发酵制备l－苏氨酸的方法

专利名称：发酵制备l－苏氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及使用肠杆菌科细菌经发酵制备L-苏氨酸的方法，该细菌中棒状细菌(coryneform bacteria)的thrE基因被增强。
现有技术L-苏氨酸用于动物营养，人的药物及制药工业。已知L-苏氨酸可通过肠杆菌科菌株，尤其大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的发酵而生产。由于它们极其重要，不断进行改良制备方法的尝试。方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形成的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法。以此方法可获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)，或有重要的调节氨基酸营养缺陷的并产生L-苏氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于生产L-苏氨酸的肠杆菌科菌株改良，其通过扩增各个苏氨酸生物合成基因，并研究对L-苏氨酸生产的作用而改良。
发明目的本发明人目的在于提供新的措施以改良L-苏氨酸的发酵制备。
发明描述本发明提供了使用尤其是已生产L-苏氨酸的肠杆菌科细菌发酵生产L-苏氨酸的方法，在该肠杆菌科细菌中，棒状细菌的编码thrE基因的一或多个核苷酸序列被增强，尤其是过表达。
特别地，所述方法是一种生产L-苏氨酸的方法，其包括以下步骤a)发酵肠杆菌科的微生物，其中至少棒状细菌的thrE基因被增强(过表达)，任选地与其它基因组合增强，b)浓缩培养基或肠杆菌科微生物的细胞中的L-苏氨酸，和c)分离所述L-苏氨酸。
文中术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性提高，例如通过提高基因的拷贝数，用强启动子或编码高活性相应酶或蛋白质的基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明提供的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中制备L-苏氨酸。所述微生物可以是肠杆菌科的代表菌，尤其是埃希氏菌属和沙雷氏菌属。在埃希氏菌属和沙雷氏菌属中尤其应提及的是粘质沙雷氏菌。
适当的生产L-苏氨酸的埃希氏菌属菌株，尤其大肠杆菌菌株例如是大肠杆菌 TF427大肠杆菌 H4578大肠杆菌 KY10935大肠杆菌 VNIIgenetika MG-442大肠杆菌 VNIIgenetika M1大肠杆菌 VNIIgenetika 472T23大肠杆菌 BKIIM B-3996大肠杆菌 kat 13大肠杆菌 KCCM-10132适当的生产L-苏氨酸的沙雷氏菌属菌株，尤其粘质沙雷氏菌菌株例如是粘质沙雷氏菌 HNr21
粘质沙雷氏菌 TLr156粘质沙雷氏菌 T2000已经发现编码苏氨酸输出的棒状细菌thrE基因过表达后，肠杆菌科以改良的方式产生L-苏氨酸。
棒状细菌thrE基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO1和SEQ IDNO3，输出蛋白的所得氨基酸序列示于SEQ ID NO2和SEQ IDNO4。
SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示thrE基因可以根据本发明使用。得自遗传密码简并或归因于中性功能有义突变的棒状细菌thrE基因的等位基因也可以使用。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-苏氨酸发酵生产期间提高表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的降解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
以下文献中可发现对此的详述，参见Chang和Cohen(细菌学杂志1341141-1156(1978))，Hartley和Gregori(基因13347-353(1981))，Amann和Brosius(基因40183-190(1985))，Broer等(美国国家科学学报8021-25(1983))，LaVallie等(生物/技术11，187-193(1993))，PCT/US97/13359，Llosa等(质粒26222-224(1991))，Quandt和Klipp(基因80161-169(1989))，Hamilton(细菌学杂志1714617-4622(1989)，Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58，191-195(1998)，及已知的关于遗传和分子生物学的教材中。
可以使用能在肠杆菌科中复制的质粒载体，如衍生自pACYC184(Bartolome等，基因102，75-78(1991))，pTrc99A(Amann等，(基因69301-315(1988))，或pSC101衍生物(Vocke和Bastia，美国国家科学院院报80(21)6557-6561(1983)的克隆载体。用一种质粒载体转化的菌株可以用于本发明的方法中，所述质粒载体携带编码棒状细菌thrE基因的核苷酸序列。
另外，除棒状细菌thrE基因之外，过表达已知苏氨酸的生物合成途径的一或多种酶，或补缺代谢的酶或产生还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶，对用肠杆菌科菌株生产L-苏氨酸可以是有益的。因此，例如以下基因可以同时增强，尤其是过表达·编码天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子(US-A-4278765)，或·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19 831 609)，或·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(分子和普通遗传学231332(1992))，或·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(基因31279-283(1984))，或·编码转氢酶的pntA和pntB基因(欧洲生物化学杂志158647-653(1986))，或·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(基因27193-199(1984))，或·授予L-高丝氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0994190)。
除过表达thrE基因之外，排除非所需的副反应，例如苏氨酸脱氢酶，对L-苏氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦英国，1982，及Bell和Turner，生物化学杂志156，449-458(1976))。根据本发明，可以应用至少部分消除了降低L-苏氨酸形成的代谢途径的细菌。
根据本发明产生的微生物可通过分批法(分批培养)，或补料分批法(补料方法)进行培养。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物方法技术入门，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C..USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以控制PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在25℃～45℃，优选30℃-40℃。持续培养直至L-苏氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
L-苏氨酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经过如Spackman等(分析化学30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生作用进行，或者可以通过反向HPLC进行，如Lindroth等(分析化学(1979)511167-1174)所述。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)·黄色短杆菌菌株DM368-2 pZlthrE，保藏号DSM 12840。
质粒pZlthrE含有谷氨酸棒杆菌ATCC13032的thrE基因。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详细阐述。
