专利名称：嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，特别涉及一种嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺。
背景技术：
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)属弧菌科气单胞菌属，是人、鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类的致病菌，能导致鱼类细菌性败血症、蛙类红腿病以及人的腹泻等疾病，每年因此造成大量的经济损失。
嗜水气单胞菌的致病因子包括外毒素、胞外酶、膜上粘附因子、S层蛋白、菌毛、转铁蛋白和外膜蛋白等。Ah致病株的外毒素是重要的致病因子，其研究已相当深入。不同研究人员赋予外毒素以不同的称呼，如陆承平等报道的HEC毒素，Rose等报道的肠毒素，Bukley等报道的气溶素及Asao等报道的溶血素。溶血素是至关重要的毒力因子，其具有溶血性、肠毒性及细胞毒性作用，对鳗鲡、鲫鱼、小白鼠等受试动物具有独立的致病作用，是重要的保护性抗原。
嗜水气单胞菌病免疫预防研究已成为鱼病学研究的热点，现今的科研成果有嗜水气单胞菌灭活全菌疫苗，其在主要疫区推广应用，取得了一定的效果。但由于嗜水气单胞菌血清型众多，菌株间免疫原性存在差异，同时嗜水气单胞菌抗原结构复杂，不便于制备联苗，全菌苗经灭活后抗原性常发生变异，再则全菌苗颗粒大，被吸收的可能性较小，以上诸多因素制约了全菌灭活疫苗的推广普及。
现有基因工程亚单位疫苗保留了传统亚单位疫苗的优点，如安全性好，有效免疫成分专一，同时具有易于工业化生产，生产成本低等优点，但是免疫原性不强。在亚单位苗中使用佐剂可以显著增强亚单位疫苗的免疫原性，目前临床多使用的氢氧化铝、蜂胶等常规佐剂提高免疫原性的能力有限，而弗氏佐剂具备较强的增效作用，但其对动物的毒、副作用大，而被禁止在临床上使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，而提供一种对嗜水气单胞菌免疫原性强、免疫效果稳定、毒、副作用小，便于制备多联疫苗的免疫刺激复合物的制备工艺。
本发明的目的可以经如下方案实现。
嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其要点在于，具有如下步骤1、提供一种嗜水气单胞菌菌株，2、在培养基中对该菌株进行扩大培养而得培养液，3、从培养液中提取毒素，(1)提供一种离心机，(2)在离心机中对培养液离心后得上清液，(3)用饱和硫酸铵浓缩上清液中的毒素，于离心机中离心后取沉淀，(4)将沉淀用PBS重悬，并透析，获取悬液即为毒素，4、依如下顺序制备免疫刺激复合物，(1)将毒素浓缩至1～3mg/ml后第一次加有机酸处理1～3h，(2)加入Mega-10至终浓度为2％，在37℃下处理4h，(3)加入QuilA佐剂至终浓度为0.05～0.2％，(4)加入胆固醇、卵磷脂至终浓度为125μg·mL-1而得组合物，(5)第二次加有机酸处理组合物后透析4h，再用0.01M PBS透析72h，获取悬液即为免疫刺激复合物。
溶血素亦称溶血因子，是嗜水气单胞菌产生致病力的至关重要的毒力因子，其具有溶血性、肠毒性及细胞毒性作用。而此处的免疫刺激复合物是指溶血素与佐剂结合生成的产物，可直接作为疫苗使用。下面对该免疫刺激复合物的制备工艺作如下解释首先要提供一株嗜水气单胞菌的菌株，该菌株可以是自然存在的菌株，还可以是通过DNA重组技术获得的重组菌。本技术领域人员通过常规途径均可获得嗜水气单胞菌。
其二，对所提供的菌株进行扩大培养以便于制备大量的含有该嗜水气单胞菌的培养液。该菌株的培养可以采用本领域技术人员所熟知的菌株培养技术进行。
其三，将培养液在离心机中离心而获取上清液，该上清液中主要含有溶血素，或还含有其它有效免疫成分，而采用饱和硫酸铵处理上清液是为了使上清液中的毒素蛋白可以部分得到浓缩和提纯，然后再用离心机从上清液中分离毒素(即沉淀或抗原)，最后沉淀用PBS透析去除硫酸铵、透析后的悬液即为提纯后的毒素。
其四，将毒素浓缩至1～3mg/ml后加入有机酸处理1～3h，有机酸的处理是为了使毒素蛋白被酸化处理而暴露其疏水区，经Mega-10处理并加入Quil A佐剂至终浓度为0.05～0.2％，接着加入胆固醇、卵磷脂至终浓度为125μg·mL-1，这样有利于形成稳定的笼络状结构，再一次用有机酸处理后透析4h及用PBS透析72h，获取悬液即为免疫刺激复合物。
