基因芯片联合处理系统及相关技术的制作方法

专利名称：基因芯片联合处理系统及相关技术的制作方法
技术领域：
本发明属于基因芯片应用技术领域，特别是涉及到基因芯片的杂交，标记，洗脱，信号检测及数据分析技术。
基因芯片是近几年来刚刚兴起的基因分析技术，它是利用平行分析原理将大量不同序列的核酸分子，作为分析样品中靶基因的基因探针，以高密度阵列的方式固化在硅片，玻璃，尼龙膜等基质上，从而制作成通常意义上的基因芯片，或称为基因微阵列，微方阵(1-2)。经过短短几年的迅猛发展，为了满足不同的市场需要，在平行分析思想的指导下，基因芯片已衍生出各种不同的表现形式，如美国Affymetrix公司(3)寡聚核苷酸芯片(4)，Genomic Solutions(5)公司，Incyte(6)公司，上海联合基因科技集团(7)等生产的玻璃基因芯片(8)，用于基因表达谱的研究(9)、疾病诊断与治疗、新药研究和环境保护(4，8)。由美国的Nanogen(10)，Aclara(11)，Motorola(12)等公司生产的实验室芯片(Lab-on-a-chi补骨脂素(PS)，)以及基因膜方阵等。上述各种芯片在集成度，特异性，灵敏度，过程自动化等诸多方面各有千秋。
基因芯片应用技术发展到当今，作为最实用，最方便的一种，玻璃DNA芯片以其特异性，制造成本，规模或小批量基因芯片内容安排的灵活性与生产效率，从而为最广大的科研和工业界所采用，成为应用中的主流。这种基因芯片的制造技术已趋成熟，国内制造成本已可降低到普及化程度。我国已掌握了先进的优质基因芯片点阵技术，点制的基因芯片集成度可达每只基因芯片(18mm×36mm)16800个基因点，多种化学表面修饰(7)。而且这种基因芯片的标准化生产正逐渐在国际社会确立，其产品的批间稳定性和批内重复性已可得到很好控制。基因芯片向其最大的市场--临床诊断等实用领域--普及应用的大举挺进似乎已万事俱备，正蓄势待发。然而，从全球范围来讲，基因芯片在实用领域里的应用方面并没有像预想的那样乐观和迅速发展。综观各种形式的基因芯片应用系统，可以发现它们总在如下某个或若干方面的暴露出缺陷(1)基因芯片生化操作步骤繁杂，对操作人员的实验技术要求高在基因芯片使用中，基因分离，纯化，标记，PCR，杂交，洗脱，信号检测和数据处理等诸多复杂技术过程使得基因芯片仍然只有训练有素而且理论素养较高的专业科研人员才能掌握。而在广阔的实用领域，如医疗诊断，食品，药品等卫生检疫，法学鉴定等，一般从业人员难以达到专业科研人员的技术水平；(2)仪器和运行(指试剂盒，基因芯片等耗材价格)成本高；(3)检测灵敏度低，不能满足检测微量病毒和研究大量低丰度基因的实际要求等；
(4)系统集成化，自动化程度低，多以单个功能产品形式出现，如检测仪，判读仪，杂交仪等，难以提高用户的时效和方便程度；(5)所采用的基因芯片存在各自的问题寡聚核苷酸芯片基因密度高但假阳性也高；芯片实验室功能集成度高，特异性好而密度太低，而且还不适合于规模标准化生产；玻璃基因芯片基因密度高，特异性好，适合规模标准化生产，而配套硬件系统的功能过程自动化程度低等等。
综合分析一下，基因芯片在实用领域中的推广普及应用要求每一种基因芯片应用系统必须同时满足下面的所有必要条件(1)系统所采用的基因芯片必须特异性好，基因密度高，生产效率高，制造成本低，可实现标准化规模生产，并能达到足够高的稳定性和重复性，(2)系统本身必须功能集成度高，自动化程度高，操作简易，系统硬件及试剂盒成本低，介面友好，功能强大，技术性能稳定，(3)系统检测灵敏度必须达到足够高水平，可以满足绝大多数用户的对分析灵敏度的要求，(4)最后，充足的基因资源是所有基因芯片及其面向各实用领域的配套处理系统挺进相应市场的先决条件(面向科研和制药工业的基因芯片系统除外)。
除了最后一点依赖于人类基因组计划和后人类基因组计划的逐步完成之外，其他三个方面都是对基因芯片及其处理系统本身的要求。就本人的了解来看，在全球范围内，目前尚无任何一种基因芯片处理体系可以同时符合上述要求。因此，同时满足上述所有要求的基因芯片处理系统成为目前国际基因芯片技术领域的首要之务，同时也是基因芯片事业发展的瓶颈所在。
本发明的目的，从技术上讲，就是提供一套大幅度提升玻璃基因芯片检测灵敏度，经济实用性和可实现自动化运行的技术方法系统，并在最后提供一种实现上述功能的设备及试剂盒。其宗旨就在于提供基因芯片在社会各领域普及应用所需要的基础分子生物学处理，信号检测及结果分析系统，配套试剂盒及实用的基因芯片杂交室2。