从大肠杆菌中分离质粒DNA，及进行限制，Klenow和碱性磷酸酶处理的所有技术，均是通过Sambrook等(分子克隆实验操作指南(1989)，冷泉港实验室出版社)所述方法进行。转化大肠杆菌是通过Chung等(美国科学院院报(1989)862172-2175)所述方法进行。
在制备大肠杆菌菌株和转化体期间的孵育温度是37℃。在Hamilton等所述(细菌学杂志(1989)1714617-4622)基因置换过程中，使用的温度是30℃和44℃。实施例1 谷氨酸棒杆菌ATCC 14752的thrE基因的克隆和测序1、转座子诱变和突变体选择用转座子Tn5531诱变谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752ΔilvA，其序列存于国立生物技术信息中心(Bethesda，USA)的核苷酸数据库，登录号为U53587。通过Schafer等所述的基因交换系统，在谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752的ilvA基因中掺入一个缺失(基因(1994)14569-73)。为此，使用Sahm等(应用及环境微生物学(1999)651973-1979)构建的灭活载体pK19mobsacBΔilvA进行缺失。首先用200ng载体pK19mobsacBΔilvA转化得自Stratagene(德国海德堡)的甲基化酶缺陷的大肠杆菌菌株SCS110(Jerpseth和Kretz，分子生物学策略6，22(1993))。在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上借助于其卡那霉素抗性，鉴别转化株。所述质粒pK19mobsacBΔilvA是从所述转化株之一中制备的。通过电穿孔法(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61329-334)，将这个灭活的质粒导入谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752中。在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂平板上借助于其卡那霉素抗性，鉴别其中所述灭活质粒整合入基因组中的克隆(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65<<299-304)。为选择所述载体的切除，将卡那霉素抗性克隆铺板于含有蔗糖的LBG培养基上(具有15g/L琼脂，2％葡萄糖和10％蔗糖的LB培养基)。这提供了通过二次重组再一次丧失所述载体的菌落(Jager等，细菌学杂志(1992)1745462-5465)。通过转移接种于具有和不具有300mg/LL-异亮氨酸，或者具有和不具有50μg/ml卡那霉素的基本培养基平板上(具有15g/L琼脂的CGXII培养基(Keilhauer等，细菌学杂志(1993)1755595-5603))，分离6个由于所述载体的切除所致的卡那霉素敏感性和异亮氨酸营养缺陷型克隆，其中基因组中目前存在不完整的ilvA基因(ΔilvA等位基因)。将这些克隆之一称为菌株ATCC14752ΔilvA，并用于转座子诱变。
含有组合的转座子Tn5531的质粒pCGL0040(

图1)(Ankri等，细菌学杂志(1996)1784412-4419)是从甲基化酶缺陷的大肠杆菌菌株GM2929pCGL0040(大肠杆菌GM2929Palmer等，基因(1994)1431-12)中分离的。经电穿孔法(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61329-334)用质粒pCGL0040转化谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752ΔilvA。通过在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂板(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65299-304)上的卡那霉素抗性鉴别转座子Tn5531已整合进基因组的克隆。以此方式获得2000个克隆，研究它们在苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸存在下的延迟生长。为此，将所有克隆单独转移至具有和不具有2mM苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸的CGXII基本培养基琼脂板上。该培养基与Keilhauer等(细菌学杂志(1993)1755593-5603)所述的CGXII培养基相同，但另外含有25μg/ml卡那霉素，300mg/L L-异亮氨酸和15g/L琼脂。Keilhauer等所述的该培养基的组成见表1。
表1培养基CGXII的组成
琼脂板在30℃保温，并在12、18和24小时后检查生长。获得一转座子突变体，其在缺少苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸时以与起始菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14752ΔilvA相比相当的方式生长，但在存在2mM苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸时生长延迟。将其命名为ATCC14752ΔilvAthrE∷Tn5531。2、ATCC14752ΔilvA thrE∷Tn5531中Tn5531插入位点的克隆和测序为克隆实施例1.1中所述的突变体的转座子Tn5531上游的插入位点，首先如Schwarzer等(生物/技术(1990)984-87)所述分离这一突变体菌株的染色体DNA，并用限制性内切酶EcoRI切割400ng该染色体DNA。将完全限制酶切的产物连接进同样用EcoRI线性化的载体pUC18(Norander等，基因(1983)26101-106，RocheDiagnostics，Mannheim，德国)。然后将连接混合物经电穿孔(Dower等，核酸研究(1988)166127-6145)转化进大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant等，1990，美国科学院院报874645-4649)。经在含有50μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上的羧苄青霉素和卡那霉素抗性，鉴别转化株，其中转座子Tn5531的插入位点克隆于载体pUC18上。从3个转化体中制备质粒并经限制分析确定克隆插入的大小。用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)745463-5467)确定具有约5.7kb大小插入片段的一个质粒上的插入位点的核苷酸序列。为此，从下列寡核苷酸引物开始测序2.2kb插入片段5＇-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3＇。
为鉴别转座子下游的插入位点，用限制性内切酶XbaI切割突变体的染色体DNA并连接进已用XbaI线性化的载体pUC18中。其余的克隆操作如上所述。用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)745463-5467)确定具有约8.5kb大小插入片段的一个质粒上的插入位点的核苷酸序列。为此，从下列寡核苷酸引物开始测序0.65kb插入片段5＇-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3＇。
用Lasergene软件包(用于Windows的生物计算软件，DNASTAR，Madison，USA)分析和组装获得的核苷酸序列。这一核苷酸序列再现为SEQ ID NO1。分析鉴别了长度为1467bp的一个开放阅读框架。相应的基因命名为thrE。相关的基因产物包括489个氨基酸并再现为SEQ ID NO2。实施例2 从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中克隆和测序thrE基因将thrE基因克隆进大肠杆菌克隆载体pUC18(Norrander等，基因(1983)26101-106，Roche Diagnostic，曼海姆，德国)中。克隆以两步进行，首先用衍生自SEQ ID NO1的下述寡核苷酸引物经聚合酶链反应(PCR)扩增来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因。
thrE-正向5＇-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3＇
