专利名称：一种微生物固定化方法
技术领域：
本发明是关于微生物细胞固定化技术的，特别涉及一种新的固定化乳酸菌可连续化生产的工艺方法。
背景技术：
乳酸菌素是一类由乳酸菌发酵产生的具有抗菌作用的一类蛋白或经过加工的多肽类物质，可以抑制或杀死多数革兰氏阳性致病菌，少数对革兰氏阴性菌有效。经过前人的研究发现，虽然其不能用作抗生素，但可以用作食品防腐剂，并且作为食品防腐剂它具有不会在体内蓄积而引起不良反应，可降低杀菌温度，减少热处理时间等诸多优点。到目前为止，唯一商业化的乳酸菌素只有Nisin (—种乳酸链球菌素的天然生物活性抗菌肽)，Nisin本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏等优点。目前Nisin的工业生产时采用乳酸菌在一定条件下发酵、提取和加工取得。Nisin分子呈酸性，在酸性底物中较易溶解，pH上升则溶解性和热稳定性均下降。发酵生产时，乳酸菌还会生产乳酸，乳酸是一种弱酸，随着发酵液中乳酸和Nisin的积累，体系的pH会下降，会对乳酸菌细胞产生一定伤害，使Nisin产量下降，如果调节发酵液PH至适宜菌体生长，则Nisin的溶解性和稳定性会下降。细胞固定化技术恰能弥补上述生产中的缺陷。而当前对于乳酸菌的固定化的研究处于实验室探索阶段，多采用包埋法，载体材料多选用天然有机载体材料，如海藻酸盐、卡拉胶、纤维素及其衍生物、琼脂等，这些材料一般机械强度较低，传质较差，影响营养物质的供给和产物的导出；另外，Nisin本身是一种分子量为3510的多肽，因此在凝胶内的扩散有可能会受到较大的影响，造成凝胶内积累较高浓度的Nisin，从而抑制凝胶内乳酸菌细胞生长和继续合成Nisin,使固定化细胞发酵液pH下降，Nisin效价降低,使得固定化细胞生产方式接近于游离细胞发酵水平；且固定化细胞成型操作繁琐，过程中易染菌，且不能实现连续化工业生产。
发明内容
本发明的目的是改变乳酸菌固定化生产Nisin在规模化生产道路上停滞不前的现状，提供一种以吸附法为固定化方法的整套工艺流程，实现固定化的连续化生产和便捷操作，以及可以用来研究乳酸菌固定化的连续化生产效果，为其他微生物固定化的规模化和规范化生产提供依据。本发明采用全开孔的聚氨酯泡沫作为固定化载体材料同时结合相应的反应器，固定化细胞技术，可以保护细胞不受外界不利条件(如酸、碱、有害离子等)的影响，也不影响传质、营养物质的供给和产物的导出，同时保持菌种高活性，且可反复利用。由于连续发酵过程中发酵液的连续流加和发酵产物Nisin和乳酸的及时排出，既减低了发酵过程中发酵液的减少对菌体生长和生产的限制，也减少了由于产物的累积所造成的PH的降低对菌体生长和生产的影响。本发明通过如下技术方案予以实现:
—种微生物固定化方法，具体包括以下步骤:(1)载体材料预处理:制备阳离子型聚氨酯泡沫载体，将孔径为30-60PPI的聚氨酯泡沫载体材料置于3%-10%盐酸处理15-24小时；(2)反应器和材料灭菌:将步骤(1)的阳离子型聚氨酯泡沫载体填充到反应器中，进行直接在线灭菌；该反应器的底部设置有微孔介质；(3)接种:加入乳酸菌培养液，并按5-10%的接种量接入乳酸菌；其中乳酸菌培养基的配比为:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氢钾2%，蔗糖1.5%，玉米浆0.3%，半胱氨酸0.023%，无碘精盐 0.15%, MgSO4.7Η200.015%, pH 为 7.2 ;(4)固定化:采用吸附法，将接种过的反应器于25_35°C保温6_12小时，乳酸菌大量生长并吸附在聚氨酯泡沫表面；(5)连续发酵:收集反应器中的发酵液和游离菌体；流加新鲜培养液，控制流速
0.l_2rpm，使发酵产品稳定直接流出，由装有pH=2的盐酸缓冲液的容器接收。所述步骤(2)中的载体材料的形状和直径与反应器的形状和直径相同。所述步骤(2)中的微孔介质为烧结玻璃，作为固定化载体的支撑物。本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果:1、本发明中载体材料经过一定处理后填充入发酵容器内，操作简单，灭菌方便。2、本发明中接种细胞和载体材料加入(制作)分开进行。3、本发明中菌体固定和连续发酵在同一反应器内进行。减少杂菌污染的几率。4、本发明中使用的载体材料是经过灭菌后可以再次接种、重复使用的材料。5、本发明中再次接种不需要载体重新成型，操作简单，不易染菌。6、本发明中不断泵入新鲜培养液，放出发酵液，可以基本保持体系内环境适于乳酸菌生长，而接收发酵液的容器内加入一定量酸液，使发酵液中的Nisin稳定，实现连续化生产。
具体实施例方式本发明的原理是有些载体材料对微生物细胞有吸附能力，可将细胞吸附在其表面，由于这些材料一般多孔，培养液及产物传质效果较好，利于被固定的细胞的生长。本发明采用吸附法，利用有机多孔材料和细胞表面之间的静电引力作用将细胞固定在材料表面，对细胞活性影响较小，且培养液及产物传质效果较好。本发明利用有吸附能力的阳离子型聚氨酯泡沫将乳酸菌细胞吸附固定在其棱表面，使PH为中性的培养液在体系内流动，为乳酸菌细胞提供新鲜的营养物质，并带走会使体系pH下降、对乳酸菌细胞造成伤害的产物Nisin,实现Nisin的连续化生产。本发明的生产工艺包括:填充载体材料；加入发酵培养液,接种，菌体固定化 ’夹套通恒温循环水；通入新鲜培养液,接收发酵液；定时取样,检测发酵液pH、游离细胞量和Nisin效价等参数。上述填充载体材料的形状和体积是通过发酵容器容积和工作容积等计算得到。上述新鲜培养液的加入过程是通过蠕动泵实现，并控制适宜流速。本发明具体实施例如下。实施例1
