乙醇，-20℃沉淀5-8hr。
(12)12000rpm，于4℃离心20min，80％乙醇洗涤1次，抽干，溶于100ul TE中，于-70℃保存。取少量进行电泳检测，并测定OD值，计算浓度。
2、荧光差异显示获得棉花RGP 3’片段差异显示在Genomyx(Beckman)仪上进行，使用该公司的FloroDD试剂盒进行操作。用反转录酶Superscript RT(Gibco)从总RNA反转录合成cDNA，并以cDNA为模板，选用3对引物进行PCR。锚定引物由17bp的T7启动子序列，12bp的polyT和2个可变碱基组成，随机引物由16bp的TM13反向序列(M13r)和10bp的随机序列组成。锚定引物5’端荧光标记，随机引物不标记。本实验所用锚定引物为AP7(5’T7dT12CG3’)和AP9(5’T7dT12AC3’)，随机引物为ARP19(5’M13r-TTTTGGCTCC3’)和ARP20(5’M13r-TCGATACAGG3’)，引物组合为AP7/ARP19，AP7/ARP20，AP9/ARP19。PCR产物在高分辨率、5.6％变性胶上电泳，干胶后扫描。挖取纤维中出现的特异带，并在严谨条件(94℃ 2min，一个循环；94 30sec，60 30sec，72 2min，30个循环；72 7min，一个循环。)下二次PCR，回收这些cDNA片段，将其克隆到TA载体(pGEM-T Easy，Promega)上，在377仪上测序。
荧光差异显示共获得16个纤维中特异表达的候选片段，其中之一(F12)与已知序列的RGP 3’端具有很高的同源性，Northern点杂交证实该片段在纤维细胞中强优势表达。证实，获得了棉花RGP的3’片段。
实施例2、带有双接头的棉花纤维cDNA文库的构建从开花后发育10天的棉花纤维总RNA中，采用Promega的PolyATtract System1000分离mRNA，用Clontech的Marathon cDNA试剂盒合成cDNA，再连上接头，构建成两端带有接头的棉花纤维cDNA文库。
1、棉花纤维mRNA的分离用Promega公司PolyATtract System 1000从发育10天纤维的总RNA中分离mRNA，具体操作步骤如下(1)取总RNA 750μg，体积500μl，加入3μl生物素化的寡聚(dT)核苷酸探针，轻轻混匀，于70℃变性5min，室温放置、冷却平衡10min。
(2)用1ml SSC(0.5×)洗涤SA-PMPs磁球3次，最后重悬磁球于500ul SSC(0.5×)中。并将悬浮液移至该试剂盒配备的mRNA User管中，用磁铁再次吸附SA-PMPs磁球颗粒，小心吸去SSC溶液。重复洗涤2次。
(3)将复性的mRNA/探针反应物，加入到洗涤好的SA-PMPs磁球中，轻轻混匀，室温放置10min。
(4)用磁架扑获移SA-PMPs/mRNA/探针复合物，小心弃去上清。
(5)用1ml SSC(0.5×)洗涤3次。离心终止后小心将上清移入含有2ml SA-PMPs磁球的锥形管中，上下颠倒混匀，室温放置2min后，用磁铁吸附SA-PMPs磁球，直至溶液澄清，并小心弃去上清。
(6)用600l的超纯水重悬，用磁架扑获SA-PMPs/探针复合物，小心吸取上清。
(7)将含有mRNA的上清转移至一新管中，加1/10体积3M NaAc(pH5.2)和等体积异丙醇，混匀后-20℃放置过夜。
(8)4℃ 12,000rpm离心10min，弃去上清，用70％ 醇离心洗涤沉淀。
(9)真空干燥沉淀15分钟左右，用适量体积的超纯水悬浮沉淀，-70℃保存备用。
2、cDNA文库的构建根据Clontech公司Marathon cDNA试剂盒的操作程序，先以棉花纤维mRNA为模板反转录成第一链cDNA，然后以第一链cDNA为模板合成第二链，再将双链cDNA两头连上接头构成两端带有接头的cDNA文库。具体操作步骤如下A、合成cDNA第一链(1)在0.5ml微量离心管中加入下列反应物mRNA(1g) 4lcDNA合成寡聚d(T)引物(10M) 1l轻轻混匀并稍加离心，70℃变性5min。
(2)继续在0.5ml微量离心管中加入下列反应物5×第一链缓冲液 2ldNTP混合物(10mM) 1lAMV反转录酶(20U/l)1l加水将总体积补足10l
轻轻混匀并稍加离心后，于42℃空气浴1小时以合成cDNA。然后将反应管放置在冰上以中止第一链合成反应。
B、合成cDNA第二链(1)在第一链反应管中加入下列反应物ddH2O 48.4l第二链缓冲液(5×) 16ldNTP混合物(10mM) 1.6l第二链酶混合液(20×) 4l总体积80μl，轻轻混匀并稍加离心后，于16℃温浴1.5小时。
(2)入2μl(10U)T4 DNA聚合酶，混匀后16℃反应45分钟。
(3)加4μl EDTA/Glycogen混合液以终止第二链合成反应。
C、纯化cDNA(1)加入100μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合后10,000rpm于4℃离心10min。
(2)将上层水相移入新管中，加入100l氯仿∶异戊醇(24∶1)，振荡混匀后10，000rpm离心10min。