thrE-反向5＇-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3＇PCR反应在存在200μM脱氧核苷酸三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1μM相应寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，1/10体积的10×反应缓冲液和2.6单位的热稳定Taq/PwoDNA聚合酶混合物(来自Roche Diagnostics的延伸高保真性PCR系统，曼海姆，德国)下，在一热循环仪(PTC-100，MJ研究公司，Watertown，USA)中在如下条件下进行30个循环94℃30秒，58℃30秒和72℃2分钟。
然后用SureClone连接试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)，根据厂商指导将约1.9kb大小的扩增片段连接进载体pUC18的SmaI限制位点中。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant等，1990，美国科学院院报874645-4649)。经在含有50ug/ml羧苄青霉素的LB琼脂板上的羧苄青霉素抗性鉴别转化体。从8个转化子中制备质粒并经限制分析确定1.9kb PCR片段的插入片段的存在。以下将以此得到的重组质粒命名为pUC18thrE。
用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)745463-5467)确定质粒pUC18thrE中的1.9kb PCR片段的核苷酸序列。为此，用Roche Diagnostics(曼海姆，德国)的下述引物测序pUC18thrE的完整插入片段。
通用引物5＇-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3＇反向引物5＇-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3＇所得核苷酸序列再现为SEQ ID NO3。用Lasergene软件包(用于Windows的生物计算软件，DNASTAR，Madison，USA)分析所获得的核苷酸序列。数据分析的结果是鉴别了一个长度为1467bp的开放阅读框架，将其命名为thrE基因。其编码一个489个氨基酸的多肽，再现为SEQ ID NO4。实施例3 谷氨酸棒杆菌thrE基因的表达将实施例2所述的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的thrE基因克隆在载体pZ1中表达(Menkel等，应用和环境微生物学(1989)64549-554)。为此，用限制酶SacI和XbaI将质粒pUC18thrE切割为含有thrE基因的大小为1881bp的一个DNA片段。将此片段的5’和3’末端用Klenow酶处理。将所得DNA片段在载体pZ1中连接，所述载体预先用ScaI线性化并去磷酸化。将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant等，美国科学院院报(1990)874645-4649)用全部连接混合物转化。经在含有50ug/ml卡那霉素的LB琼脂板上的卡那霉素抗性鉴别转化体。从2个转化体中制备质粒并经限制分析确定1881bp的ScaI/XbaI片段的插入片段的存在。以此方式形成的重组质粒命名为pZ1thrE(图2)。
经电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61329-334)，将质粒pZ1thrE导入形成苏氨酸的黄色短杆菌菌株DM368-2中。菌株DM368-2的描述见EP-B-0 385 940，保藏号为DSM5399。通过在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂平板上的卡那霉素抗性(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65299-304)鉴别转化体。以此方式获得黄色短杆菌菌株DM368-pZ1thrE。实施例4构建表达质粒pTrc99AthrE将实施例2所述的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032的thrE基因克隆在载体pTrc99A中以在大肠杆菌中表达，其得自Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)。为此，将载体pUC18thrE用酶SalI切割，并用Klenow酶处理突出的3’末端。在用酶KpnI限制后，将切割物在0.8％琼脂糖凝胶中分离，并借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)分离大小为1.9kbp的thrE片段。将载体pTrc99A用酶EcoRI切割，将3’末端用Klenow酶处理，用酶KpnI切割并和分离的thrE片段连接。将连接物转化入大肠杆菌菌株DH5α中。在加入了50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，病毒学1190(1995))上选择携带pTrc99A的细胞。在质粒DNA分离及用XbaI，BamHI，EcoRI，HindIII和SspI对照切割之后，可以表明thrE基因的成功克隆。将所得质粒命名为pTrc99AthrE(图3)。实施例5用菌株MG442/pTrc99AthrE制备L-苏氨酸产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442见于专利说明书US-A-4278765所述，并保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，俄罗斯)，保藏号为CMIM B-1628。
将菌株MG442用质粒pTrc99AthrE转化，并在具有50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。然后将选择的各个菌落在基本培养基上进一步增殖，所述培养基具有以下组分3.5g/lNa2HPO4*2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。在100ml的锥形瓶中含有的10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。为此，接种含有以下组分的10ml预培养基2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4*7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，50mg/l氨苄青霉素，并在得自Kuhner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR孵育器上，在37℃和180rpm孵育16小时。将250ul此预培养物转接种于10ml生产培养基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4*7H2O，0.03g/lFeSO4*7H2O，0.018g/l MnSO4*1 H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖)，并将此混合物在37℃孵育48小时。为诱导thrE基因表达，将200mg/l异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入平行分批培养物中。在孵育后，用Dr.Lange(德国柏林)的LP2W光度计，在660nm测定波长测定培养物悬浮液的光密度(OD)。
然后在过滤灭菌的培养上清中，用Eppendorf-BioTronik(德国Hamburg)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和具有茚三酮检测的后柱反应，测定形成的L-苏氨酸的浓度。
该实验结果示于表2。
表2
实施例6用菌株B-3996kurAtdh/pVIC40，pMW218thrE制备L-苏氨酸产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株B-3996见于US-A-5175107所述，并保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，俄罗斯)。
6.1在质粒载体pMW218中克隆thrE基因将实施例4所述的质粒pTrc99AthrE用酶SspI切割，将切割产物在0.8％琼脂糖凝胶中分离，并借助于“QIAquick凝胶提取试剂盒”(QIAGEN，Hilden，德国)分离大小为2.5kbp的DNA片段，其除了thrE基因之外还含有trc启动子区域和rRNA终止子区域。将质粒pMW218(Nippon基因，Toyama，日本)用酶SmaI切割，并与所述thrE片段连接。将大肠杆菌菌株DH5α用连接产物转化，并通过铺板于加入20ug/ml卡那霉素的LB琼脂上选择携带pMW218的细胞。在分离质粒DNA及用HindIII和ClaI对照切割后，可以证实所述thrE基因的成功克隆。所述质粒称为pMW218thrE(图4)。
