专利名称：活酵母细胞衍生物lycd的生产方法
技术领域：
本发明属于生物活性添加剂生产技术领域，特别涉及一种利用多种极端环境刺激生产活酵母细胞衍生物的方法。
背景技术：
随着经济的发展，人民生活水平的不断提高，人们对健康有了更高的要求，也越来越意识到生活环境和工作环境中存在着许多对健康不利的因素。为了有效防止外界不良环境对身体造成伤害和增强身体内部抵抗力，需要具有抗氧化、抗衰老、耐热、耐冷、抗电离辐射、抗电磁辐射、耐渗透压、耐酸碱的功能性化妆品、食品及医药制品，而且这些制品越来越受到人们的喜爱。因此具有上述功能活性添加剂是生产的关键。
活性添加剂的提取方法不一。从动物体内提取活性物质具有不安全性，从植物细胞提取，其成本高。活酵母细胞衍生物LYCD正是具有上述功能生物活性添加剂。
早在19世纪40年代，美国首先生产出活酵母细胞衍生物并已获得专利。作为化妆品配方的LYCD，是由低分子量糖苷/肽成分组成。其性能在于保湿、润肤、防晒的作用，(详见1.US Patent 2,239,345；2.Geoffrey J.Brooks，Live Yeast CellDerivative，Cosmetics and Tolletries，vol.110(1995)；3.黄汉生，活酵母细胞衍生物，黑龙江日化，vol.3(1996))，但是这些功能已不能满足人们对健康的要求。其问题主要是(1)活酵母细胞衍生物LYCD产品功能单一LYCD的生产只采用紫外线刺激，这样LYCD的作用局限于抗紫外线、防晒的化妆品。不能够为有效防止外界各种不良环境对身体造成的伤害、制成系列的可针对抵制不同的极端环境、具有不同功效的酵母细胞衍生物LYCD于化妆品、食品、医药制品中，使得具有多重选择性的系列功能性化妆品、食品及医药制品的生产，至今还是空白。不能满足人们对不同功能产品的需求。
(2)上述产出的活酵母细胞衍生物是经紫外线伤害培养的，该种培养过程需要持续几天，其生产效率较低，生产成本也相对较高。
(3)应用蛋白水解酶将细胞破壁，其活性成分局限为低分子量的糖苷/肽。
因此提供具有抗氧化、抗衰老、耐热、耐冷、抗电离辐射、抗电磁辐射、耐渗透压或耐酸碱功能性活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，是当务之急，所以我们立项、准备进行研究。该项工作现已列为国家自然科学基金的研究课题。
发明内容
针对上述情况，本发明解决了多种极端环境对健康伤害的问题，提供了一种新的生产方法，利用多种极端环境刺激酵母细胞，使其代谢机制发生改变产生针对不同刺激方法的保护性物质，并结合现代生物技术，将其提取出来作为生物活性添加剂。
本发明的技术方案是充分利用酵母菌这种廉价微生物为原料，利用活酵母细胞内的生物化学过程与人体细胞内生物化学过程极为相似的原则，充分挖掘细胞防御系统的潜力，依靠不同极端环境的刺激使其产生对抗极端环境的活性物质。
活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，是以微生物活酵母菌为原料，经培养后；分别采用其存活的极端环境进行刺激，引起其代谢机制改变而产生的保护性物质；然后将酵母细胞破壁；提取胞内物质；即可制成作为功能性化妆品、功能性食品及医药制品的添加剂；具体包括以下步骤●选用适酵母菌作为菌源；●培养基斜面保存使用麦芽汁固体培养基，液体培养基使用适合酵母菌生长的含有蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、无机盐的培养基，所有的斜面菌种在28-30℃条件下静置培养48小时；●菌种的培养斜面菌种→液体菌种→液体培养至对数期；●极端环境刺激分别采用其存活的极端恶劣环境刺激酵母细胞；●菌体的收集不同方式刺激后的培养液，离心或过滤收集菌体；●菌体破壁应用物理、化学、生物方法破碎细胞壁；●LYCD的提取应用离心分离或过滤方法除去沉淀，可溶的原生质提取物或其浓缩后的冻干产品为LYCD。
需要说明的是用活酵母存活的极端环境进行刺激，采用氧化还原电位高的物质进行刺激，具体选择下述一种方法1)在培养液中添加氧化还原电位高的H2O2，H2O2浓度为0.1-4mM，也可为0.2-2mM；28-30℃水浴摇床培养0.5-3h；2)在培养液中通入氧化还原电位高的O3，O3浓度为0.1-2ppm，也可为0.2-1ppm，28-30℃水浴摇床培养0.5-3h。
用活酵母存活的极端环境进行刺激，也可采用氧化还原电位低的物质，即在培养液中添加维生素C或维生素E，其浓度为5-10ug/ml，也可为6-8ug/ml，28-30℃水浴摇床培养2-5h。
用活酵母存活的极端环境进行刺激，也可采用其存活的极端温度，具体选择下述一种方法1)高温刺激培养液从最适培养温度转变为高温35-50℃，继续培养1-3h；2)低温刺激培养液从最适培养温度转变为抑制其生长繁殖的低温4-10℃，继续培养1-3h。
用活酵母存活的极端环境进行刺激，也可采用电离辐射的刺激，即培养液经α、β或γ射线照射，照射剂量为0.5-2Gy，也可为0.5-1Gy，在照射的同时以28-30℃培养，培养时间为1-5h。
用活酵母存活的极端环境进行刺激，也可采用电磁辐射的刺激，即培养液经电磁辐射，辐射强度越大，照射时间越短，辐射剂量为50-100Hz，也可为60-80Hz。照射时间为2-5h，辐射强度与照射时间成反比，同时在28-30℃培养2-5h。