(3)将上层水相移入新管中，加入1/2体积的4M醋酸铵和2.5倍体积乙醇，混匀后13,000rpm室温离心20min以沉淀合成的双链cDNA。
(4)用300μl 80％乙醇离心洗涤沉淀，空气中干燥10min后，用10l无菌水溶解沉淀，-20℃保存备用。
D、接头连接(1)在0.5ml微量离心管中加入下列反应物双链cDNA 5lMarathon cDNA接头(10M) 2l5×DNA连接缓冲液 2lT4 DNA连接酶(1U/l) 1l总体积为10μl，混匀后16℃连接过夜。
(2)70℃处理10min灭活连接酶后，用Tricine/EDTA稀释成50X、250X，于-20℃保存备用。
至此，构建成了一个两端含有接头的棉花纤维双链cDNA文库。
实施例3、用5’-RACE-PCR扩增全长棉花RGP基因根据FDD获得的3’RGP序列，在终止密码后设计引物，用Clontech公司的Marathon cDNA扩增试剂盒进行5’-RACE-PCR，扩增出全长棉花纤维RGP基因。
其具体步骤如下1、将下列反应物加入0.5ml PCR反应管中10×PCR缓冲液 5lMgCl2(25mM)5ldNTPs(10mM) 1lEx Taq(2.5U/μl)1l棉花cDNA文库(50X) 5l合成引物(20pmol/l) 1l接头引物AP1(20pmol/μl) 1lddH2O 31l总体积为50μl。
混匀后，按下列程序进行PCR扩增94℃ 4min；94℃ 30s；65℃ 45s；72℃ 2min(35个循环)；72℃ 7min；4℃。
2、5’RACE-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图4-A所示，其中，1DL2000Marker；2RACE-PCR产物，由图中可见，RACE-PCR产物呈现1条带，分子量约1.2Kb。
3、将PCR产物用Promega公司的Wizard PCR扩增DNA纯化试剂盒分离纯化后，克隆进Promega公司的pGEM-T easy Vector上，经转化大肠杆菌JM109，提取质粒，如图4-B所示，酶切鉴定出含有插入片段的单克隆，将该克隆命名为pGEMF 12f7，其中，3λ-DNA Hind III/EcoRI marker；4pGEM-T easy-GhRGP1的EcoRI酶切。
将pGEMF12f7用末端终止法进行双向测序，其结果表明该片段长为1331bp，含有一个完整的阅读开放框架1080bp，编码359个氨基酸，与FDD所获得的3’片段重叠1114bp。该基因与已知的其它植物RGP蛋白具有较高的同源性，表明已获得全长阅读框架的棉花RGP基因。
将FDD的片段与5’-RACE-PCR获得全长阅读框架的棉花RGP cDNA序列合并后，得到了棉花RGP的全长cDNA序列，1331bp，其中1080bp的ORF编码359个氨基酸残基，3’和5’的非编码区分别为50bp和201bp，其多腺苷化信号AAUAA位于终止密码子下游103bp处。
实施例4、棉花RGP在棉花纤维细胞中的高效表达用Northern杂交分析GhRGP1在纤维发育过程中的表达模式，结果表明GhRGP1的表达严格地受发育阶段的调控，出现2个转录物积累高峰(如图3-B所示)。第一个高峰出现在初生壁最大速度伸长的15天(增加了6倍)，第二个高峰出现在次生壁增厚期的40天(增加了7倍)，而在初生壁和次生壁重叠期表达最低(25天时下降了12倍)。
上述结果表明GhRGP1 mRNA在棉花组织中的分布具有明显的组织特异性。细胞的快速生长是以合成大量的细胞壁多糖为前体的，棉纤维的初生壁的形成就是一个快速伸长的过程，主要合成非纤维素多糖。已知木葡聚糖是棉纤维半纤维素的主要成分，它在15天含量最高，而此时GhRGP1 mRNA积累量也最大，即GhRGP1在纤维中的高量表达与木葡聚糖的大量合成相一致。然而GhRGP1的表达特征与纤维素的合成和积累模式不一致，它在增厚期的大量表达可能与纤维内层细胞壁的生物合成有关。暗示GhRGP1参与了非纤维素多糖的生物合成。
实施例5、GhRGP1在大肠杆菌中的高效表达为了表明GhRGP1基因的编码功能，本发明将GhRGP1基因克隆到Qiagen公司的pQE30的SphI和KpnI位点之间，并转化大肠杆菌M15，获得了高效表达。
本发明是利用Qiagen公司的pQE30高效表达载体的多克隆位点来实现GhRGP1的高效表达的。pQE30表达载体表达出的产物是5’端附加6个连续His的融合蛋白，这6个连续的His构成了Ni-NTA凝胶特异结合的位点，因此可利用亲和层析来纯化表达产物。设计并合成一对特异引物，按分子克隆常规实验程序用PCR扩增出两端带有特定酶切位点的基因编码序列，基因和载体用相同的酶(SphI和KpnI)酶切后，再连接，将连接产物转化大肠杆菌M15菌株，并用含100μg/ml氨苄青霉素和25g/ml卡那霉素的LB平板筛选重组子。经质粒酶切鉴定和PCR鉴定后，将筛出的连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的。把构建成带有GhRGP1基因的表达载体，命名为pQE-30-GhRGP1(如图5所示)，用于诱导表达分析。
