专利名称：新型抗肿瘤人参皂苷的制备方法
技术领域：
本发明涉及酶解或微生物发酵水解人参皂苷制备3位羟基游离的低极性人参皂苷20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人参二醇[20-O-β-D-xylopyanosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称Mx]、20-O-c-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称C-Y]和20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-a-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称McJ的方法，特别是涉及粗蜗牛酶水解制备方法。
背景技术：
人参皂苷具有多种药效功能，如抗肿瘤和免疫调节、改善微循环、调节消化机能、安神、抗衰老、抗紧张、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强记忆力和学习能力等。但天然人参皂苷几乎不能被肠道直接吸收入血，并且，药代动力学行为较差。
近来，先后发现多种由天然人参皂苷经生物转化而来的代谢产物3位羟基游离的低极性人参皂苷，如C-K、C-Y和Mc。它们分别被证明是相应天然人参皂苷的口服吸收形式。Hasegawa等研究发现C-K在抗肿瘤方面具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤诱导的新生血管形成、抗击肿瘤的浸润和转移等多种生物活性；另外，C-K具有良好的药代动力学行为且基本无毒或毒性很低，目前，在韩国已进入III期临床研究。源于天然人参皂苷Rb2和Rc的代谢产物C-Y和Mc具有与C-K相似的药效活性。
由于天然人参或天然人参皂苷口服后L乎不直接吸收，口服后上述三种可吸收的代谢产物是通过人体肠道菌的转化而来。因机体的人参皂苷肠道菌代谢能力存在个体差异，因此，理论上，直接使用转化物可以避免吸收障碍，使临床上易于掌握有效剂量。
人参皂苷20位的糖苷键在酸性介质中的稳定性低于3位糖苷键，并且空间阻碍作用使酶水解20位的糖苷键活力极低。因而，生物转化无疑是制备3位羟基游离的低极性人参皂苷的最佳方法。生物转化包括酶法和微生物发酵法。
Hasegawa将天然人参皂苷与肠道菌一起体外厌氧培养，从培养液中分离得到C-K、C-Y和Mc，并申请了美国专利(5,919,770)。由于厌氧培养时，3位羟基游离的低极性人参皂苷不是唯一产物、并且原料转化率低、分离纯化繁琐、培养条件苛刻、成本居高。因而，酶法更受关注。
目前，文献中提供的酶法有柚皮苷酶和橙皮苷酶，但该酶有下列缺陷水解时间长、酶的用量大，酶的来源不易，因此，不适于工业制备。
我们先前的研究发明了在工艺及成本上均有优势的C-K的酶法制备方法(中国专利，申请号01133410.X)和微生物发酵方法(中国专利，申请号02132403.4)。两项技术发明较之肠道菌和柚皮苷酶、橙皮苷酶的制备技术有多种优势。同时利用上述技术，以三七茎叶中富含的人参皂苷Rb3为原料，本发明的发明人发现了Mx这一具有抗肿瘤活性的新化合物，Mx具有与C-K相似的生物活性，而较之人参，三七及其茎叶在我国具有更加明显的资源优势，其结构式如下
发明的技术内容为了简单、方便、低成本、大批量地制备Mx、C-Y和Mc，本发明提供了一种用酶解或微生物发酵水解人参皂苷制备人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法，包括水解、收集和酶回收利用步骤，其特征在于用糖苷酶在缓冲液中分别选择性水解人参皂苷Rb3或三七叶苷、Rb2、Rc，皂苷与糖苷酶的重量比为1∶1～10∶1，温度为30～45℃，pH 3.0～5.5，水解时间2～72小时。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，要求糖苷酶对糖苷键的水解具有良好的选择性，即仅水解3位糖苷键而不影响20位的木糖基和葡萄糖基。糖苷酶可来源商品酶如蜗牛酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶等，也可自自然界中筛选分离具有选择性糖苷酶活性的微生物，如螺旋菌属、弯曲菌属、柔曲杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、叶状菌属、甲基球菌属、奈氏菌属、黄杆菌属、类杆菌属、放线杆菌属、鲍特氏菌属、副球菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、发光杆菌属、纤毛菌属、琥铂酸弧菌属、月形单胞菌、微球菌属、口腔菌属、肠球菌属、乳酸链球菌、厌氧链球菌、明串珠球菌属、片球菌属、消化球菌属、粪球菌属、芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、乳杆菌属、李斯特氏菌属、棒状杆菌属、节杆菌属、短杆菌属、干酪杆菌属、微杆菌属、纤维杆菌属、优杆菌属、放线菌属、分枝杆菌属、奴卡氏菌属、糖化多孢子菌属、前微小单孢子菌属、念珠菌属、青霉菌、曲霉菌属、毛霉菌属、隐球菌属、假丝酵母菌等，也可用上述微生物具有选择性糖苷酶活性的生物制品。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，酶法工艺的简便、产品分离和纯化容易，优于微生物发酵水解。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，制备Mx、C-Y和Mc的原料分别为人参皂苷Rb3、Rb2、Rc，或含有Rb3、Rb2、Rc的植物、植物提取物或植物培养液。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，蜗牛酶水解原料人参皂苷的酶活性高、选择性好、抗失活能力强、来源方便、价格低廉，特别适用于Mx、C-Y和Mc的生产制备。粗蜗牛酶水解原料人参皂苷的最适温度为40℃，最适pH为4.5，离子强度越低越好，缓冲液的种类对酶活性影响不大；本发明选用pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，的磷酸-柠檬酸缓冲液；原料与酶的比例以6∶1最为经济；依照此条件，水解时间超过8小时后，Mx的产量不再发生变化，因此，水解时间以8小时为宜。