专利名称：适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种重组甜蛋白及其生产方法，尤其是涉及一种适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法。
甜味剂是常用的食品添加剂，其中包括糖类甜味剂，如蔗糖、果糖等能被人体代谢利用，多余的糖会转化为脂肪，不利于糖尿病、肥胖病、齿病和心血管病人食用。人工合成的如阿斯巴甜、甜味素等又有一定的副作用。甜蛋白比人工合成的甜味剂更易为公众接受，而且其甜度极高，相同分子数的甜蛋白比蔗糖的甜度高十万倍，特别适用于糖尿病、肥胖病、齿病和心血管病人食用。因此，甜蛋白在食品、医药等产业有很高的价值。目前，甜蛋白主要是从植物中提取，但由于原材料价格高，导致其生产成本过高，进而限制其在工业上的应用。此外，采用固相合成蛋白质的方法合成甜蛋白，其成本也很高，难以实现工业化生产。
利用基因工程技术生产蛋白质不仅可以提高甜蛋白的产量、降低成本，而且可以对基因进行改造，扩大其在工业上应用的范围，目前人们已在大肠杆菌、酵母中表达了Monellin甜蛋白，但其表达效率和食用安全性还不令人满意。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法。
同一种氨基酸由一个以上的密码子编码，生物对其中一种具有使用的偏好性。根据丝状真菌的密码子偏好性，尤其是灵芝的密码子的偏好性，本发明对天然的monellin基因进行改造，提高甜蛋白在灵芝中的表达量。人工合成的重组monellin基因插入灵芝表达载体pCALZ，通过基因工程技术将monellin基因整合到灵芝的基因组中，使灵芝表达monellin蛋白，通过发酵方法大量生产甜蛋白。
为了实现上述目的，本发明所设计的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的DNA序列为atgggcgagt gggagatcat cgacatcggc cccttcaccc agaacctcgg caagttcgcc 60gtcgacgagg agaacaagat cggccagtac ggccgcctca ccttcaacaa ggtcatccgc 120ccctgcatga agaagaccat ctacgaggcg aacggcttcc gcgagatcaa gggctacgag 180taccagctct acgtctacgc ctccgacaag ctcttccgcg ccgacatctc cgaggactac 240aagacccgcg gccgcaagct cctccgcttc aacggccccg tccccccgcc ctaa294本发明中所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的DNA序列由丝状真菌偏爱的密码子组成，尤其是灵芝喜好的密码子。
本发明所述的丝状真菌可以是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉等。
本发明采用基因工程技术，根据已知的monellin蛋白的氨基酸序列，选用丝状真菌，尤其是灵芝偏好的密码子，人工合成monellin甜蛋白基因，将其插入表达载体中，并使之整合到宿主基因组中，获得能表达monellin蛋白的重组菌株。
本发明中所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法包括以下步骤①基于monellin甜蛋白的氨基酸序列，合成由丝状真菌偏好密码子组成的monellin甜蛋白的DNA序列。
②将步骤①中所述的DNA序列与丝状真菌表达载体pCALZ相连，得到能在丝状真菌中表达Monellin蛋白的重组表达载体。
③将步骤②中所得的重组表达载体转化丝状菌株，得到重组菌株。
④将步骤③中所得的重组菌株，进行工业化发酵生产。
本发明中的宿主为丝状真菌，它可以是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉等。
上述步骤②中所述的载体是pCALZ，适于在灵芝、平菇、双孢菇、曲霉等宿主中表达，具有以下几个特征①具有在丝状真菌中表达能力强的强启动子，有纤维素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA等启动子。②具有使重组monellin基因整合入宿主基因组的序列。③具有选择标记，一般有营养缺陷型和抗药性等选择标记，通过选择压力来筛选重组菌株。
上述步骤②中所述的重组表达载体除包含编码Monellin甜蛋白的DNA序列外，还包含在丝状真菌中表达Monellin甜蛋白所需的调控元件。
上述步骤③中可采用PEG法、电激法、农杆菌介导法或基因枪法，将重组表达载体导入宿主细胞中，表达monellin甜蛋白。
上述方法步骤③中所述的重组菌株是整合有丝状真菌monellin蛋白DNA序列的重组菌株。
本发明与现有技术相比具有如下优点本发明所述的的重组甜蛋白适于在丝状真菌中表达，该丝状真菌选用灵芝时，不仅食用安全，而且含有多糖等多种增强免疫力的成分。灵芝的发酵工艺已经成熟，灵芝转基因技术也开发成功，因此灵芝是一种较为理想的外源蛋白表达系统。本发明设计、合成的重组Monellin蛋白可在灵芝中高效表达。
pCALZ(携带monellin基因)质粒的LBA4404按1％的接种量接种于基本培养基(含50mg/Lrif、50mg/L卡那霉素)中，培养过夜，用液体诱导培养基稀释至OD660达到0.15，28℃下200rpm培养3小时。