本发明率先在基因芯片处理技术中采用聚苯乙烯荧光微球作为标记物进行分子信号放大，具体方法可以如下(1)将聚苯乙烯荧光微球通过共价键连接特异性地标记到基因芯片表面已杂交的双链核酸分子上；(2)或通过将样品中待分析的核酸连接到聚苯乙烯荧光微球上，用携带目标基因的聚苯乙烯荧光微球直接与基因芯片上的探针进行杂交，最后经过洗脱等过程后进行光学激发和信号检测。这种通过聚苯乙烯荧光微球的信号放大技术可以大大提高对基因芯片的检测灵敏度并降低其对高精度光学检测系统的要求，乃至通过零下10度到零下15度冷却CCD即可实现单分子检测的水平。再者，由于通过了信号放大，简化了基因芯片分子生物学的技术处理步骤，尤其是省去了DNA扩增的PCR过程，使整个过程可以通过温度，光和各种流体的程序化控制实现自动化，去除了各步骤人工操作带来的不确定性，同时也使实验人员从冗繁腻味的，程序性的，机械的操作中解放出来。更重要的是，该技术的采用还避免了由PCR技术过程给基因芯片分析本身所带来的特异性差，难以定量，技术操作难度大等致命问题。
本发明还首度采用了表面等离子体共振(SPR)信号激发技术实现对背景光的完全屏蔽，提高信噪比，进一步改进了信号检测效果。
本发明还在基因芯片的杂交，标记，洗脱等过程中全面引入了程序化交变电磁场作用，用于加快上述过程的效率，缩短过程所需时间。
本发明的优势不仅在于提高了基因芯片检测灵敏度，处理时效，降低成本，同时还使非专业技术人员经过简短操作培训或指导，可以利用这种高度自动化的设备进行高水平和高效率的基因分析。这一切都为基因芯片的普及化应用提供了技术推动力。
本发明从总体上分为1.基因芯片技术处理(杂交，标记，洗脱，光化反应等)系统-HCL仪及HCL试剂盒19部分，2.基因芯片光学检测(含新型基因芯片)和数据分析系统，3.基因芯片杂交室2，4.自动化全系统集成-GC基因芯片联合处理系统，5.智能芯片诊断用户介面，利用多元信号数据融合技术或多因素数据回归技术对临床诊断中基因芯片联合处理系统的工作原理本发明通过聚苯乙烯荧光微球对基因芯片上杂交了的双链核酸进行特异性标记，从而实现信号放大。HCL仪是将基因芯片检测以前所要经过的杂交，标记，洗脱等前处理步骤实现自动操作及控制的设备，在HCL仪中运行的所有生化试剂及各种溶液统称为HCL试剂盒19。基因芯片经过HCL仪处理之后，将通过信号检测和数据分析系统才能最终得到我们所要的检测结果。加上最后两个部分合称基因芯片联合处理系统(GC)。下面就各个子系统进行分述。
HCL试剂盒19HCL试剂盒19是整个GC基因芯片联合处理系统的核心。根据生化过程，可以分为以下几个程序一、基因分离，纯化在这个方面我们利用目前有市售的各种DNA，RNA，mRNA等基因纯化试剂盒，由于基因纯化，杂交缓冲液等无专利性，且不同的标本有不同的生物学处理过程，因而以原理的方式给出。大体过程如下1.生物标本的DNA或RNA(包括mRNA)的抽提2.DNA或RNA的纯化3.如RNA检测，则首先逆转录成DNA，并进行产品的纯化(合适的温度及时间)4.将DNA或逆转录后的DNA进行碱变性或高温变性5.变性后的模板在杂交液与芯片探针进行杂交(合适的温度及时间)6.杂交后进行洗脱，以清除杂交液残留。
我们将在HCL仪中加入如下技术，以提高HCL仪的处理效率(1)泳渗快速杂交通过对基因芯片点阵区域(即基因芯片杂交室2的有效杂交体系)施加交变的电场促使核酸分子(携带负电荷)在基因芯片杂交室2中做有规则的电泳运动增加靶基因与探针基因的接触机会，从而加速杂交过程。在杂交缓冲溶液的设计中，利用高离子强度柠檬酸或磷酸钠盐缓冲液在电场下所产生的较强的电渗效应(运动方向与核酸在溶液中的方向相同)进一步提高核酸分子伴随溶液整体在固相表面的运动效率。促使核酸分子以合适的速度和方式在基因芯片表面移动，将有效地提高探针与靶基因的接触机会，从而提高杂交效率。
(2)泳渗快速标记 为了达到针对基因芯片上已杂交的DNA双链进行特异性标记，我们选择可以特异性嵌入DNA双链的有机试剂4’-胺甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(补骨脂素(PS))等作为特异性嵌入核酸(DNA或RNA)互补杂交双链的“探头”部分。在330-380纳米紫外光光照下，发生与DNA双链链间共价键交联的光化学反应。反应后，将之用连接臂(L)与聚苯乙烯荧光微球(LB)进行连接，实现信号标记。或者，将补骨脂素(PS)或其衍生物直接与连接臂合成为一体。程序如下①补骨脂素(PS)-Ln+/n--SH，②补骨脂素(PS)-Ln+/n--B，③LBn+/n--Ln+/n--MAL(表面活性剂)注B为生物素，Mal-为马来酰亚胺修饰的功能团。