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，酶反应液在除沉淀物和小分子杂质后，可循环使用。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，筛选分离具有选择性糖苷酶活性的微生物时，采用酶诱导法与抗生素抗性诱导法，以增加微生物糖苷酶的含量或增强微生物水解能力，同时加入的抗生素，还可以防止杂菌污染。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，收集过程是(1)酶法收集酶反应沉淀物，制成悬浊液；乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯后，收集的残余物即为Mx、C-Y或Mc；若原料为含有Rb3、Rb2和Rc的植物、植物提取物或植物培养液，所获粗产物还需经吸附树脂纯化。(2)微生物发酵法用水饱和的正丁醇提取培养基三次，合并正丁醇提取液，活性炭去色除臭，减压浓缩回收正丁醇，残余物溶于乙酸乙酯并用硅胶柱层析和反相层析纯化后获Mx、C-Y或Mc。
本发明所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，加入一定量的有机溶剂对中间产物起助溶作用，有利于酶水解反应的正常进行。有机溶剂的种类和加入量以不影响酶活性为准。经筛选，以5～15％的乙醇最佳。
本发明为人参二醇皂苷酶解制备人参皂苷Mx、C-Y或Mc提供了一种来源方便、价格低廉的酶，用该酶制备Mx、C-Y和Mc工艺简单方便、成本低、回收率高。使用本方法制备的Mx、C-Y和Mc含量≥95％，苷元收率≥91％。
具体实施例方式实施例1人参皂苷Rb3(500mg)与蜗牛酶(84mg)酶溶于32mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；离心反应液、收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后，获Mx(106mg)。
实施例2人参皂苷Rb3(50mg)与蜗牛酶(8.4mg)溶于3.2mL、pH不同的磷酸-柠檬酸缓冲液(离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天。离心反应液、收集沉淀。用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(1mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯，收集的残余物并溶于5.00mL甲醇中，HPLC分析检测Mx含量。结果说明蜗牛酶最适pH为4.5。
实施例3将人参皂苷Rb3与蜗牛酶按不同比例溶于3.2mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；离心反应液、收集沉淀。用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(1mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后，收集的残余物并溶于5.00mL甲醇中，HPLC分析检测Mx含量。结果说明最适原料/酶量比为6/1。
实施例4人参皂苷Rb3(50mg)与蜗牛酶(8.4mg)溶于3.2mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，于不同温度的水浴中水解1天；离心反应液、收集沉 淀。用水将沉淀物制成悬浊液，用乙酸乙酯萃取(1mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后，收集的残余物并溶于5.00mL甲醇中，HPLC分析检测Mx含量。结果说明最适温度为45℃。
实施例5人参皂苷Rb3(50mg)与蜗牛酶(8.4mg)溶于3.2mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，含10％的乙醇)中，变化离子强度，于40℃水浴中水解1天；离心反应液、收集沉淀。用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(1mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后，收集的残余物并溶于5.00mL甲醇中，HPLC分析检测Mx含量。结果说明离子强度越低越好。
实施例6人参皂苷Rb3(50mg)与蜗牛酶(8.4mg)溶于3.2mL pH4.5离子强度为0.001mol·L-1含10％的乙醇的不同缓冲液(包括1为甘氨酸-HCl，2为邻苯二甲酸氢钾-HCl，3为Na2HPO4-柠檬酸，4为柠檬酸-柠檬酸钠，5为醋酸-醋酸钠)中，于40℃水浴中水解8小时；反应液经离心收集沉淀；用水将沉淀物制成悬浊液；用乙酸乙酯萃取(1mL×5)，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯后，收集的残余物Mx溶于5.00mL甲醇中，HPLC分析Mx含量。结果说明缓冲液的种类对蜗牛酶酶活性影响不大。
实施例7人参皂苷Rb3(50mg)与蜗牛酶(8.4mg)溶于3.2mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，于40℃水浴中，变换水解时间。离心反应液、收集沉淀，水将沉淀物制成悬浊液；用乙酸乙酯萃取(1mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后，收集的残余物并溶于5.00mL甲醇中，HPLC分析检测Mx含量。结果说明反应10小时后，Mx的增量不大。
实施例8经人参皂苷Rb3共同培养驯化得到的对四环素具有抗杂菌生长的黑曲霉(Aspergillus niger v.Tiegh)YLY菌株溶液，使用前在查氏液体培养基(100mL)中培养过夜，挑出菌落，传入含人参皂苷Rb3(3％)的查氏液体培养基中(100mL)，37度摇床连续培养3天。用水饱和正丁醇提取培养液三次(10mL×5)，合并正丁醇提取液，活性炭去色、除臭，减压除正丁醇，将残余物溶于乙酸乙酯进行硅胶柱层析(洗脱液为氯仿/乙酸乙酯/乙醇＝60/30/10，下层500mL)和反相层析纯化(流动相为50％的乙醇5L)，获Mx(515mg)，经检验含量≥95％。