本发明采用特殊的从未应用于嗜水气单胞菌的免疫刺激复合物的制作工艺，用有机酸的处理使毒素蛋白被酸化而暴露其疏水区，使其更容易与Quil A佐剂组合而成为免疫刺激复合物，这样，在电镜下观察免疫刺激复合物具有典型笼格状颗粒结构，因而其抗原决定簇更能充分暴露，从而有效地激活免疫系统的体液免疫(B细胞)、细胞免疫(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)所有三种途径，故而免疫效果稳定，增效作用强，这种效果是现有技术中所使用的基因工程亚单位疫苗或全菌灭活疫苗所无法达到的。
同时，它又可以产生强烈而持久的免疫应答，免疫保护期长，经研究试验发现，载有各种抗原的免疫刺激复合物诱导的抗体效价比单用抗原或蛋白颗粒高10倍以上，而所用抗原剂量减少10倍，说明嵌入免疫刺激复合物中的抗原具有良好的免疫原性。
且本发明并未采用弗氏佐剂，因而也不会出现该免疫刺激复合物作为疫苗使用时对免疫受体的刺激太大的现象。同时这种免疫刺激复合物的免疫毒、副作用也较小。
免疫刺激复合物不仅是疫苗抗原的呈递者，而且还可呈递免疫刺激，产生强烈而持久的免疫应答，因而还可以作为佐剂。这是本发明的一出乎意料的效果。
本发明在于所用的有机酸为柠檬酸。
进而第一次加柠檬酸的浓度为0.25M。
第二次加柠檬酸的浓度为0.01M。
柠檬酸的使用可以暴露毒素蛋白(即抗原)的疏水区，以方便免疫受体内的免疫活性细胞——T细胞和B细胞识别抗原并与抗原结合。发明人采用浓度为0.25M的柠檬酸处理毒素蛋白，0.01M柠檬酸处理组合物，其与佐剂结合后的免疫刺激复合物对鳗鱼进行免疫，同剂量的免疫刺激复合物组在体液免疫应答方面比弗氏佐剂组和未加佐剂组具有更高的保护率，可达100％，弗氏佐剂组能达87.5％，而未加佐剂组只有50％。
本发明还在于所用的有机酸为pH2.5的甘氨酸缓冲液。
本发明所述的有机酸为可以使毒素蛋白暴露其疏水区的有机酸，例如还可以是苹果酸等。
提供一种对嗜水气单胞菌进行扩大培养的步骤如下1、将菌株接种于普通琼脂培养基，2、在29℃培养24-48小时得第一培养物，3、从第一培养物中挑取单个菌落，接种于5ml LB培养液中，4、在29℃培养24-48小时，当OD值为1.0时，取1ml分别接种于100ml TSB培养基中培养30小时，收获。
对于一种常用菌株的培养，现有技术中有很多的记载，区别仅在于培养时间的多寡，培养温度的高低，以及采用何种培养物。本发明人选择上述工艺步骤对嗜水气单胞菌进行培养的效果很好，且更方便后续工艺的进行。
本发明进一步还在于从培养液中获取含有毒素的上清液的具体步骤为在离心机中对培养液10000rpm离心30min后得上清液。
采用饱和硫酸铵处理上清液而使上清液中的毒素球蛋白可以部分得到浓缩和提纯而固液分离的技术常规技术中均有记载，而本发明特别提供一种用饱和硫酸铵梯度处理上清液，并于离心机中离心后取沉淀的具体步骤(1)在上清液中加入硫酸铵至20％的饱和度，4℃静置4小时，于离心机中10000rpm离心30min，弃沉淀，得第一上清液，(2)在第一上清液中加入硫酸铵至60％的饱和度，4℃静置4小时，于离心机中10000rpm离心30min，收集沉淀。
进而将沉淀用PBS重悬，并透析，每4小时换液一次，换液5-6次后收获悬液即为毒素，并于-20℃保存备用。
本发明的目的还可以经如下方案实现。
在上述所公开的技术方案的基础上同时还可以采用如下步骤组合物先用冰浴超声波处理8～10min，而后再用有机酸处理后透析。
冰浴超声波处理可以增加佐剂与毒素蛋白的结合能力，以增加免疫刺激复合物的免疫效果。
综上所述，本发明较之现有技术具有如下优点经本发明所提供的工艺可以令抗原决定簇充分暴露而与佐剂结合制成免疫刺激复合物，该免疫刺激复合物可有效地激活免疫系统的体液免疫(B细胞)、细胞免疫(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)所有三种途径，故而免疫效果稳定，增效作用显著，可以产生强烈而持久的免疫应答，使受免动物产生坚强的免疫保护力，而对免疫受体不会产生刺激。
图1为嗜水气单胞菌溶血素的免疫刺激复合物电镜图。
图2为第一次免疫后的ELISA血清抗体效价示意图。
图3为第二次免疫后的ELISA血清抗体效价示意图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例1一、所需材料(一)主要试剂Quil A购自北京中检维康技术有限公司；Mega-10购自华美生物工程公司。