用活酵母存活的极端环境进行刺激，也可采用高渗透压的环境刺激，即酵母细胞在含有高浓度的NaCl、MgCl2的培养液中培养，NaCl浓度为100-150mM，MgCl2浓度为50-100mM，细胞外渗透压为100-200mOsmol，28-30℃培养0.5-2h。
用活酵母存活的极端环境进行刺激，也可采用酸性或碱性环境的刺激，具体选择下述一种方法1)向培养液中滴加酸，使培养液的pH值为3-5，28-30℃培养0.5-3h；2)向培养液中滴加碱，使培养液的pH值为8-10，28-30℃培养0.5-3h。有益效果本发明充分利用酵母菌这种廉价微生物为原料，利用活酵母细胞内的生物化学过程与人细胞内生物化学过程极为相似的原则，充分挖掘细胞防御系统的潜力，依靠不同极端环境的刺激使其产生对抗极端环境的活性物质。本发明依靠微生物繁殖快、易培养、代谢能力强的特性，大幅度缩短了生产周期，利用现代生物技术取代传统方法制备LYCD，如采用多种破壁方法和提取方法，并根据不同的刺激方式，使LYCD的主要活性成分除多肽和糖类外，还应激产生针对不同极端环境的活性蛋白。对于不同抗性的产生，正是活性蛋白与多肽、糖类共同作用的结果。同时也克服了传统LYCD的单一作用，生产出抗氧化、抗衰老、耐高温、耐低温、抗电离辐射、抗电磁辐射、耐高渗、耐强酸、耐强碱的多种活性物质，这些活性物质是具有良好性能的生物活性添加剂。从而使功能性化妆品、功能性食品及医药制品中具有多重选择性、本发明的主要优点如下(1)生产成本低、投资少、见效快、效益高；(2)实用性强，操作方便，易推广；(3)不采用蛋白酶水解的方法进行破壁，而选择其它多种破壁方法，这样活性成分既包含了低分子量物质，又包含了高分子量的活性蛋白。
(4)可根据不同要求，选择多种不同抗性生物活性添加剂LYCD，满足多方面的需求。
(5)为长期在不良环境中工作的人们，提供了一种有效抵抗不良环境的方式。
(6)从微生物中提取活性物质，避免了从动物体内提取活性物质的不安全性和从植物细胞提取的高成本。
(7)促进了化妆品和食品生产领域的扩展，应用现代生物技术与其有机结合，将会开发出多种新型的功能性化妆品、功能性食品。
综上所述，本发明通过生产不同功效的活酵母细胞衍生物LYCD，为充分发挥LYCD对抗相应极端环境的作用、解决极端环境对人类健康的不利影响，提供一种有效的途径，既有经济效益又有社会效益。
具体实施例方式
●培养基斜面保存使用麦芽汁固体培养基，液体培养基使用适合酵母菌生长的含有蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、无机盐的培养基。所有的斜面菌种在28-30℃条件下静置培养48小时。
●菌种的培养斜面菌种→液体菌种→液体培养至对数期。
●H2O2的刺激在培养液中添加H2O2，H2O2浓度为0.1mM，28-30℃水浴摇床培养●菌体的收集H2O2刺激后的培养液，离心收集菌体。
●菌体破壁采用液氮法破碎细胞壁。
●LYCD的提取应用离心分离法除去沉淀，可溶的原生质提取物为LYCD。
该法生产的LYCD可添加到化妆品中，用于抵抗氧化引起的衰老。
实施例8
活酵母存活的极端氧化环境为O3，刺激生产活酵母细胞衍生物的方法在培养液中通入O3，O3浓度为2ppm，28-30℃进行水浴摇床培养1h。过滤收集菌体。其它步骤同实施例1。
该法生产的LYCD可添加到化妆品中，用于抵抗极端还原环境对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到医药中，用于抵抗高温对人体的伤害。
一种利用活酵母存活的极端温度刺激生产活酵母细胞衍生物的方法，其极端温度采用高温刺激，即培养液从最适培养温度转变为高温40℃，继续培养3h。破壁方法采用强酸破壁法。其它步骤同实施例1。
该法生产的LYCD可添加到医药中，用于抵抗低温对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到化妆品及医药制品中，用于抵抗电离辐射对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到化妆品及医药制品中，用于抵抗电离辐射对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到化妆品及医药制品中，用于抵抗电离辐射对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到化妆品及医药制品中，用于抵抗电磁辐射对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到医药制品中，用于抵抗高渗透压环境对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到医药制品中，用于抵抗酸性环境对人体的伤害。
该法生产的LYCD可添加到医药制品中，用于抵抗碱性环境对人体的伤害。
权利要求