(3)聚苯乙烯荧光微球 聚苯乙烯荧光微球目前已有市售各种表面功能基团修饰(如胺基，羧基，羟基，磺酸基等)，含有各种激发波长(350-750nm)和发射波长(400-800nm)的荧光染料的荧光微球。粒径也可以根据需要在20nm到几十微米任意选取，相当于每个微球中分别含有102-1010个以上荧光素染料分子。我们选择的具体参数特征将根据基因芯片玻片26的表面修饰，检测灵敏度和线性范围需要，泳渗杂交及标记过程的离子电性要求，激发光源等诸多因素。比如，为了避免非特异性标记，在考虑聚苯乙烯荧光微球的表面功能基团时，需要充分考虑到基因芯片玻片26的表面功能团修饰如果玻片表面修饰基团是醛基修饰，基因芯片点样后，对未固化核酸的醛基进行封闭使其转化为羟基。那么，聚苯乙烯荧光微球的表面修饰基团最好避免羧基，而可以选择胺基或羟基。聚苯乙烯荧光微球的粒径与系统的检测灵敏度和线性检测范围的实际要求直接相关。粒径越大检测灵敏度越高而线性检测范围越窄。为满足泳渗操作，聚苯乙烯荧光微球的表面携带电荷如铵离子，咪唑，羧酸根，磺酸根阴离子，内部可包埋磁芯，以便于磁场下操作。
表面活性剂 为消除聚苯乙烯荧光微球因表面疏水作用而产生的集结，在标记试剂成分中，加入表面活性剂，并用超声波震荡使聚苯乙烯荧光微球有效地均匀分散在溶液中。为了使聚苯乙烯荧光微球表面的功能基团不被表面活性剂的分子链“淹没”起来，影响标记效率，最好选择短分子链且临界胶束浓度低的氟系列表面活性剂，如3M公司生产的FC-143，FC-129等。
HCL仪HCL仪是为了帮助HCL试剂盒19完成所需的分子生物学过程而设计的。它提供HCL试剂盒19在各个过程中所需要的温度控制，光化学反应，交变电磁场，各种溶液的程序化输送等外界条件的硬件支持。在由计算机20(上位机及软件)及单片机14(下位机CPU及其软件)所组成的自动控制系统的控制下，按对基因芯片杂交室2(控制终端)所执行的任务划分有如下几个执行系统，控制原理示意图如

图1所示。
图中各编号对应如下紫外灯1，基因芯片杂交室2，快接键3，基因芯片杂交室中的电子线路印制版接线端口4，半导体热泵5，设置于基因芯片杂交室2和半导体热泵5之间的温度探针6，用于检测工作端的温度；用于检测半导体热泵5的环境温度(空气冷或水冷时的介质温度)的温度探针7，三通8，蠕动泵泵头9，可接受单片机14指令的蠕动泵马达10，开关电源12，集成电路13，接受单片机14指令的空气制冷或水冷执行终端11，单片机14，多通道螺线管阀15，i＝1，2，3；步进马达16，步进马达伺服器17，激光器18，HCL试剂盒19，计算机20。
一、温度控制系统该系统由半导体热泵5及空气冷或水冷器件11，开关电源12，温度探针6，7等组成。利用半导体热泵5进行温度控制是根据帕尔帖效应的原理，冷端与热端之间的温度差(ΔT)与电流(I)成一定关系。温度探针7和6分别检测工作端(面向基因芯片杂交室22)和环境(面向用于散热的工作介质水或空气)的温度。
二、交变电场控制系统(见图1所示)该系统有功率放大集成电路13/三极管，接线端子，基因芯片杂交室2电子印制版PCB芯23等器件，PCB芯23的结构设计如图3所示；几组沿不同角度及方位安置的磁芯线圈等；注杂交缓冲液小孔29，印制线路板PCB芯23。
三、光控系统该系统由紫外灯1，开关量输出控制；四、流体输送系统该系统由HCL试剂盒19，多通道阀，计算机20兼容变速泵，管道，快接键3，三通8，四通等组成。
五、基因芯片杂交室2其结构设计如图2所示。
基因芯片杂交室2，由塑料上盖、不透明塑料基座、基因芯片、泳渗PCB芯等器件构成，其特征是，基座为框形结构，基因芯片玻片26正面朝上地镶嵌于基座中央，基座下部框形开口大于基因芯片玻片26正面的基因点阵区而小于基因芯片本身，使得激发光束经折射后仍能充分地覆盖基因芯片玻片26正面的基因点阵区，同时又能托住基因芯片玻片26，在基因芯片玻片26之上放置框形泳渗PCB芯，后者框内壁列有分立的金属化表面，由PCB加工过程中形成的金属化孔通过后裁制工艺形成，这些框内壁的金属化(金或银等)表面通过蚀刻出来的金属镀层线路与框外壁分立的金属化表面相连，后者作为PCB芯的外接口，与HCL仪的泳渗离子操纵部分相连，整个泳渗PCB芯、基因芯片和基座部分被一个塑料上盖盖住，液体进出通道设于塑料上盖或基座之上，而基因芯片杂交室2湿度保持缓冲液存储小孔在泳渗PCB芯上，并由塑料上盖相应位置的小孔通往外界，该小孔由一个橡皮小塞封度其出口，基因芯片自下而上分别由玻片、金属铬(1～100钠米，最佳厚度可以是3钠米)、银(或金10～1000钠米，最佳厚度可以是40、50、75钠米等)、石英(1～100钠米，最佳厚度可以是3钠米或5钠米)等镀层构成，在石英镀层表面经过硅烷化、胺基或醛基等表面修饰工艺形成可以直接固化基因分子的基因芯片玻片26，再经基因芯片点制工艺形成基因芯片。