实施例9人参皂苷Rb2(500mg)与蜗牛酶(84mg)酶溶于32mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；离心反应液、收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后，获C-Y(103mg)。
实施例10人参皂苷Rc(500mg)与蜗牛酶(84mg)酶溶子32mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；离心反应液、收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)悬浊液，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后，获Mc(105mg)。
权利要求
1.一种用酶水解人参二醇型皂苷制备3位羟基游离的低极性人参皂苷20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人参二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称Mx]、20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称C-Y]或20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称Mc]的方法，包括水解、产物收集和酶回收利用步骤，其特征在于用糖苷酶在缓冲液中分别选择性水解人参皂苷Rb3或三七叶苷、Rb2、Rc，皂苷与糖苷酶的重量比为1∶1～10∶1，温度为30～45℃，pH3.0～5.5，水解时间2小时～3天。
2.按照权利要求1所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于所用的糖苷酶对糖苷键具有良好的选择性，即仅水解人参皂苷3位的糖苷键而不影响20位的糖苷键以及其后的木糖基与葡萄糖基的糖苷键，包括糖苷酶和具有选择性糖苷酶活性的微生物及其具有选择性糖苷酶活性的生物制品。
3.按照权利要求1所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于对于糖苷酶或微生物酶制品，酶解反应在酶的pH 3.0～5.5的缓冲溶液中进行对于微生物，酶解反应在或在培养基中进行，培养基为液体、半固体或固体；培养条件是需氧的、兼氧的或厌氧的。
4.按照权利要求1所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于制备Mx、C-Y、Mc的原料分别为人参皂苷Rb3、Rb2、Rc，或含有Rb3、Rb2、Rc的植物、植物提取物或随物培养液。
5.按照权利要求1所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于所用酶为蜗牛酶，皂苷与蜗牛酶的重量比为1∶1～10∶1，pH值在2.0～10.0之间，水解温度为30-60℃，水解时间2～20小时。
6.按照权利要求5所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于所用酶为蜗牛酶，皂苷与蜗牛酶的重量比为6∶1，pH为4.5，水解温度为45℃，水解时间为8小时。
7.按照权利要求1所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于所述的收集过程是(1)酶法 收集酶反应沉淀物，制成悬浊液；乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯后，收集的残余物即为Mx、C-Y或Mc；若原料为含有Rb3、Rb2和Rc的植物、植物提取物或植物培养液，所获粗产物还需经吸附树脂纯化；(2微生物发酵法 用水饱和的正丁醇提取培养基三次，合并正丁醇提取液，活性炭去色除臭，减压浓缩回收正丁醇，残余物溶于乙酸乙酯并用硅胶柱层析和反相层析纯化后获Mx、C-Y或Mc。
8.按照权利要求1所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于所述的除去了沉淀物的酶反应液，经超滤除去小分子杂质后回收作为原料酶使用。
9.按照权利要求1所述用酶水解制备Mx、C-Y或Mc的方法，其特征在于所用缓冲液中含有5～15％的乙醇。
全文摘要
本发明涉及酶解或微生物发酵水解人参皂苷制备3位羟基游离的低极性人参皂苷20－O－β－D－木糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(s)－原人参二醇[20－O－β－D－xylopyranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl－20(S)－protopanaxadiol，简称Mx]、20－O－α－L－阿拉伯糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(S)－原人参二醇[20－O－α－L－arabinopyranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl 20(S)－protopanaxadiol，简称C－Y]和20－O－α－L－阿拉伯糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(S)－原人参二醇[20－O－α－L－arabinofuranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl 20(S)－protopanaxadiol，简称Mc]的方法，特别是涉及粗蜗牛酶水解制备方法。本发明中所用蜗牛酶酶活性高、选择性好、离子强度要求低、抗失活能力强、来源方便、价格低廉，用该酶制备Mx、C－Y或Mc工艺简单方便、成本低、回收率高，产品质量好，可以满足医药、化妆及功能食品领域的需求，应用和开发价值极大。
文档编号C12P33/00GK1508260SQ02144779
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月13日 优先权日2002年12月13日
发明者杨凌, 何克江, 韩蔚, 吴磊, 杨 凌 申请人:中国科学院大连化学物理研究所