专利名称：一种褐藻胶裂解酶基因algL及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋假单胞菌(Pseudomonas sp.)QDA的褐藻胶裂解酶基因algL。本发明还公开了含有该基因的载体和大肠杆菌重组株及其表达产物的生产方法和应用。
背景技术：
褐藻胶是由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸两种糖单元连续或交替连接而成的线性多糖分子。近年来，随着糖生物学和糖化学研究的飞速发展，人们发现不同聚合度的褐藻胶低聚糖混合物具有重要的药用价值，如降血脂、抗肿瘤、抗病毒等，有望开发成为新一代海洋药物。褐藻胶低聚糖的制备有多种方法，如酸降解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法。褐藻胶裂解酶催化糖单元之间相连的1，4-糖苷键发生水解，然后在断裂后新生成的非还原端C4-羟基处发生C4，5-位的脱水反应，生成C4，5双键。褐藻胶的酶法降解优于其它方法，反应条件温和，降解反应易于控制，特别是有利于高纯度单一低聚糖的制备，对褐藻胶低聚糖药物的开发和应用研究具有重要作用。迄今已经使用褐藻酸钠限制性培养基从各种可培养生物中，特别是从大量的海洋微生物中获得了众多褐藻胶裂解酶，但是由于酶的活性低、底物专一性差，无法实现产业化生产，因而严重阻碍了褐藻胶低聚糖类化合物的大量制备以及构效关系的研究，乃至进一步阻碍了应用开发的深入进展。因此，开发活性高、底物专一性强的褐藻胶裂解酶及其基因资源，成为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋假单胞细菌(Pseudomonas sp.)QDA的褐藻胶裂解酶基因及其制备方法和应用，它能弥补现有技术的上述不足。
一种褐藻胶裂解酶基因algL，其特征在于它编码海洋假单胞菌QDA的褐藻胶裂解酶的基因。
一种褐藻胶裂解酶基因algL的制备方法，其特征在于以简并PCR筛选法自海洋假单胞菌QDA的基因组DNA文库中克隆褐藻胶裂解酶基因algL。
将本发明的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌克隆载体pD45。
将本发明的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌重组株pD45/DH5α。
将本发明的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌表达载体pLyase-A。
将本发明的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌重组株pLyase-A/Top10F’。
将本发明的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备重组褐藻胶裂解酶。
将本发明的褐藻胶裂解酶基因algL用于降解褐藻胶制备甘露糖醛酸低聚糖。
本发明的褐藻胶裂解酶基因algL是编码海洋假单胞菌QDA的褐藻胶裂解酶的基因，用其生产的重组褐藻胶裂解酶温度和pH稳定性好，活性高，能降解均聚甘露糖醛酸，降解产物主要为聚合度2-15的低聚糖，因此可以用于褐藻胶低聚糖的制备。本发明的大肠杆菌重组菌株pLyase-A/Top10F’所表达的重组褐藻胶裂解酶占总蛋白的24％，表达水平高，易于纯化，且连续传代20代后表达量未有降低，所以通过本发明可以大量生产重组褐藻胶裂解酶，成本较低。
附图1为褐藻胶裂解酶基因algL的核苷酸序列。
附图2为根据褐藻胶裂解酶基因algL的核苷酸序列推测的氨基酸序列。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 褐藻胶裂解酶基因algL的克隆使用简并聚合酶链反应(PCR)引物对Pseudomonas sp.)QDA的基因组文库进行筛选，克隆褐藻胶裂解酶基因algL，具体操作为在含NaCl重量百分浓度为3％的Luria-Bertani(LB)培养基中培养Pseudomonassp.QDA至对数末期，提取基因组DNA。使用Sau3AI对该基因组DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收5～8kb的片断，与用BamHI完全酶切并经去磷酸化处理的pBluescript II KS(+)质粒片段连接。然后将连接产物按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，在LB固体培养基(含有氨苄青霉素、X-gal、IPTG)上培养。挑取白斑重组菌落，在LB液体培养基(含有氨苄青霉素)中培养后，分别直接使用简并引物对UpperA(5’AACCACACCGGCAARTCCAT3’)和LowerA(5’GCGGCGCTT SAKYTCGTTGG3’)进行菌液PCR反应，条件为94℃预变性4min，随后以94℃ 30s、62.6℃ 30s、72℃ 30s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。各菌株的PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳，其中一株在340bp处显示有一特异条带，则将对应的重组菌株大量培养，使用标准碱裂解法提取其质粒DNA，测序分析。最终通过生物信息学分析，确定其中的褐藻胶裂解酶基因algL的全核苷酸序列(附图1)，序列全长1098bp，编码一个含有365个氨基酸的蛋白质(附图2)。该阳性转化子命名为pD45/DH5α，将其含有的重组质粒命名为pD45。
实施例2 大肠杆菌表达载体pLyase-A的构建根据得到的褐藻胶裂解酶基因algL全序列设计上游引物(5‘CCGAAT TCA TCC CCC ACA GG GTT ACT AC G A3’)和下游引物(5‘CCC AAGCTT GCT TTT TTG CTC TCT GCG TTC G3’)；用PCR扩增得到褐藻胶裂解酶基因全序列。该PCR的条件为94℃预变性3min，随后以94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示1.0kb处有一特异条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，用Hind III和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收1.0kb的DNA片断。