6.2制备菌株B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE在无抗生素的完全培养基中培养大约10个子代后，分离不再包含质粒pVIC40的菌株B-3996的衍生物。所形成的菌株是对链霉素敏感的，并称为B-3996kur。
使用Hamilton等所述方法(细菌学杂志(1989)1714617-4622)将一个缺失掺入tdh基因，所述方法是基于使用具有温度敏感性复制子的质粒pMAK705。质粒pDR121(Ravnikar和Somerville，细菌学杂志(1987)1694716-4721)含有一个来自大肠杆菌的大小为3.7kbp的DNA片段，所述DNA片段编码tdh基因。为在tdh基因区域产生一个缺失，将pDR121用限制酶ClaI和EcoRV切割，及在用Klenow酶处理后连接分离的大小为5kbp的DNA片段。将连接产物在大肠杆菌菌株DH5α中转化，并在加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
tdh基因的成功缺失可以在分离质粒DNA及用EcoRI对照切割后证实。分离大小为1.7kbp的EcoRI片段，并与用EcoRI部分消化的质粒pMAK705连接。将连接产物在DH5α中转化，并在加入20ug/ml氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。成功的克隆在分离质粒DNA和用EcoRI切割后得以证实。所形成的pMAK705衍生物称为pDM32。
针对基因置换，将B-3996kur用质粒pDM32转化。通过Hamilton等所述选择方法进行用质粒编码的缺失构建体置换染色体tdh基因，并通过标准PCR方法证实(Innis等，(1990)PCR方案，方法和应用指导，科学出版社)，使用以下寡核苷酸引物tdh15’-TCGCGACCTATAAGTTTGGG-3’tdh25’-AATACCAGCCCTTGTTCGTG-3’测试形成的菌株的卡那霉素敏感性并称为B-3996kurΔtdh。
将B-3996 kurΔtdh用分离自B-3996的质粒pVIC40转化，并在补加20ug/ml链霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。将一个选择的单独菌落称为B-3996kurΔtdh/pVIC40，并用质粒pMW218thrE转化。在加入20μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上进行选择。以此方式形成的菌株称为B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE。
6.3制备L-苏氨酸如实施例5所述测试由菌株B-3996kurΔtdh/pVIC40及B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE制备的L-苏氨酸情况。针对B-3996kurΔtdh/pVIC40，将基本培养基，预培养基和生产培养基补加20μg/ml链霉素，针对B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE，加入20ug/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素。
这个实验结果示于表3。
表3
本发明包括以下附图图1含有转座子Tn5531的质粒pCGL0040图。所述转座子以无暗带的箭头表示。
图2含有thrE基因的质粒pZ1thrE图。
图3含有thrE基因的质粒pTrc99AthrE图。
图4含有thrE基因的质粒pMW218thrE图。
应知晓所述长度数值是大约值。所采用的缩写和符号有如下含义Amp氨苄青霉素抗性基因。
Kan卡那霉素抗性基因。
＇amp氨苄青霉素抗性基因的3’部分。
oriBR322质粒pBR322的复制区。
lacItrc启动子的阻抑物蛋白基因。
Ptrctrc启动子区域，IPTG可诱导性的。
5S5S rRNA区域rrnBTrRNA终止子区域。
限制酶的缩写具有以下含义BamHI来自解淀粉芽孢杆菌的限制性内切酶BglII来自Bacillus globigii的限制性内切酶ClaI来自Caryphanon latum的限制性内切酶EcoRI来自大肠杆菌的限制性内切酶EcoRV来自大肠杆菌的限制性内切酶HindIII来自流感杆菌的限制性内切酶KpnI来自肺炎杆菌的限制性内切酶PstI来自斯氏普罗威登斯菌的限制性内切酶PvuI来自普通变形杆菌的限制性内切酶SacI来自Streptomyces achromogenes的限制性内切酶SalI来自白色链霉菌的限制性内切酶SmaI来自粘质沙雷氏菌的限制性内切酶XbaI来自Xanthomonas badrii的限制性内切酶XhoI来自Xanthomonas holcicola的限制性内切酶序列表<110>德古萨股份公司<120>发酵制备L-苏氨酸的方法<130>000225 BT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2817<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌ATCC14752<220><221>CDS<222>(398)..(1864)<223>thrE基因<400>1aatgaaataa tcccctcacc aactggcgac attcaaacac cgtttcattt ccaaacatcg 60agccaaggga aaagaaagcc cctaagcccc gtgttattaa atggagactc tttggagacc 120tcaagccaaa aaggggcatt ttcattaaga aaatacccct ttgacctggt gttattgagc 180tggagaagag acttgaactc tcaacctacg cattacaagt gcgttgcgct gccaattgcg 240ccactccagc accgcagatg ctgatgatca acaactacga atacgtatct tagcgtatgt 300gtacatcaca atggaattcg gggctagagt atctggtgaa ccgtgcataa acgacctgtg 360attggactct ttttccttgc aaaatgtttt ccagcgg atg ttg agt ttt gcg acc 415Met Leu Ser Phe Ala Thr1 5ctt cgt ggc cgc att tca aca gtt gac gct gca aaa gcc gca cct ccg 463Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Pro10 15 20cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg gcc 511Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr Asp His Ser Gln Val Ala25 30 35ggt gtg atg aat ttg gct gcg aga att ggc gat att ttg ctt tct tca 559Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly Asp Ile Leu Leu Ser Ser40 45 50ggt acg tca aac agt gat acc aag gtg caa gtt cga gcg gtg acc tct 607Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln Val Arg Ala Val Thr Ser55 60 65 70gcg tat ggc ctg tac tat acg cat gtg gat atc acg ttg aat acg atc 655Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp Ile Thr Leu Asn Thr Ile75 80 85acc atc ttc acc aac atc ggt gtg gag agg aag atg ccg gtc aac gtg 703Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn Val90 95 100ttt cat gtt gtg ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct gag 751Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser Glu105 110 115gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag gct ggt gct acc ccg cct