专利名称：应用多重pcr技术的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明应用多重PCR技术的基因芯片涉及一种基因芯片及其制备方法和检测方法。基因芯片是一种在固态基底上有序排列的核酸分子，以实现对DNA或RNA并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。可应用于生物学、医学及相关领域。
背景技术：
聚合酶链反应(polymerase chain reaction)简称PCR，是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法。通过试管反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片断，在短短几小时内增加106倍，极大提高了检测灵敏度，广泛应用于分子生物学的各个领域，如在诊断遗传性疾患，检测临床标本中病原体的核酸序列、对法医学标本作遗传学鉴定，以及分析激活癌基因中的突变情况包括分离、克隆、核酸序列分析、突变体和重组体的构件和基因表达调控研究等。基因芯片是最重要的一种生物芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量的基因，使人们准确高效地破译遗传密码。当前多数公司在使用基因芯片的过程中都要对样品进行一定程度的扩增即通过PCR使所需的核苷酸片段呈指数级增长以提高检测的灵敏度。本发明在当前基因芯片的基础之上，将多重PCR(multiplex polymerase chain reaction)技术应用于基因芯片。多重PCR技术是在常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新的PCR扩增技术。可在同一PCR反应体系内加入多对特异性引物，一次扩增多个DNA或RNA片段，从而实现多种DNA或RNA片段的同时快速鉴定。常规PCR一次只能扩增一种DNA或RNA片段，对需多个核苷酸片段的扩增就无能为力，而且操作繁琐费时，成本又高。多重PCR有效地为临床的混合感染，以及原因不明的患者的快速诊断，提供了快速、准确的诊断手段，有效地减少了疾病的误诊和漏诊；为生物的基因分型提供了简便、准确的方法；更提高基因芯片的检验效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在待测DNA或RNA量较小的情况下，可同时检测多个不同DNA或RNA片段的基因芯片，以及芯片的制备方法和检测方法。
本发明的目的可通过下述技术方案实现是将多重PCR的技术应用于基因芯片，特点是将探针点阵于固相载体上，固相载体表面经过封闭后，加入待测样品的多重PCR产物的荧光标记物，该荧光标记物与固相探针进行杂交反应，洗去未结合的物质后，探针点的荧光强度与样品中待测成分的含量正相关。如图1应用多重PCR技术的基因芯片的反应原理图所示。
其中所述待测样品的多重PCR产物的荧光标记物，即为在DNA或RNA提取液中加入多对特异性引物，进行PCR反应，在同一反应条件下一次扩增多个DNA片段，并标记荧光。
本发明所述待测样品可以是血清、体液、组织液、细胞裂解液等提取的含有一种以上微量DNA的样品或含有一种以上微量RNA的样品、逆转录获得的cDNA样品；所述特异性引物为与待测成分相互补的DNA片段；所述探针为待测成分相应的DNA、RNA、cDNA或寡核苷酸。
应用多重PCR技术的基因芯片的制造方法(1)选择与待测成分相应的探针，确定点阵的排列方式和点样位置；(2)将对照品、探针点印于固相载体上；(3)按照制作基因芯片的常规方法进行固定、封闭、洗涤和干燥。
应用多重PCR技术的基因芯片的使用方法(1)待测样品的处理先针对样品的待测成分设计多对特异性引物，以待测的DNA或RNA样品为模板，将多对特异性引物同时加入，进行多重PCR扩增，扩增产物加入荧光标记；(2)杂交反应在点好样的基因芯片上滴加荧光标记的扩增产物，37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干；(3)反应结束后，用专业的芯片扫描分析仪对基因芯片进行结果的读取和分析。
本发明的优越性在于第一，本发明继承了基因芯片高度集成化、高效率、高准确性的优点，操作简便、自动化程度高、成本降低，能在同一时间内分析大量基因。第二，将PCR技术应用于基因芯片，从而使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片断，在短短几小时内增加106倍，极大提高了检测灵敏度。更节省所需样品的量。第三，将多重PCR技术应用于基因芯片，在同一PCR反应体系内加入多对特异性引物，一次扩增多个DNA或RNA片段，从而实现多种微量DNA或RNA的同时、快速鉴定。并进一步提高了工作效率，降低成本。第四，应用范围广，可广泛应用于生物、医学等领域。可用于基因分析、生物分型、疾病的临床诊断、分析等。第五，特异性高，检测结果稳定，可靠性高。
附图1，应用多重PCR技术的基因芯片的反应原理图。其中1-探针固定于固相载体上，2-加入带荧光标记的多重PCR产物，3-杂交结果待测DNA或RNA的多重PCR产物结合于相应的探针上。
