专利名称：细菌脂多糖的包被方法、检测特定脂多糖的试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的包被方法，进一步涉及使用这种方法提供的检测细菌特定脂多糖的试剂盒及使用这种试剂盒快速检测细菌特定LPS的方法。
本发明的主要原理是细菌LPS单克隆抗体与细菌的LPS有特异的抗原抗体免疫结合反应，用一定量的LPS包埋酶标反应孔，加入要检测LPS的溶液和一定量的LPS单克隆抗体，溶液中的LPS与包埋孔中固定化的LPS竞争结合LPS单克隆抗体，使得与固定于酶标孔中的LPS结合的辣根过氧化物酶标记的LPS单克隆抗体的数量减少，辣根过氧化物酶与底物反应显示的溶液颜色变浅直至无色，由此可以定性或半定量检测LPS。
本发明的一种细菌LPS的包被方法包括下列步骤(a)0.2-2μg LPS溶解于50-300μl pH9.6含0.02-2％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸盐缓冲液(包被液)中，并加到预先用杀菌紫外灯照射过10-60分钟的酶标测定孔中；(b)35-39℃温浴30分钟-3小时；(c)4℃放置2-48小时；(d)甩干溶液，加入脱脂奶粉或白蛋白封闭液，35-39℃温浴封闭；
(e)甩干溶液，洗涤液洗涤(三次)，置于4℃中保存。
上述细菌LPS的包被方法中，(a)的优选方案为0.5-1.2μg LPS溶解于80-180μl pH9.6含0.3-1％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸盐缓冲液(包被液)中，并加到预先用杀菌紫外灯照射过20-50分钟的酶标测定孔中；(b)的优选方案为35-39℃温浴1-2小时；(c)的优选条件为4℃放置12-24小时。
使用上述方法提供的一种快速检测细菌特定LPS的试剂盒，其溶剂和材料包括(a)保存于含0.01-1％叠氮钠、30-80％甘油的磷酸氢二钠溶液中的细菌LPS单克隆抗体；(b)过氧化物酶标记的抗LPS单克隆抗体的免疫球蛋白(酶标二抗)；(c)溶解于pH7.4磷酸盐缓冲液中的标准LPS；(d)稀释液即含0.05-0.5％明胶和0.01-0.1％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液；(e)已包被好LPS的酶标测定条。
上面所述试剂盒的(a)中，叠氮钠和甘油优选含量分别为0.05-0.3％和45-60％。上面所述试剂盒的(d)中明胶的优选含量为0.1-0.3％。
使用试剂盒时需另行配制的试剂包括(1)洗涤液(pH7.4 0.02mol/L磷酸盐缓冲液-0.05％吐温20)，它含磷酸二氢钾0.2克磷酸氢二钠2.9克氯化钠8.0克吐温200.5克加双蒸水至1000毫升(2)pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液甲液柠檬酸(无水)19.2克溶于1000毫升双蒸水中乙液磷酸氢二钠(12H2O) 71.6克溶于1000毫升双蒸水中取甲液24.3毫升，乙液25.7毫升，双蒸水50毫升混合即成pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液。
(3)底物应用液(用时现配)，由下列三种试剂混合而成邻苯二胺40毫克pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液100毫升30％过氧化氢0.15毫升(4)终止液30毫升浓硫酸加到70毫升双蒸水中混合而成。
使用上述快速检测细菌特定脂多糖的试剂盒及另配试剂快速检测细菌特定脂多糖的方法包括(a)在每测定孔中加入细菌LPS单克隆抗体；(b)将待检测样品用稀释液进行适当的稀释后加入酶标测定条中，使每孔加入溶液的体积为100μl，对照孔加入细菌LPS单克隆抗体和稀释液使其体积为100μl，充分混匀；(c)35-39℃温浴1-2小时；(d)洗涤液洗涤(3-4)次；(e)加入用稀释液适当稀释的酶标二抗100μl；(f)35-39℃温浴0.5-2小时；(g)洗涤液洗涤(3-4)次；(h)加入底物应用液100μl，避光显色15-30分钟；(I)当对照孔出现明显颜色反应时，加入终止液50μl，立即用酶标仪测定各孔的光吸收值即OD值；(j)结果判断各测定孔显色的颜色深度与待测液中抗原的含量成反比，若待测孔OD值比对照孔的小，则可判定待测孔结果为阳性；反之则阴性；对检测样品进行定量时，取梯度浓度的标准细菌LPS进行检测，并根据检测结果，按各测定孔OD值与对照孔OD值的比值绘制标准曲线，根据测定比值查找待测样品的抗原含量。
测定中可调整检测样品的浓度，使待测孔OD值与对照孔的OD值比值在0.3-0.8为宜。本发明的优点和积极效果LPS是革兰氏阴性菌细胞壁必需的成分，又是重要的致病因子，用免疫学方法对LPS展开研究和进行检测是一种很常用的方法，应用简便的方法将LPS包埋于酶标测定孔中，会给研究和检测带来很大的便利。而LPS检测试剂盒既可以用于有关LPS的科学研究中，又可以用于患病动物的检测中，还可以检测某些生物制品中，是否污染有特定细菌的LPS。本试剂盒有一定的市场应用前景。