gag 799Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Pro Glu120 125 130gtt gcc gag aaa att ctg gac gag ttg gag caa tcg cct gcg tct tat 847Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu Gln Ser Pro Ala Ser Tyr135 140 145 150ggt ttc cct gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggc gct gtt 895Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala Val155 160 165gct gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att gct ttt att 943Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val Ser Leu Ile Ala Phe Ile170 175 180acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag ggt 991Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys Gly185 190 195ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg ctg 1039Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly Gly Phe Ile Ala Thr Leu200 205 210cct gca tcg att gct tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag atc 1087Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Leu Glu Ile215 220 225 230aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca ggt 1135Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile Val Val Leu Leu Ala Gly235 240 245ttg aca ctt gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc gct ccg gtg 1183Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly Ile Thr Gly Ala Pro Val250 255 260aca gca agt gca cga ttt ttt gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc att 1231Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly Ile265 270 275gtt gct ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tct gaa atc ttg cat gtc 1279Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu Ser Glu Ile Leu His Val280 285 290atg ttg cct gcc atg gag tcc gct gca gca cct aat tat tcg tct aca 1327Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser Thr295 300 305 310ttc gcc cgc att atc gct ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca gtg 1375Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala Val315 320 325ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act gcg 1423Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile Ile Ala Gly Leu Thr Ala330 335 340ctg atg ggt tct gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc ccc 1471Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly Pro345 350 355gtc tct gcc gct gcg att gct gca aca gca gtt ggt ttc act ggt ggt 1519Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly Gly360 365 370ttg ctt gcc cgt cga ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att gcc 1567Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro Leu Ile Val Ala Ile Ala375 380 385 390ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg tac 1615Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala Ile Tyr Arg Gly Met Tyr395 400 405gcc acc ttg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg gtt 1663Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn Ile Ala Val410 415 420gct tta gcc act gct tca tca ctt gcc gct ggc gtg gtt ttg ggt gag 1711Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly Glu425 430 435tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac cgt 1759Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr Arg440 445 450gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa gct gag cag 1807Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gln Glu Glu Ala Glu Gln455 460 465 470aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat caa aga ttc ggt 1855Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gln Arg Phe Gly475 480 485aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg 1904Asn Lys Argtagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg 1964gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggtgcc 2024cgcaggattg ttgccaccta ttctaaggac ttcttcgacg gcgtcacttt gatgtgcatg 2084ctcggcgttg aacctcaggg cctgcgttac accaaggtcg cttctgaaca cgaggaagct 2144cagccaaaga aggctacaaa gcggactcgt aaggcaccag ctaagaaggc tgctgctaag 2204aaaacgacca agaagaccac taagaaaact actaaaaaga