将筛选并经鉴定确认的重组子，接种于5ml LB(含100g/ml氨苄青霉素和25g/ml卡那霉素)培养基中，37℃培养过夜，然后按1∶10比例接种到4ml LB培养液中，37℃继续培养至A600＝0.6～0.9，加入8l 1M的IPTG溶液(IPTG终浓度为1mM)，诱导3小时后取1ml菌液离心收集菌体，按Qiagen提供的方法提取细胞可溶性蛋白，进行12.5％SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示，其中，1无表达载体的M15；2含有pQE30的M15；3含有pQE-30-GhRGP1的M15但未诱导；4，5，6和7分别为含有pQE-30-GhRGP1的M15诱导1，2，3和4小时。从图中可以看出，GhRGP1基因在M15得到高效表达。
序列表<160>2<170><210>1<211>1331<212>DNA<213>Gossypium hirsutum<214>棉花属陆地棉<400>1cttccatccc ctctccctgc tttgctctga aaagtccaag tttttctcca atggcgaccg 60tctctccaac tcctctgttg aaagatgagc tcgacatcgt gattcccacg attaggaact 120tggacttttt ggagatgtgg agaccctttt tccagcctta ccatctcatc attgttcaag 180atggtgatcc taccaagacc atcaaggtcc ctgaaggctt cgattatgag ctttacaata 240ggaacgacat caacaggatt ttgggtccta aggcttcttg tatctctttc aaggattctg 300cttgtaggtg ctttgggtac atggtttcca agaagaaata catctatacc attgatgatg 360actgctttgt tgctaaagat ccatctggca aagacatcaa tgcattggaa cagcacatac 420agaacctact gagtccatcc actccatttt tctttaacac tctttatgac ccataccgat 480ccggtgctga cttcgttcgt ggctaccctt tcagtctccg tgagggtgtt accactgccg 540tctcacacgg tctctggctc aacatcccgg attatgatgc tcccacacag cttgtcaagc 600cactcgagag gaacaccagg tatgtcgacg ctataatgac gattccgaag ggaaccttgt 660tccccatgtg cggaatgaat ctggcattta accgagaatt gatcggccct gcaatgtact 720ttggactcat gggagatggt caaccaattg gacgatacga tgatatgtgg gctggctggt 780gcaccaaggt tatttgtgat cacctcggat ggggagtgaa gaccggactt ccctacattt 840ggcacagcaa agcgagcaac ccgtttgtga accttaagaa agaatacaaa ggaatttact 900ggcaagaaga gttgattcct ttcttccaat ccgttgccct tccgaaggac tgcaccaccg 960tacagaaatg ctacatcgag atctccaagc aagtgaaggc gaaactcggc aaggtcgatg1020actacttcaa taagctggcg gatgctatgg tgacatggat tgaagcttgg gatgaactga1080acccatcggg cgatatatcc gccaagattc ctaatggtgc ttccaagtga aaacacatca1140ttgtgttatt ttgcaggttg gagggagaac catttatgta tgttactaca tatctcatag1200tattttatca tatttactga gcttagatga acaataagaa atttatggtt ttatgtattg1260tattagactt tgagagttag cttctgtagt tttaattcag atgattgcat ttcaattaag1320taaaaaaaaa a 1331<120><210>2<211>359<212>PRT<213>Gossypium hirsutum<214>棉花属陆地棉<400>2Met Ala Thr Val Ser Pro Thr Pro Leu Leu Lys Asp Glu Leu Asp1 5 10 15Ile Val Ile Pro Thr Ile Arg Asn Leu Asp Phe Leu Glu Met Trp20 25 30Arg Pro Phe Phe Gln Pro Tyr His Leu Ile Ile Val Gln Asp Gly35 40 45Asp Pro Thr Lys Thr