注图2中的编号说明如下电子印制线板23(详细结构见图2)，PCB接线端口24，基因芯片杂交室底座25，基因芯片玻片26，基因芯片杂交室窗盖27，基因芯片杂交室出入口28，缓冲液小槽29，基因芯片杂交室窗盖上的玻璃窗口30，基因芯片杂交室的液体操演内腔31。
基因芯片杂交室2的结构设计目的是为了满足光，电磁，热，物流等外界各种因素对基因芯片的程序性作用。
HCL仪将用来实现如下控制要求(如下过程顺序不能变更)
1.快速杂交过程泳渗快速杂交。该过程所需要的杂交缓冲液及DNA溶液由技术人员借助于微量加液器透过基因芯片杂交室2两端的小孔中滴加到基因芯片上。并把缓冲液滴加到基因芯片杂交室2的缓冲液小槽29中。随后，通过快接健将装载有DNA杂交液的基因芯片杂交室2装入HCL仪基因芯片处理中心，进入如下自动杂交程序。
注给出参数变化范围的往往要求设计成实验室可以通过计算机20方便可调的，以方便于通过HCL样机的自动化过程找到更加优化的实验数据。HCL试剂盒19中各溶液组成分别如下No.1溶液杂交缓冲液，如5×SSC，DNA溶液，pH2.5-10.0；No.2溶液杂交洗脱液，选用传统成熟SDS洗脱配方；杂交过程，根据具体需要调整并控制温度。协同过程(1)通过电磁阀关闭基因芯片杂交室2；(2)启动交变电场系统加快杂交动力学过程；No.3溶液探针分子溶液，含有如实施例中所述的通式(I)类化合物，溶解于低于10mM的Na2HPO4缓冲液。最终溶液的pH值应在2.5-10.0范围内，而且盐浓度须确保低于20mM。该过程可以在室温下进行，持续时间从5分钟到1小时不等；No.4溶液基因芯片上非特异性或未结合探针分子的洗脱溶液。具体成分视探针分子而异；No.5溶液标记溶液，在聚苯乙烯荧光微球的表面修饰有大量与探针分子可以特异性反应的分子识别基团或免疫特异反应分子等，结构特点详见实施例。同时，为了克服聚苯乙烯荧光微球之间的粘附作用，在标记溶液的配制中加入足量的短链表面活性剂(如氟表面活性剂等)，并通过超声震荡使之形成均匀的体系。
No.6溶液洗脱溶液，使用同样浓度的上述氟表面活性剂或SDS溶液。
No.7溶液漂洗液，为三重蒸馏水，或去离子水。
(a)辐照时可以在零摄氏度下的静态系统中进行，根据辐照剂量持续时间从5分钟到60分钟不等。光源高压汞灯或RUL3500弧光灯，其与基因芯片杂交室的距离小于2厘米。350～380nm，最好365nm的UV辐射同步进行，辐射剂量约8.3-40kJ/m2；(b)风淋过程中所使用的气流经过空气滤过性设备。
SPR信号检测系统该系统利用表面等离子体共振信号激发技术，在用于生产基因芯片的玻片材料上镀上一层超薄(只有几十纳米的厚度)的金属及石英镀膜，并在所镀的石英表面上固化核酸分子，实现杂交，标记，洗脱和信号检测等必要的过程。其原理示意图如图4所示。
1.全系统由SPR信号激发，CCD信号采集以及基因芯片三个部分构成。前两个系统被设计成严格的光隔离，即被设计得相互光隔离和各自与外界的光隔离。激发光源18、平行光管、扩束镜37等的角度在设计和制造时位置与角度在整个仪器中是固定的。用户将基因芯片杂交室2放置时，其与激发光平行光束所成的角度通常不是临界角，此时主要依靠临界角伺服系统42通过步进马达(microstepper motor)16等执行器件通过求极值的方式自动调整基因芯片杂交室2的角度，使入射角达到SPR临界角，从而在基因芯片正面产生表面等离激元TM波，即表面等离子体共振波。在基因芯片正面，我们以此表面等离子体共振波为二次激发光源激发基因芯片上的基因标记物-聚苯乙烯荧光微球，从而产生基因芯片表面近距离倏逝的激发场。在此激发场中的信号载体受到激发后产生的荧光信号，被光学成像系统将这些信号聚焦并投影在CCD芯片上，从而实现由光学影象到数码信息的转换。最后，再由计算机对这些数码信息进行处理和分析。由于作为激发光源的表面等离激元是在离表面纳米到微米尺寸内作用的倏逝场，无法有效进入成像系统中成为背景噪音，而其激发产生的荧光信号却可以远离基因芯片表面而到达成像系统，所以激发光噪音可以有效屏蔽。