ccaccgcaaa gaagaccaca 2264aagaagtctt aagccggatc ttatatggat gattccaata gctttgtagt tgttgctaac 2324cgtctgccag tggatatgac tgtccaccca gatggtagct atagcatctc ccccagcccc 2384ggtggccttg tcacggggct ttcccccgtt ctggaacaac atcgtggatg ttgggtcgga 2444tggcctggaa ctgtagatgt tgcacccgaa ccatttcgaa cagatacggg tgttttgctg 2504caccctgttg tcctcactgc aagtgactat gaaggcttct acgagggctt ttcaaacgca 2564acgctgtggc ctcttttcca cgatttgatt gttactccgg tgtacaacac cgattggtgg 2624catgcgtttc gggaagtaaa cctcaagttc gctgaagccg tgagccaagt ggcggcacac 2684ggtgccactg tgtgggtgca ggactatcag ctgttgctgg ttcctggcat tttgcgccag 2744atgcgccctg atttgaagat cggtttcttc ctccacattc ccttcccttc ccctgatctg 2804ttccgtcagc tgc2817<210>2<211>489<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌ATCC14752<400>2Met Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala1 5 10 15Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr20 25 30Asp His Ser Gln Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly35 40 45Asp Ile Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln50 55 60Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp65 70 75 80Ile Thr Leu Asn Thr Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg85 90 95Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn100 105 110Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala115 120 125Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu130 135 140Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala145 150 155 160Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val165 170 175Ser Leu Ile Ala Phe Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser180 185 190Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly195 200 205Gly Phe Ile Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu210 215 220Gln Phe Gly Leu Glu Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile225 230 235 240Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly245 250 255Ile Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu260 265 270Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu275 280 285Ser Glu Ile Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala290 295 300Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr305 310 315 320Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile325 330 335Ile Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe340 345 350Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala355 360 365Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro370 375 380Leu Ile Val Ala Ile Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala385 390 395 400Ile Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly405 410 415Phe Thr Asn Ile Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala420 425 430Gly Val Val Leu Gly Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro435 440 445Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe450 455 460Gln Glu Glu Ala Glu Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys465 470 475 480Thr Asn Gln Arg Phe Gly Asn Lys Arg485<210>3<211>1909<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌ATCC13032<220><221>CDS<222>(280)..(1746)<223>thrE基因<400>3agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccccc ctttgacctg gtgttattga 60gctggagaag agacttgaac tctcaaccta cgcattacaa gtgcgttgcg ctgccaattg 120cgccactcca gcaccgcaga tgctgatgat caacaactac gaatacgtat cttagcgtat 180gtgtacatca caatggaatt cggggctaga gtatctggtg aaccgtgcat aaacgacctg 240tgattggact ctttttcctt gcaaaatgtt ttccagcgg atg ttg agt ttt gcg294Met Leu Ser Phe Ala1 5acc ctt cgt ggc cgc att tca aca gtt gac gct gca aaa gcc gca cct 342Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro10 15 20ccg cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg 390Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr Asp His Ser Gln Val25 30 35gcc ggt gtg atg aat ttg gct gcg aga att ggc gat att ttg ctt tct 438Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly Asp Ile Leu Leu Ser40 45 50tca ggt acg tca aat agt gac acc aag gta caa gtt