取精制(纯化)后的200μl灵芝原生质体(1×108个/ml)与200μl上述制备的LBA4404混匀。涂布于固体诱导培养基上，35℃下培养2天。转移至含有50μg/ml HmB的纤维二糖再生培养基平板，在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株。转化频率约为100个转化子/107个原生质体。5工业发酵方法生产甜蛋白将新鲜的灵芝斜面菌种接入十个500ml(装液量为100ml)三角瓶中，26℃摇床培养144小时。然后把两个500ml摇瓶种转接入2000ml三角瓶中(装液量为1000ml)，26℃摇床培养96小时。将5瓶2000ml摇瓶中的种转接入一个装有100L发酵培养基的总容积为150L的一级种子罐，保持罐温26℃，罐压30kPa，搅拌速率100r/min，通气量1∶0.2，发酵72小时。将种子罐菌种转接到一个装有1吨发酵培养基的1.5吨二级种子罐中，保持罐温27℃，罐压罐压0.5～1.0kg/cm2，搅拌速率110r/min，通气量1∶0.4，发酵70小时。将二级种子罐中菌种转接到一个装有10吨发酵培养基的15吨发酵罐中，保持罐温26℃，罐压0.8～1.2kg/cm2，搅拌速率120r/min，通气量为1∶0.7，发酵100小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得到含有甜蛋白湿菌丝体。
权利要求
1.适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白，其DNA序列为atgggcgagt gggagatcat cgacatcggc cccttcaccc agaacctcgg caagttcgcc 60gtcgacgagg agaacaagat cggccagtac ggccgcctca ccttcaacaa ggtcatccgc 120ccctgcatga agaagaccat ctacgaggcg aacggcttcc gcgagatcaa gggctacgag 180taccagctct acgtctacgc ctccgacaag ctcttccgcg ccgacatctc cgaggactac 240aagacccgcg gccgcaagct cctccgcttc aacggccccg tccccccgcc ctaa294
2.根据权利要求1所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白，其特征是所述的DNA序列由丝状真菌偏爱的密码子组成。
3.根据权利要求2所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白，其特征是所述的丝状真菌是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉。
4.如权利要求1所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，依次包括以下步骤①基于monellin甜蛋白的氨基酸序列，合成由丝状真菌偏好密码子组成的monellin甜蛋白的DNA序列；②将步骤①中所述的DNA序列与丝状真菌表达载体pCALZ相连，得到能在丝状真菌中表达Monellin蛋白的重组表达载体；③将步骤②中所得的重组表达载体转化丝状菌株，得到重组菌株；④将步骤③中所得的重组菌株，进行工业化发酵生产。
5.根据权利要求4所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，其特征是步骤②中所述的载体pCALZ适于在灵芝、平菇、双孢菇、曲霉等宿主中表达，具有以下几个特征①具有在丝状真菌中表达能力强的强启动子，有纤维素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA等启动子；②具有使重组monellin基因整合入宿主基因组的序列；③具有选择标记，一般有营养缺陷型和抗药性等选择标记，通过选择压力来筛选重组菌株。
6.根据权利要求5所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，其特征是步骤②中所述的载体pCALZ还包含在丝状真菌中表达Monellin甜蛋白所需的调控元件。
7.根据权利要求4所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，其特征是步骤③中采用PEG法、电激法、农杆菌介导法或基因枪法，将重组表达载体导入宿主细胞中，表达monellin甜蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法，该重组甜蛋白的DNA序列由丝状真菌偏爱的密码子组成，尤其是灵芝喜好的密码子，其中，丝状真菌可以是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉等。本发明中所述的的重组甜蛋白的生产方法包括以下步骤①基于monellin甜蛋白的氨基酸序列，合成由丝状真菌偏好密码子组成的monellin甜蛋白的DNA序列；②将步骤①中所述的DNA序列与丝状真菌表达载体pCALZ相连，得到能在丝状真菌中表达Monellin蛋白的重组表达载体；③将步骤②中所得的重组表达载体转化丝状菌株，得到重组菌株；④将步骤③中所得的重组菌株，进行工业化发酵生产。本发明所述的重组甜蛋白不仅食用安全，而且含有多糖等多种增强免疫力的成分。
文档编号C12N1/15GK1446915SQ0211499
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月22日 优先权日2002年3月22日
发明者李宝健, 程度 申请人:李宝健, 程度