2.SPR信号产生系统和CCD信号采集系统二者相互且各自皆为光学密闭系统。
上述三个部分的设计要点在下面分别阐述。
3.SPR信号激发部分如图4所示，在SPR信号激发部分，通过扩束镜将激光器18发出的偏振光束平行扩束，使之平行地照射到基因芯片的背面。在用于点制基因的基因芯片玻片26表面分别镀上铬、银和石英，之后经硅烷化、功能团表面修饰，用以点制基因芯片。信号检测时，平行偏振激发光经平面棱镜47与光学匹配液48从基因芯片的背面入射，借助临界角伺服系统42调整载有基因芯片杂交室2活动托架平台49(平面棱镜47固定其中)的角度直至光能量计38检测到的反射光能量达到极小值时，临界角伺服系统42角度调节终止并使角度固定在此角度，从而使入射的激发光束与基因芯片成SPR临界角入射，致使在基因芯片正面产生表面等离子共振波，由该共振波激发基因芯片表面已标记的信号载体，从而产生荧光或相应的光学信号，利用透镜成像系统33将信号传送至CCD32并被转换成可以被计算机20记录并分析的数码信息。
图4中的编号说明电荷耦合器件CCD 32(内含CCD驱动电路和数据采集电路板)，成像系统33，基因芯片杂交室34，托架平台49，转轴(支点)35，36；扩束镜37，光能量计38，激光器18(内置准直头)，步进马达16，调角器39，开关电源40，41；临界角伺服系统42，单片机43，计算机20，SPR信号激发室44和CCD信号采集室45，偏振器46，平面棱镜47(折射率1.70)，光学匹配液48(甘油，为Cargill产品，折射率为1.70)。
2.CCD信号采集部分基因芯片的光学设计基因芯片玻片26制备及清洗步骤如下1.将折射率为1.70，表面平整度在0.5个牛顿环的玻片用镜头纸擦去表面污点及灰尘。
2.放入异丙醇及氯仿中各浸泡30分钟，然后，置入浓硫酸和双氧水(30％)混合液中(V/V，1∶1)中过夜。
3.取出后以超纯水冲洗，再放入KOH的乙醇饱和溶液中约20分钟。
4.再经超纯水冲洗，置于10％HCL的乙醇溶液中保存。
5.沉积金属膜前，用超纯水冲洗，氮气吹干，置于EDWARDS E306A真空镀膜机中溅射沉积金属膜依次沉积3纳米钛，50纳米银，10纳米二氧化硅薄膜。
6.将此基片按半导体材料的清洗步骤进行清洗，再放入HF稀溶液中处理2分钟，取出后用蒸馏水反复冲洗，之后在氮气下干燥。
基因芯片玻片26的表面修饰步骤如下1.将基片浸入到APTES(APTES是γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，东京化成)的苯溶液中(10-1mmol/l)反应6小时，取出后用甲苯，丙酮清洗，同时用氮气吹干。
2.将基片浸入含有1％戊二醛(戊二醛，上海化学试剂站分装。其余试剂皆国产分析纯)的PBS缓冲液中(pH7.2，0.05M)反应2小时。
3.活化的载体用丙酮，乙醇，及蒸馏水冲洗，并在氮气下干燥。
由于在玻璃或石英表面固化核酸的工艺很多，且已十分成熟，可以保障核酸的牢固连接，密度可调，此处缩略。
基因芯片玻片26的点制该部分技术因无专利性，属常规技术，因而不再赘述。
除表面镀铬、金、银等金属膜外再镀石英薄膜之外，也可以免去在金或银表面再镀石英，而是直接固定核酸的方法。因为在金表面固定核酸的技术已比较成熟，因而，不再赘述。
数据分析系统 现在基因芯片数据分析软件市场上种类很多，因此，这方面以购买为主。
发明与
背景技术：
相比的有益效果本发明与背景技术相比的有益效果有如下几个方面1、系统对基因芯片的检测灵敏度高，信噪比高，可以满足绝大多数科研和实用领域对灵敏度方面的极高要求，有利于推动基因芯片在临床诊断、工商检疫和环境检测等方面的普及应用，2、系统处理过程集成化程度高，集杂交，标记，洗脱，信号检测及数据处理等于一体，使专业技术人员的处理效率提高，同时也降低了对非专业技术人员的专业技术要求，提高了基因芯片使用中结果的重复性和稳定性，3、系统对基因芯片处理的效率高，由于在杂交，标记，洗脱等过程中采用了(交变)电泳，电渗技术，使上述基因芯片处理中的主要过程的时效大大提高，4、系统成本及运行成本低廉，适合于基因芯片的普及应用，5、系统适用于玻璃基因芯片，并有利于该种基因芯片普及化应用，成为各种基因平行检测技术中的主流产品。