附图2，实施例一图，将本发明用于脑膜炎多种病原体的检测附图3，实施例二图，将本发明应用于沙眼衣原体分型的检测图，其中左图为点样模式点样阵列为3×3，其中A1为阳性对照，A2为阴性对照，B1～D2依次为D～K型相应的探针。中图为检测结果为D型；右图为检测结果为K型。
具体实施例方式
如图1反应原理图，本发明应用多重PCR技术的基因芯片，特点是将与待测成分相应的探针点阵于固相载体上，固相载体表面经过封闭后，加入待测样品的多重PCR产物的荧光标记物，该荧光标记物与固相探针进行杂交反应，待测DNA或RNA的多重PCR产物结合于相应的探针上，洗去未结合的物质后，探针点的荧光强度与样品中待测成分的含量正相关。
应用多重PCR技术的基因芯片的制造方法(1)选择与待测成分相应的探针，确定点阵的排列方式和点样位置；(2)将对照品、探针点印于固相载体上；(3)按照制作基因芯片的常规方法进行固定、封闭、洗涤和干燥。
应用多重PCR技术的基因芯片的使用方法(1)待测样品的处理先针对样品的待测成分设计多对特异性引物，以待测的DNA或RNA样品为模板，将多对特异性引物同时加入，进行多重PCR扩增，扩增产物加入荧光标记；(2)杂交反应在点好样的基因芯片上滴加荧光标记的扩增产物，37℃避光温育30分钟。洗净并室温晾干；(3)反应结束后，用专业的芯片扫描分析仪对基因芯片进行结果的读取和分析。
如图2，本实施例将本发明用于脑膜炎多种病原体的检测。左图为点样模式点样阵列为3×3，其中A1为阳性对照，C2为阴性对照，A2为检测新型隐球菌探针，B1为检测结核杆菌探针，B2为检测脑膜炎双球菌探针，C1为检测嗜血流感菌探针。检测结果如中图和右图所示。中图为某病人的检测结果扫描图，该病人为脑膜炎双球菌感染；右图为另一病人的检测结果，该病人为新型隐球菌与脑膜炎双球菌共感染。
如图3，本实施例将本发明应用于沙眼衣原体分型的检测。左图为点样模式点样阵列为3×3，其中A1为阳性对照，A2为阴性对照，B1～D2依次为D～K型相应的探针。结果如中图和右图所示。中图为检测结果为D型；右图为检测结果为K型。
权利要求
1，应用多重PCR(multiplex polymerase chain reaction)技术的基因芯片，特征在于将探针点阵于固相载体上，固相载体表面经过封闭后，加入待测样品的多重PCR产物的荧光标记物，该荧光标记物与固相探针进行杂交反应，洗去未结合的物质后，探针点的荧光强度与样品中待测成分的含量正相关。
2，根据权利要求1所述的应用多重PCR技术的基因芯片，特征在于所述待测样品的多重PCR产物的荧光标记物，即为在DNA或RNA提取液中加入多对特异性引物，进行聚合酶联反应(polymerase chainreaction)，在同一反应条件下一次扩增多个DNA片段，并标记荧光。
3，根据权利要求1、2所述的应用多重PCR技术的基因芯片，特征在于在所述待测样品的多重PCR产物的荧光标记物中，待测样品可以是血清、体液、组织液、细胞裂解液等提取的含有一种以上微量DNA的样品或含有一种以上微量RNA的样品、逆转录获得的cDNA样品；所述特异性引物为与待测成分相互补的DNA片段；所述探针为待测成分相应的DNA、RNA、cDNA或寡核苷酸。
4，应用多重PCR技术的基因芯片的制造方法，特征在于(1)选择与待测成分相应的探针，确定点阵的排列方式和点样位置；(2)将对照品、探针点印于固相载体上；(3)按照制作基因芯片的常规方法进行固定、封闭、洗涤和干燥。
5，应用多重PCR技术的基因芯片的使用方法，特征在于(1)待测样品的处理先针对样品的待测成分设计多对特异性引物，以待测的DNA或RNA样品为模板，将多对特异性引物同时加入，进行多重PCR扩增，扩增产物加入荧光标记；(2)杂交反应在点好样的基因芯片上滴加荧光标记的扩增产物，37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干；(3)反应结束后，用专业的芯片扫描分析仪对基因芯片进行结果的读取和分析。
全文摘要
本发明应用多重PCR技术的基因芯片,涉及基因芯片技术,基因芯片是一种在固态基底上有序排列的核酸分子,以实现对DNA或RNA并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。可应用于生物学、医学及相关领域。本发明是将多重PCR的技术应用于基因芯片,是将探针点阵于固相载体上,固相载体表面经过封闭后,加入待测样品的多重PCR产物的荧光标记物,该荧光标记物与固相探针进行杂交反应,洗去未结合的物质后,探针点的荧光强度与样品中待测成分的含量正相关。在待测DNA或RNA量较小的情况下,可同时检测多个不同DNA或RNA片段,具有集成化程度高、灵敏度高,应用范围广,特异性高,检测结果稳定,可靠性高的特点。
文档编号C12Q1/68GK1373227SQ0114262
公开日2002年10月9日 申请日期2001年12月11日 优先权日2001年12月11日
发明者张涛, 李宾, 彭永济, 邓富桥, 任一萍, 葛海鹏 申请人:上海晶泰生物技术有限公司