将大肠杆菌表达载体pBAD gIII/A同样用Hind III和EcoR I酶切，琼脂糖电泳分离，回收4.1kb的DNA片段，将其与上述所得1.0kb的DNA片段连接后，按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌DH5α中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经HindIII和EcoR I酶切得到1.0kb和4.1kb两个片段，分别与褐藻胶裂解酶基因全长片段和表达载体pBAD gIII/A大小相同，证明褐藻胶裂解酶基因已经克隆到表达载体pBAD gIII/A中，将此重组质粒命名为pLyase-A。
实施例3 能高效表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌株pLyase-A/Top10F’的构建将表达载体pLyase-A按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌Top10F’中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经Hind III和EcoR I酶切得到1.0kb和4.1kb两个片段，分别与褐藻胶裂解酶基因algL全长片段和表达载体pBAD gIII/A，证明获得了能高效表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌重组株pLyase-A/Top10F’。
实施例4 利用大肠杆菌重组株pLyase-A/Top10F’生产重组褐藻胶裂解酶挑取大肠杆菌重组株pLyase-A/Top10F’单克隆接种在2ml含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃ 200r/min振荡培养过夜。按1∶50接种至100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃ 200r/min振荡培养至OD600为0.6，加入L-阿拉伯糖至终浓度1mM，继续培养3h，4℃ 5000×g离心30min收集菌体，重悬于12ml结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5 M NaCl)。将菌悬液于冰上超声破碎细胞15min，每作用10s暂停10s。4℃12000×g离心30min去除细胞碎片，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤出液上至用结合缓冲液平衡好的PreBondTMcolumn(Invitrogen)。用结合缓冲液和冲洗缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5M NaCl)冲洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用5ml pH6、pH4的缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液/0.5M NaCl)洗脱，SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带的洗脱液。用Lowry法测定目的蛋白浓度，分装后冻存于-80℃。
实施例5 利用重组褐藻胶裂解酶生产甘露糖醛酸寡糖重组褐藻胶裂解酶能专一性降解聚甘露糖醛酸分子。制备甘露糖醛酸寡糖时，将聚甘露糖醛酸溶于0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.5)，配成重量百分比浓度为0.1％～0.5％的溶液，按重量比0.1-1∶100加入实施例4中所得的重组褐藻胶裂解酶，混合均匀后在37℃温浴3～16h，70％-90％的产物为聚合度2-15的甘露糖醛酸寡糖。
权利要求
1.一种褐藻胶裂解酶基因algL，其特征在于它是编码海洋假单胞菌QDA的褐藻胶裂解酶的基因。
2.一种褐藻胶裂解酶基因algL的制备方法，其特征在于以简并PCR筛选法自海洋假单胞菌QDA的基因组DNA文库中克隆褐藻胶裂解酶基因algL。
3.将权利要求1所述的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌克隆载体pD45。
4.将权利要求1所述的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌重组株pD45/DH5α。
5.将权利要求1所述的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌表达载体pLyase-A。
6.将权利要求1所述的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备大肠杆菌重组株pLyase-A/Top10F’。
7.将权利要求1所述的褐藻胶裂解酶基因algL用于制备重组褐藻胶裂解酶。
8.将权利要求1所述的褐藻胶裂解酶基因algL用于降解褐藻胶制备甘露糖醛酸寡糖。
全文摘要
一种褐藻胶裂解酶基因algL，其特征在于它编码海洋假单胞菌QDA的褐藻胶裂解酶的基因。制备时，以简并PCR筛选法自海洋假单胞菌QDA的基因组DNA文库中克隆褐藻胶裂解酶基因algL。用本发明的褐藻胶裂解酶基因algL生产的重组褐藻胶裂解酶温度和pH稳定性好，活性高，能降解均聚甘露糖醛酸，降解产物主要为聚合度2－15的低聚糖，因此可以用于褐藻胶低聚糖的制备。本发明的大肠杆菌重组菌株pLyase－A/Top10F’所表达的重组褐藻胶裂解酶占总蛋白的24％，表达水平高，易于纯化，且连续传代20代后表达量未有降低，所以通过本发明可以大量生产重组褐藻胶裂解酶，成本较低。
文档编号C12P19/00GK1514000SQ0313882
公开日2004年7月21日 申请日期2003年7月10日 优先权日2003年7月10日
发明者于文功, 韩文君, 韩峰, 路新枝, 宫倩红 申请人:中国海洋大学