1.活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于以微生物活酵母菌为原料，经培养后；分别采用其存活的极端环境进行刺激，引起其代谢机制改变而产生的保护性物质；然后将酵母细胞破壁；提取胞内物质；即可制成作为功能性化妆品、功能性食品及医药制品的添加剂；具体包括以下步骤●选用活酵母菌作为菌源；●培养基斜面保存使用麦芽汁固体培养基，液体培养基使用适合酵母菌生长的含有蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、无机盐的培养基，所有的斜面菌种在28-30℃条件下静置培养48小时；●菌种的培养斜面菌种→液体菌种→液体培养至对数期；●极端环境刺激分别采用其存活的极端恶劣环境刺激酵母细胞；●菌体的收集不同方式刺激后的培养液，离心或过滤收集菌体；●菌体破壁应用物理、化学、生物方法破碎细胞壁；●LYCD的提取应用离心分离或过滤方法除去沉淀，可溶的原生质提取物或其浓缩后的冻干产品为LYCD。
2.按照权利要求1所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于用活酵母存活的极端环境进行刺激，采用氧化还原电位高的物质进行刺激，具体选择下述一种方法1)在培养液中添加H2O2，H2O2浓度为0.1-4mM，28-30℃水浴摇床培养0.5-3h；2)在培养液中通入O3，O3浓度为0.1-2ppm，28-30℃水浴摇床培养0.5-3h。
3.按照权利要求2所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于采用氧化还原电位高的物质进行刺激，具体选择下述一种方法1)在培养液中添加H2O2时，H2O2浓度为0.2-2mM；2)在培养液中通入O3时，O3浓度为0.2-1ppm。
4.按照权利要求1所述的适酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于用活酵母存活的极端环境进行刺激，是采用氧化还原电位低的物质，即在培养液中添加维生素C或维生素E，其浓度为5-10ug/ml，28-30℃水浴摇床培养2-5h。
5.按照权利要求4所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于氧化还原电位低的物质，即在培养液中添加维生素C或维生素E，其浓度为6-8ug/ml。
6.按照权利要求1所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于用活酵母存活的极端环境进行刺激，采用其存活的极端温度，具体选择下述一种方法1)高温刺激培养液从最适培养温度转变为高温35-50℃，继续培养1-3h；2)低温刺激培养液从最适培养温度转变为抑制其生长繁殖的低温4-10℃，继续培养1-3h。
7.按照权利要求1所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于用活酵母存活的极端环境进行刺激，采用电离辐射的刺激，即培养液经α、β或γ射线照射，照射剂量为0.5-2Gy，照射的同时在28-30℃培养，培养时间为1-5h。
8.按照权利要求5所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于采用电离辐射的刺激，即培养液经α、β或γ射线照射，照射剂量为0.5-1Gy。
9.按照权利要求1所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于用活酵母存活的极端环境进行刺激，是采用电磁辐射的刺激，即培养液经电磁辐射，辐射剂量为50-100Hz，照射时间为2-5h，辐射强度与照射时间成反比，同时在28-30℃培养2-5h。
10.按照权利要求7所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于采用电磁辐射的刺激，即培养液经电磁辐射，辐射剂量为60-80Hz。
11.按照权利要求1所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于用活酵母存活的极端环境进行刺激，是采用高渗透压的环境刺激，酵母细胞在含有高浓度的NaCl、MgCl2的培养液中培养，NaCl浓度为100-150mM，MgCl2浓度为50-100mM，细胞外渗透压为100-200mOsmol，28-30℃培养0.5-2h。
12.按照权利要求1所述的活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，其特征在于用活酵母存活的极端环境进行刺激，是采用酸性或碱性环境的刺激，即具体选择下述一种方法1)向培养液中滴加酸，使培养液的pH值为3-5，28-30℃培养0.5-3h；2)向培养液中滴加碱，使培养液的pH值为8-10，28-30 ℃培养0.5-3h。
全文摘要
活酵母细胞衍生物LYCD的生产方法，属于制备生物活性添加剂领域。特别涉及一种利用多种极端环境刺激活酵母细胞衍生物的生产方法。本发明解决了目前活酵母细胞衍生物LYCD产品功能单一、生产效率较低，成本相对较高的问题。其方法是通过多种极端环境，分别对酵母细胞进行刺激，引起代谢机制改变而产生活酵母细胞衍生物；利用现代生物技术破壁，提取出具有抗氧化、抗衰老、耐热、耐冷、抗电离辐射、抗电磁辐射、耐渗透压、耐酸或耐碱的多种不同抗性功能活酵母细胞衍生物LYCD；从而使功能性化妆品、功能性食品及医药制品所需的添加剂具有多重选择性。为解决不良环境对人类健康的不利因素，提供有效的途径，既有经济效益又有社会效益。
文档编号C12P1/02GK1480527SQ0313041
公开日2004年3月10日 申请日期2003年7月18日 优先权日2003年7月18日
发明者路福平, 杨华, 杜连祥, 戚薇 申请人:天津科技大学