实施例关于HCL试剂盒成分的说明基因芯片杂交信号放大标记技术中，有两类试剂必须提到。它们分别是在基因芯片经过杂交过程之后，作为与基因芯片上互补配对的核酸杂交双链在一定条件下可以特异性结合的探针分子化合物(I)，以及作为聚苯乙烯荧光微球对连接有探针分子的杂交双链核酸进行荧光信号标记的化合物(II)。它们的结构特征分别是化合物(I)补骨脂素(PS)-L1-A，化合物(II)FB(-L2-A’)n，其中，一、补骨脂素(PS)-表示4’-胺甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(4’-hydroxymethyl-4，5’，8-trimethyl补骨脂素(PS)oralen或4’-aminomethyltrioxalen，简写补骨脂素(PS))；二、A-和A’-是指任何一对具有某种化学反应或相互作用特异性探针分子接头，它们可以是下列情况之一(1)化学反应特异性功能团对；(2)免疫反应对；(3)其它形式的特异性分子识别相互作用对；三、-L1-和-L2-表示水溶性连接臂，如PEG、肽链、碳水化合物链等；四、FB表示聚苯乙烯荧光微球，其表面修饰有可以与化合物(I)中的探针分子接头A-特异性反应的功能团或作用对A’-。
以下通过若干实施例就各种不同情景组合进行阐述。
实例一 用表面抗生物素蛋白标记的荧光微球的标记法借助于生物素的特异性分子识别能力，将生物素与补骨脂素(PS)通过连接臂合成为生物素化的分子，简称BPEOP。从而达到用生物素标记已经杂交成双链的核酸分子的目的，同时又利用补骨脂素(PS)加固了杂交双链的结合强度。BPEOP作为No.3溶液中的核心成分，通过光化学交联反应对双链核酸进行标记。之后，选用有市售的抗生物素蛋白化的高分子(如聚苯乙烯等)荧光微球(SIGMA公司，分子探针(Molecular Probes)公司等生产的FluoroSpheres)作为聚苯乙烯荧光微球和No.4溶液中的核心成分。
可以直接购买有市售的BPEOP产品(+)-生物素-PEO4-补骨脂素C33H44N4SO10；Mr＝688.79；mp 98-100 实例二 用补骨脂素-生物素进行标记利用Schleicher & Scheull公司生产的补骨脂素-生物素(美国专利U.S.Patent#4,599,303)进行标记。过程如下(1)将基因芯片杂交室在90摄氏度下温育10分钟，(2)在基因芯片杂交室杂交后，快速降温至-20～0摄氏度以冰镇之，2～5分钟之后，开始时以3ml/min的流速泵入补骨脂素-生物素探针溶液，约30秒之后以0.06～1ml/min的流速泵入，并在冰镇条件下持续接受辐照1～60分钟；(3)将温度设置为室温，终止辐照，以1～10000ml/min的流速泵入正丁醇的dH2O饱和溶液10秒到30分钟，之后泵入乙醚的dH2O饱和溶液；(4)室温下，以0.1～5000ml/min的流速泵入表面抗生物素蛋白修饰的荧光微球(SIGMA公司或Molecular Probes公司产品)的标记溶液10～30000秒；(5)室温下以ml/min的流速持续1～1000秒泵入dH2O洗脱液。
实例三 用表面生物素化的荧光微球标记法用有市售的表面生物素化的荧光微球(Molecular Probes公司的FluoroSpheres)进行标记。此时，合成连接臂的一端是抗生物素蛋白，另一端是补骨脂素(PS)。
实例四 巯基标记法
巯基特异性反应功能团有马来酰亚胺。合成核酸探针时，用(离子化的)亲水连接臂(如人工合成多肽链，聚乙二醇(PEG)等)将补骨脂素与巯基或马来酰亚胺连接起来，形成“探头-连接臂-接头A”模式的链状分子。
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有关说明书附图的图面说明附图1、HCL仪控制原理示意图附图2、基因芯片杂交室结构设计图附图3、基因芯片杂交室在HCL仪中的装载示意图附图4、SPR信号检测系统原理示意图
权利要求