1.预处理:将孔径为30PPI的聚氨酯泡沫载体材料置于3%盐酸处理24小时。2.灭菌:将处理好的载体材料填充到反应器内，进行整体灭菌。其他管线设备置于灭菌锅内于121°C，20min进行灭菌。然后反应器在超净台内连接加料和放液胶管；在超净台外，连接30°C循环水管路及蠕动泵。3.反应器接种:在无菌条件下，向反应器内加入乳酸菌培养液，直至没过载体材料顶部；乳酸菌培养基的配比为:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氢钾2%，蔗糖1.5%，玉米浆0.3%，半胱氨酸0.023%,无碘精盐0.15%，MgSO4.7Η200.015%，pH为7.2 ;接菌(5%接种量)。4.乳酸菌固定化:反应器接种后有循环水提供30°C培养环境，然后稳定培养8小时。5.连续发酵:固定化结束后，打开反应器出口流出发酵液，开进料泵，控制流速
1.5rpm,向冷凝管中打入新鲜培养液，流出发酵液滴入pH=2的酸液的锥形瓶内收集。期间不断取流出发酵液检测菌体浓度、PH值和Nisin效价。实验测得，最终pH稳定在6.5，菌体浓度亦达到稳定，且Nisin效价达到3000IU/ml, 13个小时的连续稳定发酵过程中Nisin效价仅有略微下降。实施例21.预处理:将孔径 为60PPI的聚氨酯泡沫载体材料置于10%盐酸处理16小时。
2.灭菌:将处理好的载体材料填充到反应器内，进行整体灭菌。其他管线设备置于灭菌锅内于121°C，20min进行灭菌。然后反应器在超净台内连接加料和放液胶管；在超净台外，连接35°C循环水管路及蠕动泵。3.反应器接种:在无菌条件下，向反应器内加入乳酸菌培养液，直至没过载体材料顶部；乳酸菌培养基的配比为:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氢钾2%，蔗糖1.5%，玉米浆 0.3%，半胱氨酸 0.023%,无碘精盐 0.15%，MgSO4.7Η200.015%，pH 为 7.2 ;接菌(10% 接
种量)。4.乳酸菌固定化:反应器接种后有循环水提供35°C培养环境，然后稳定培养7小时。5.连续发酵:固定化结束后，打开反应器出口流出发酵液，开进料泵，控制流速
1.5rpm,向冷凝管中打入新鲜培养液，流出发酵液滴入pH=2的酸液的锥形瓶内收集。期间不断取流出发酵液检测菌体浓度、PH值和Nisin效价。实验测得，最终pH稳定在7.0,菌体浓度亦达到稳定，且Nisin效价达到3500IU/ml, 12个小时的连续稳定发酵过程中Nisin效价在3100_3500IU/ml之间波动。
权利要求
1.一种微生物固定化方法，具体包括以下步骤: (1)载体材料预处理:制备阳离子型聚氨酯泡沫载体，将孔径为30-60PPI的聚氨酯泡沫载体材料置于3%-10%盐酸处理15-24小时； (2)反应器和材料灭菌:将步骤(I)的阳离子型聚氨酯泡沫载体填充到反应器中，进行直接在线灭菌；该反应器的底部设置有微孔介质； (3)接种:加入乳酸菌培养液，并按5-10%的接种量接入乳酸菌；其中乳酸菌培养基的配比为:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氢钾2%，蔗糖1.5%，玉米浆0.3%，半胱氨酸0.023%，无碘精盐 0.15%, MgSO4.7Η200.015%, pH 为 7.2 ; (4)固定化:采用吸附法，将接种过的反应器于25-35°C保温6-12小时，乳酸菌大量生长并吸附在聚氨酯泡沫表面； (5)连续发酵:收集反应器中的发酵液和游离菌体；流加新鲜培养液，控制流速0.l_2rpm，使发酵产品稳定直接流出，由装有pH=2的盐酸缓冲液的容器接收。
2.根据权利要求1所述的一种微生物固定化方法，其特征在于:所述步骤(2)中的载体材料的形状和直径与反应器的形状和直径相同。
3.根据权利要求1所述的一种微生物固定化方法，其特征在于:所述步骤(2)中的微孔介质为烧结玻璃，作为固定 化载体的支撑物。
全文摘要
本发明公开了一种微生物固定化方法，包括乳酸菌的固定化和Nisin的连续生产工艺。首先菌体在反应器内生长并吸附于载体材料上；然后放出游离菌体后加入新鲜培养液，结合反应器的高径比，控制流速使发酵液刚好到达反应器底部流出时产物Nisin量达到最高；最后产物从底部流入产物收集罐。同时使用的载体是可重复使用的聚氨酯泡沫载体材料，整个过程操作简单，由于移除了影响乳酸菌生长和生产的两个限制性因素-营养成分减低和产物引起的低pH-可实现乳酸菌在较高的Nisin产率下连续化生产。
文档编号C12N11/08GK103146673SQ201310065818
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者朱宏吉, 王卫华, 王立红, 刘朝, 乔建军 申请人:天津大学