细菌LPS的包被方法为(a)0.8μg LPS溶解于100μl pH9.6含1％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸盐缓冲液(包被液)中，并加到预先用杀菌紫外灯照射过30分钟的酶标测定孔中；(b)37℃温浴1时；(c)4℃放置12小时；(d)甩干溶液，加入脱脂奶粉或白蛋白封闭液，37℃温浴封闭；(e)甩干溶液，洗涤液洗涤三次，置于4℃中保存。
试剂盒包括
(a)保存于含0.1％叠氮钠、50％甘油的磷酸氢二钠溶液中的细菌LPS单克隆抗体；(b)过氧化物酶标记的抗LPS单克隆抗体的免疫球蛋白(酶标二抗)；(c)溶解于pH7.4磷酸盐缓冲液中的标准LPS；(d)稀释液即含0.3％明胶和0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液；(e)已包被好LPS的酶标测定条。
另配试剂与技术内容中的一致。
应用本试剂盒研究溶藻弧菌在一定的培养条件下LPS是否分泌到细菌培养上清中，应用情况如下将溶藻弧菌接种于2.5％NaCl营养培养基中，于30℃振荡培养，在48小时内每隔4小时取样，离心分离细菌培养上清。取各时期的细菌培养上清50μl，加入溶藻弧菌LPS检测试剂盒提供的酶标条孔中，每孔再加入50μl稀释液和1μl鼠抗溶藻弧菌LPS单克隆抗体，充分混匀，按试剂盒使用方法进行检测，每个测定都作一个平行测定，最后测定出细菌培养上清中没有可测出的LPS，表明溶藻弧菌在2.5％NaCl营养培养基培养条件下其LPS不分泌到细菌培养上清中。
权利要求
1.一种细菌脂多糖的包被方法，其特征是包括下列步骤(a)0.2-2μg LPS溶解于50-300μl pH9.6含0.02-2％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸盐缓冲液(包被液)中，并加到预先用杀菌紫外灯照射过10-60分钟的酶标测定孔中；(b)37℃温浴30分钟-4小时；(c)4℃放置2-48小时；(d)甩干溶液，加入脱脂奶粉或白蛋白封闭液，35-39℃温浴封闭；(e)甩干溶液，洗涤液洗涤，置于4℃中保存。
2.根据权利要求1中所述的细菌脂多糖的包被方法，其特征是(a)的优选条件为0.5-1.2μg LPS溶解于80-180μl pH9.6含0.3-1％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸盐缓冲液(包被液)中，并加到预先用杀菌紫外灯照射过20-50分钟的酶标测定孔中。
3.根据权利要求1中所述的细菌脂多糖的包被方法，其特征是(b)的优选方案为35-39℃温浴1-2小时。
4.根据权利要求1中所述的细菌脂多糖的包被方法，其特征是(c)的优选条件为4℃放置12-24小时。
5.使用权利要求1中所述的细菌脂多糖的包被方法提供的检测细菌特定脂多糖的试剂盒，其特征是溶剂和材料包括(a)保存于含0.01-1％叠氮钠、30-80％甘油的磷酸氢二钠溶液中的细菌LPS单克隆抗体；(b)过氧化物酶标记的抗LPS单克隆抗体的免疫球蛋白(酶标二抗)；(c)溶解于pH7.4磷酸盐缓冲液中的标准LPS；(d)稀释液即含0.05-0.5％明胶和0.01-0.1％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液；(e)已包被好LPS的酶标测定条。
6.根据权利要求5中所述的试剂盒，其特征是(a)中，叠氮钠和甘油优选含量分别为0.05-0.3％和45-60％。
7.根据权利要求5中所述的试剂盒，其特征是(d)中明胶的优选含量为0.1-0.3％。
8.使用权利要求5-7中所述的的试剂盒及另配试剂快速检测细菌特定脂多糖的方法，其特征包括下列步骤(a)在每测定孔中加入细菌LPS单克隆抗体；(b)将待检测样品用稀释液进行适当的稀释后加入酶标测定条中，使每孔加入溶液的体积为100μl，对照孔加入细菌LPS单克隆抗体和稀释液使其体积为100μl，充分混匀；(c)35-39℃温浴1-2小时；(d)洗涤液洗涤；(e)加入用稀释液适当稀释的酶标二抗100μl；(f)35-39℃温浴1-2小时；(g)洗涤液洗涤；(h)加入底物应用液100μl，避光显色15-30分钟；(I)当对照孔出现明显颜色反应时，加入终止液50μl，立即用酶标仪测定各孔的光吸收值即OD值；(j)结果判断各测定孔显色的颜色深度与待测液中抗原的含量成反比，若待测孔OD值比对照孔的小，则可判定待测孔结果为阳性；反之则阴性；对检测样品进行定量时，取梯度浓度的标准细菌LPS进行检测，并根据检测结果，按各测定孔OD值与对照孔OD值的比值绘制标准曲线，根据测定比值查找待测样品的抗原含量。
全文摘要
本发明涉及一种细菌脂多糖的包被方法,包括:(a)LPS溶解于pH9.6含0.02－2%三氯乙酸的0.1mol/L碳酸盐缓冲液(包被液)中,并加到预先用杀菌紫外灯照射过的酶标测定孔中;(b)35－39℃温浴;(c)4℃放置;(d)甩干溶液,加入脱脂奶粉或白蛋白封闭液,35－39℃温浴封闭;(e)甩干溶液,洗涤液洗涤,置于4℃中保存。进一步涉及使用这种方法提供的检测细菌特定脂多糖的试剂盒及使用这种试剂盒快速检测细菌特定LPS的方法。试剂盒包括(a)细菌LPS单克隆抗体;(b)酶标二抗;(c)标准LPS;(d)稀释液;(e)已包被好LPS的酶标测定条。本发明的优点是LPS包埋方法和试剂盒简单,检测方便。
文档编号C12Q1/02GK1374526SQ02115040
公开日2002年10月16日 申请日期2002年4月5日 优先权日2002年4月5日
发明者陈晓燕, 胡超群, 任春华 申请人:中国科学院南海海洋研究所