Ile Lys Val Pro Glu Gly Phe Asp Tyr Glu50 55 60Leu Tyr Asn Arg Asn Asp Ile Asn Arg Ile Leu Gly Pro Lys Ala65 70 75Ser Cys Ile Ser Phe Lys Asp Ser Ala Cys Arg Cys Phe Gly Tyr80 85 90Met Val Ser Lys Lys Lys Tyr Ile Tyr Thr Ile Asp Asp Asp Cys95 100 105Phe Val Ala Lys Asp Pro Ser Gly Lys Asp Ile Asn Ala Leu Glu110 115 120Gln His Ile Gln Asn Leu Leu Ser Pro Ser Thr Pro Phe Phe Phe125 130 135Asn Thr Leu Tyr Asp Pro Tyr Arg Ser Gly Ala Asp Phe Val Arg140 145 150Gly Tyr Pro Phe Ser Leu Arg Glu Gly Val Thr Thr Ala Val Ser155 160 165His Gly Leu Trp Leu Asn Ile Pro Asp Tyr Asp Ala Pro Thr Gln170 175 180Leu Val Lys Pro Leu Glu Arg Asn Thr Arg Tyr Val Asp Ala Ile185 190 195Met Thr Ile Pro Lys Gly Thr Leu Phe Pro Met Cys Gly Met Asn200 205 210Leu Ala Phe Asn Arg Glu Leu Ile Gly Pro Ala Met Tyr Phe Gly215 220 225Leu Met Gly Asp Gly Gln Pro Ile Gly Arg Tyr Asp Asp Met Trp230 235 240Ala Gly Trp Cys Thr Lys Val Ile Cys Asp His Leu Gly Trp Gly245 250 255Val Lys Thr Gly Leu Pro Tyr Ile Trp His Ser Lys Ala Ser Asn260 265 270Pro Phe Val Asn Leu Lys Lys Glu Tyr Lys Gly Ile Tyr Trp Gln275 280 285Glu Glu Leu Ile Pro Phe Phe Gln Ser Val Ala Leu Pro Lys Asp290 295 300Cys Thr Thr Val Gln Lys Cys Tyr Ile Glu Ile Ser Lys Gln Val305 310 315Lys Ala Lys Leu Gly Lys Val Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Leu Ala320 325 330Asp Ala Met Val Thr Trp Ile Glu Ala Trp Asp Glu Leu Asn Pro335 340 345Ser Gly Asp Ile Ser Ala Lys Ile Pro Asn Gly Ala Ser Lys350 355 359
权利要求
1.一种编码棉花可逆糖基化蛋白酶的基因，具有与序列1至少85％同源的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的基因，其特征在于编码棉花可逆糖基化蛋白酶的基因为序列1的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于它的开放读码框为自第51个至第1130个共1081个碱基。
4.根据权利要求3所述的基因其特征在于所述开放读码框的起始密码子为ATG。
5.根据权利要求3所述的基因其特征在于所述开放读码框的终止密码子为TGA。
6.一种棉花可逆糖基化蛋白酶，具有序列2的氨基酸序列。
7.含有权利要求1或2的多核苷酸的载体。
8.用权利要求1或2的多核苷酸转化的生物细胞。
9.根据权利要求8所述的生物细胞，其特征在于它是具有可逆糖基化能力的植物细胞。
10.根据权利要求8所述的生物细胞，其特征在于它是具有可逆糖基化能力的大肠杆菌。
全文摘要
本发明的名称为棉花纤维可逆糖基化蛋白酶基因及其编码的蛋白质。本发明编码棉花可逆糖基化蛋白的基因，具有序列1的核苷酸序列，它由1331个碱基组成，含一个完整的开放阅读框架，命名为GhRGP1。本发明的棉花可逆糖基化蛋白酶由359个氨基酸残基组成，为序列表中的序列2，它的理论分子量为40.78Da，等电点为6.01。棉花可逆糖基化蛋白基因的发现及克隆，使通过基因工程手段调控棉花纤维中多糖物质的积累成为可能，并为培育高产优质的转基因棉花奠定了基础。
文档编号C12N15/63GK1405313SQ0114216
公开日2003年3月26日 申请日期2001年9月14日 优先权日2001年9月14日
发明者刘进元, 赵广荣, 徐振彪 申请人:清华大学