1.一种基因芯片杂交信号放大标记技术，它是在基因芯片经过杂交过程之后，利用化合物(I)作为互补配对的核酸杂交双链特异性探针分子，而利用化合物(II)作为聚苯乙烯荧光微球对连接有探针分子的杂交双链核酸进行标记，化合物(I)结构特征为补骨脂素-L1-A，化合物(II)结构特征为FB(-L2-A’)n，其中，A-和A’-是指任何一对具有某种化学反应或相互作用特异性探针分子接头，它们可以是下列情况之一(1)巯基和马来酰亚胺基；(2)生物素和抗生物素蛋白，-L1-为PEO，-L2-表示水溶性连接臂，FB表示聚苯乙烯荧光微球，其表面修饰有可以与化合物(I)中的探针分子接头A-特异性反应的功能团或作用对A’-，利用化合物(I)处理基因芯片上杂交双链核酸的方法特征为在杂交过程完成后，在-50～100摄氏度的温度条件下将含有化合物(I)浓度为0.001mM～10M的溶液导入基因芯片杂交室2中持续时间为20个小时以内，在紫外光照下发生该化合物在核酸双链中的链间共价交联反应，从而实现其与双链核酸的特异性共价连接，利用化合物(II)进行信号标记的方法特征为在化合物(I)与双链核酸实现共价连接之后，导入含有化合物(II)的溶液，持续1～100000秒时间，然后对非特异性吸附进行洗脱。
2.一种根据权利要求1制作的基因芯片信号标记和放大试剂盒，即HCL试剂盒19，包含了基因芯片处理各过程所需要的全部生化试剂，含有如下组分化合物(I)，化合物(II)。
3.一种根据权利要求1和权利要求2制作的主要从事基因芯片的杂交、标记、洗脱等分子生物学过程处理的HCL仪，主要由单片机14自动控制系统和各执行器件构成，其中温度自动控制依靠单片机14的模拟量控制和半导体制冷器5等执行器件构成，对流体自动给排系统中各泵、阀门等以及紫外灯1的控制依靠开关量控制，其原理是根据基因芯片所必须经过的杂交、光交联反应、标记、洗脱等过程，程序性地对基因芯片杂交室中的基因芯片进行加热到某一温度，并恒温控制某时间长度、制冷至某一温度并恒温、输送不同溶液、紫外灯照射等。
4.一种基因芯片信号检测技术，它是利用激光表面等离激元共振(SPR)技术，屏蔽激发光和背景光对信号的干扰的，在用于点制基因的基因芯片玻片26表面分别镀上铬、银和石英，之后经硅烷化、功能团表面修饰，用以点制基因芯片，在信号检测时，平行偏振激发光经平面棱镜47与光学匹配液48从基因芯片的背面入射，借助临界角伺服系统42调整托着基因芯片杂交室2并固定有平面棱镜47的托架49的角度直至能量计38检测到的反射光达到极小值并固定于该角度，从而使激发光束与基因芯片成SPR临界角入射，致使在基因芯片正面产生表面等离激元TM波，由该波激发基因芯片表面已标记的信号载体，从而产生荧光或相应的光学信号，利用透镜成像系统33将信号传送至CCD32并被转换成可以被计算机20分析的数码信息。
5.一种根据权利要求4制作的SPR-CCD信号检测和数据处理系统，该系统有SPR信号产生系统和CCD信号采集及数据分析系统等部分，其中SPR信号产生系统由激光18等激发光源、平行光管或准直头等、偏振镜46、扩束镜37、临界角伺服系统42、步进马达16、基因芯片杂交室2、单片机43等器件组成，其特征是，激发光源18、平行光管、扩束镜37等的角度在设计和制造时位置与角度在整个仪器中是固定的，用户将基因芯片杂交室2放置时，其与激发光平行光束所成的角度通常不是临界角，此时主要依靠临界角伺服系统42通过步进马达16等执行器件通过求极值的方式自动调整基因芯片杂交室2的角度，使入射角达到SPR临界角，从而在基因芯片正面产生表面等离激元TM波，即表面等离子体共振波，在基因芯片正面，我们以此表面等离子体共振波为二次激发光源激发基因芯片上的基因标记物---高荷信号载体，从而产生基因芯片表面近距离倏逝的激发场，在此激发场中的信号载体受到激发后产生的荧光信号，被光学成像系统将这些信号聚焦并投影在CCD芯片上，从而实现由光学影象到数码信息的转换，最后，再由计算机对这些数码信息进行处理和分析，由于作为激发光源的表面等离激元是在离表面纳米到微米尺寸内作用的倏逝场，无法有效进入成像系统中成为背景噪音，而其激发产生的荧光信号却可以远离基因芯片表面而到达成像系统，所以激发光噪音可以有效屏蔽，SPR信号产生系统和CCD信号采集系统二者相互且各自皆为光学密闭系统，即，以基因芯片杂交室2及其托架平台49为分界线的SPR信号激发室44(处于基因芯片反面一侧，即基因芯片未点制基因方阵的一侧)和CCD信号采集室45(基因芯片正面一侧，即基因芯片点制基因方阵的一侧)在物理空间上二者之间是光学隔离的，即在仪器设计和制造中，二者各自为光学密闭且隔离空间，SPR信号激发室44中的背景光和激发光无法通过散射、反射、折射等各种途径泄露到CCD信号采集室45中，从而不对基因芯片正面SPR激发所产生的信号造成噪音干扰。