cga gca gtg acc 486Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln Val Arg Ala Val Thr55 60 65tct gcg tac ggt ttg tac tac acg cac gtg gat atc acg ttg aat acg 534Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp Ile Thr Leu Asn Thr70 75 80 85atc acc atc ttc acc aac atc ggt gtg gag agg aag atg ccg gtc aac 582Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn90 95 100gtg ttt cat gtt gta ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct 630Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser105 110 115gag gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag gct ggt gcg acc ccg cct 678Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Pro120 125 130gag gtt gcc gag aaa atc ctg gac gag ttg gag caa tcc cct gcg tct 726Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu Gln Ser Pro Ala Ser135 140 145tat ggt ttc cct gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggt gct 774Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala150 155 160 165gtt gct gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att gct ttt 822Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val Ser Leu Ile Ala Phe170 175 180att acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag 870Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys185 190 195ggt ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg 918Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly Gly Phe Ile Ala Thr200 205 210ctg cct gca tcg att gct tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag 966Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Leu Glu215 220 225atc aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca 1014Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile Val Val Leu Leu Ala230 235 240 245ggt ttg aca ctc gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc gct ccg 1062Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly Ile Thr Gly Ala Pro250 255 260gtg aca gca agt gca cga ttt ttc gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc 1110Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly265 270 275att gtt gct ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tct gaa atc ttg cat 1158Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu Ser Glu Ile Leu His280 285 290gtc atg ttg cct gcc atg gag tcc gct gca gca cct aat tat tcg tct 1206Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser295 300 305aca ttc gcc cgc att atc gct ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca 1254Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala310 315 320 325gtg ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act 1302Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile Ile Ala Gly Leu Thr330 335 340gcg ctg atg ggt tct gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc 1350Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly345 350 355ccc gtc tct gcc gct gcg att gct gca aca gca gtt ggt ttc act ggt 1398Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly360 365 370ggt ttg ctt gcc cgt cga ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att 1446Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro Leu Ile Val Ala Ile375 380 385gcc ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg 1494Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala Ile Tyr Arg Gly Met390 395 400 405tac gcc acc ctg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg 1542Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn Ile Ala410 415 420gtt gct tta gcc act gct tca tca ctt gcc gct ggc gtg gtt ttg ggt 1590Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly425 430 435gag tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac 1638Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr440 445 450cgt gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa gct gag 1686Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gln Glu Glu Ala Glu455 460 465cag aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat cag aga ttc 1734Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gln Arg Phe470 475 480 485ggt aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg 1786Gly Asn Lys Argtagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg 1846gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggggta 1906ccg 1909<210>4<211>489<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌ATCCl3032<400>4Met Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala1 5 10 15Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr20 25 30Asp His Ser Gln Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly35 40 45Asp Ile Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln50 55 60Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp65 70 75 80Ile Thr Leu Asn Thr Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg85 90 95Lys Met Pro Val Asn ValPhe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn100105 110Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala115 120 125Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu130 135 140Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala145 150 155 160Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val165 170 175Ser Leu Ile Ala Phe Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser180 185 190Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly195 200 205Gly Phe Ile Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu210 215 220Gln Phe Gly Leu Glu Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile225 230 235 240Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly245 250 255Ile Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu260 265 270Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu275 280 285Ser Glu Ile Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala290 295 300Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr305 310 315 320Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile325 330 335Ile Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe340 345 350Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala355 360 365Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro370 375 380Leu Ile Val Ala Ile Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala385 390 395 400Ile Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly405 410 415Phe Thr Asn Ile Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala420425 430Gly Val Val Leu Gly Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro435 440 445Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe450 455 460Gln Glu Glu Ala Glu Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys465 470 475 480Thr Asn Gln Arg Phe Gly Asn Lys Arg485
PCT/RO/134表关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)
权利要求
1.一种发酵生产L-苏氨酸的方法，包括采用肠杆菌科细菌，尤其采用已经生产L-苏氨酸的那些肠杆菌科细菌，而且其中编码thrE基因的棒状细菌的核苷酸序列被增强，尤其是过表达。
2.权利要求1的方法，其中除了thrE基因之外，还有一些基因被增强。
3.权利要求1或2的方法，其中所述肠杆菌科的微生物来自埃希氏菌属和沙雷氏菌属。
4.权利要求3的方法，其中所述微生物来自埃希氏菌属，尤其来自大肠杆菌。
5.权利要求1的方法，其中编码天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子被同时增强。
6.权利要求1的方法，其中编码丙酮酸羧化酶的pyc基因是同时增强的。
7.权利要求1的方法，其中编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因被同时增强。
8.权利要求1的方法，其中编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因被同时增强。
9.权利要求1的方法，其中编码转氢酶的pntA和pntB基因被同时增强。
10.权利要求1的方法，其中采用这样的细菌，该细菌中降低L-苏氨酸形成的代谢途径至少部分被消除。
11.权利要求1的方法，其中采用用一质粒载体转化的菌株，所述质粒载体携带编码棒状细菌的thrE基因的核苷酸序列。
12.权利要求1的方法，其中采用通过质粒pZ1thrE转化的细菌。
13.权利要求1的方法，其中thrE基因的表达是被诱导的，尤其是通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导。
14.权利要求1的方法，其中编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因被同时增强。
15.权利要求1的方法，其中授予高丝氨酸抗性的rhtB基因被同时增强。
16.一种生产L-苏氨酸的方法，其包括进行以下步骤a)发酵肠杆菌科的微生物，其中至少棒状细菌的thrE基因被增强(过表达)，任选地与其它基因组合增强，b)浓缩培养基或肠杆菌科微生物的细胞中的L-苏氨酸，及c)分离所述L-苏氨酸。
17.含有谷氨酸棒杆菌ATCC13032的thrE基因的质粒pZ1thrE。
18.黄色短杆菌菌株DM368-2 pZ1thrE，保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，德国不伦瑞克)中，保藏号为DSM12840。
全文摘要
本发明提供了一种使用尤其已经生产L－苏氨酸的肠杆菌科细菌发酵生产L－苏氨酸的方法，该细菌中编码thrE基因的棒状细菌的核苷酸序列被增强，尤其是过表达。
文档编号C12N15/31GK1430672SQ01810198
公开日2003年7月16日 申请日期2001年4月6日 优先权日2000年5月27日
发明者梅希特希尔德·里平 申请人:德古萨股份公司