6.一种基因芯片交变电场泳渗溶液体系操纵技术，它是根据带电离子和高离子强度溶液在电场中可以进行定向运动的原理，通过在基因芯片杂交室周围施加交变电场从而促使其中的溶液或离子进行所要求的定向运动，有利于提高杂交、标记甚至洗脱过程的效率。
7.根据权利要求6所述的技术制作成的基因芯片泳渗溶液体系操纵系统，它含有基因芯片杂交室2中的PCB芯23、交变电场驱动电路----单片机、功率放大集成电路及接线端子等组成部分，其特征是，在基因芯片杂交室2中基因芯片杂交区设置一个框形PCB芯23，其厚度由杂交腔的大小决定，沿框形结构的内壁上设置有若干数目纵向分立的镀金电极，它们通过PCB芯23的上下两个表面上的镀金导线通向两旁外壁的两排接口电极，PCB芯23内壁上的镀金电极与外壁上的接口电极一一对应，通过PCB芯23的上下表面上的镀金导线相连，电极数目取决于交变电场调控的需要，PCB芯23制造按照电子线路印制板PCB的专用Protel设计软件设计和蚀刻生产工艺生产，PCB芯23框形结构中杂交区的交变电场由单片机产生交变电压信号并经功率放大集成电路等电子器件放大产生，最后通过接线端子传送至PCB芯23，并最终将交变电场施加到基因芯片表面的杂交区域。
8.一种根据权利要求1-7所述的要求设计而成的基因芯片杂交室2，由塑料上盖27、不透明塑料基座25、基因芯片26、泳渗PCB芯23等器件构成，其中基座25为框形结构，基因芯片玻片正面朝上地镶嵌于基座25中央，基座25下部框形开口大于基因芯片玻片正面的基因点阵区而小于基因芯片25本身，使得激发光束经折射后仍能充分地覆盖基因芯片玻片正面的基因点阵区，同时又能托住基因芯片玻片，在基因芯片玻片之上放置框形泳渗PCB芯23，后者框内壁列有分立的金属化表面，由PCB加工过程中形成的金属化孔通过后裁制工艺形成，这些框内壁的金或银等金属化表面通过蚀刻出来的金属镀层线路与框外壁分立的金属化表面相连，后者作为泳渗PCB芯23的外接口，与HCL仪的泳渗离子操纵部分相连，整个泳渗PCB芯23、基因芯片26和基座25部分被一个塑料上盖27盖住，液体进出通道设于塑料上盖27或基座25之上，而基因芯片杂交室2湿度保持缓冲液存储小孔29在泳渗PCB芯23上，并由塑料上盖27相应位置的小孔通往外界，该小孔由一个橡皮小塞封堵其出口，基因芯片自下而上分别由玻片、金属铬(1～100钠米，可以是3钠米)、银(或金10～1000钠米，可以是40、50、75钠米等)、石英(1～100钠米，可以是3钠米或5钠米)等镀层构成，在石英镀层表面经过硅烷化、胺基或醛基等表面修饰工艺形成可以直接固化基因分子的基因芯片玻片，再经基因芯片点制工艺形成基因芯片26，基因芯片表面也可以仅分别镀一层铬和金，无须镀一层石英膜，之后直接在金表面固定核酸分子，点制基因芯片。
9.一种基因芯片联合处理系统，该系统分别有主要从事基因芯片在泳渗溶液体系操纵系统作用下进行杂交、标记、洗脱等分子生物学过程高效处理的HCL仪、HCL仪专用的HCL试剂盒19、基因芯片杂交室2和主要从事基因芯片的信号激发、产生、采集、数据处理和结果分析的SPR-CCD信息检测和数据处理系统等几个部分。
10.一项关于权利要求9中的基因芯片联合处理系统应用的权利要求，它可以应用于下列领域的基因分析各种基因组研究、教学、药物筛选基因组研究、各种临床诊断基因分析、各种工商、医疗卫生用品及环境检疫、疫情调查或普查、各种法学基因身份鉴定、血液安全检查、国防领域的防生物战剂等。
全文摘要
本发明属于基因芯片应用技术领域，特别涉及到基因芯片的杂交，标记，洗脱，信号检测及数据分析技术。本发明提供一整套通过聚苯乙烯荧光微球、补骨脂素进行的基因芯片杂交信号的特异性放大标记技术，该技术可以将基因芯片上的杂交信号扩大几个数量级以上，从而将杂交核酸的检测能力提升到单分子水平。本发明还提供了一种提高上述各反应过程中溶液和分子运动操纵效率的泳渗离子及溶液体系操纵技术以及用于高效屏蔽背景光或激发光噪音的表面等离子体共振激发技术。作为这些技术的一种最佳应用的组合——基因芯片联合处理系统有自动实现各反应过程的HCL仪、HCL试剂盒19、基因芯片杂交室2和SPR－CCD信号检测及数据处理系统等几部分。其优势在于系统及其运行成本都很低、过程联合处理能力较高，操作简易，因而为基因芯片在临床诊断、工商及环境检疫、制药和国防等领域的普及应用提供了可行的技术条件。
文档编号C12Q1/68GK1492051SQ0114265
公开日2004年4月28日 申请日期2002年10月4日 优先权日2002年10月4日
发明者宋克, 宋 克 申请人:宋克, 宋 克