(二)菌种嗜水气单胞菌L-316由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鱼病中心分离鉴定并构建其β-hemA重组菌。
(三)实验动物鳗鱼，购自福建省长乐鳗鱼场，规格200g左右。
二、嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，具有如下步骤1、提取嗜水气单胞菌L316的重组菌，2、在培养基中对该菌株进行扩大培养而得培养液，(1)将菌株接种于普通琼脂培养基，(2)在29℃培养24-48小时得第一培养物，(3)从第一培养物中挑取单个菌落，接种于5ml LB培养液中，(4)在29℃培养24-48小时，当OD值为1.0时，取1ml分别接种于100ml TSB培养基中培养30小时，收获。
3、从培养液中提取毒素，(1)提供一种离心机，(2)在离心机中对培养液10000rpm离心30min后得上清液，(3)用饱和硫酸铵处理上清液于离心机中离心后取沉淀，①在上清液中加入硫酸铵至20％的饱和度，4℃静置4小时，于离心机中10000rpm离心30min，弃沉淀，得第一上清液，②在第一上清液中加入硫酸铵至60％的饱和度，4℃静置4小时，于离心机中10000rpm离心30min，收集沉淀。
(4)将沉淀用PBS重悬，透析，每4小时换液一次，换液5-6次后收获悬液即为毒素，并于-20℃保存备用，4、依如下顺序制备免疫刺激复合物，(1)将毒素浓缩至2mg/ml后加入0.25M柠檬酸处理2h，(2)加入Mega-10至终浓度为2％，37℃裂解4h，(3)加入Quil A佐剂至终浓度为0.1％，(4)然后加入胆固醇(预先用氯仿溶解)、卵磷脂至终浓度为125μg·mL-1而得组合物，冰浴超声波处理8-10min，真空负压去氯仿，(5)用0.01M柠檬酸处理组合物后透析4h，再用0.01M PBS透析72h，获取悬液即为免疫刺激复合物。
三、测定毒素的溶血价将-20℃保存的毒素0.01mol·L-1PBS在微量板上作倍比稀释，加入V型96孔凝集板，每孔各加25μL，然后加入等量的1％兔红细胞置37℃1小时、4℃2小时后判定结果，以50％溶血的最高稀释度为溶血价。
测定毒素溶血价的结果为17.56HU·ml-1。
四、毒素蛋白质含量测定用DU Series 7000分光光度计(BECKMAN)按Bradford法测定，在波长595nm处测定A值，参照标准曲线得出蛋白的浓度。
测定结果毒素蛋白含量为3299ug。
五、免疫刺激复合物的电镜观察取待测样品10ul滴铜网，用2％磷钨酸钠染色，在JEM-120EX电镜上观察。
结果如图1所示。
六、采用免疫刺激复合物对鳗鱼进行免疫第一次免疫分六组进行，每组15尾。
I溶血素(PCB)，40ug·尾-1；II溶血素(PCB)与弗氏佐剂等量混合，40ug·尾-1；III免疫刺激复合物，20ug·尾-1；IV免疫刺激复合物，40ug·尾-1；V免疫刺激复合物，80ug·尾-1；VIPBS对照组，0.1ml；免疫方式肌注，每尾0.1-0.2ml。15天后每组各取5尾进行第二次免疫，免疫途径和剂量与第一次免疫相同。
免疫后的保护率测定结果见表1表1 二次免疫后的保护率第一次免疫后的保护率 第二次免疫后的保护率攻毒死亡 攻毒死亡保护率 保护率％尾数尾数 尾数尾数I 8 4 4/8 5 3 40II8 3 5/8 5 2 60III 8 2 6/8 5 1 80IV8 1 7/8 5 0 100V 8 2 6/8 5 0 100VI8 8 0/8 5 5 0七、对第一次免疫和第二次免疫后的鳗鱼提取毒素并进行酶联免疫吸附试验(ELISA)所提取的毒素按50ug·mL-1的量包被96孔酶标板(厦门茂源塑料厂)，空白对照用PBS包被，每孔50μL，4℃过夜。倒去孔内溶液，用含2％BSA的PBS-T室温封闭2小时，洗涤后加入待检血清样品(从1∶100开始作倍比稀释)，每孔50μL，室温反应1小时，PBS-T洗涤三次，然后加入鼠抗鳗鱼Ig的单克隆抗体(3D11和3H1混合后以1∶1000稀释)，每孔50μL，室温反应1小时，同上洗涤3次；加入羊抗鼠HRP标记的IgG(1∶1000稀释)，室温反应1小时，同上洗涤3次，再用蒸馏水冲洗1次。最后加入50μL的反应底物OPD，室温10-15min后显色，用2mol·L-1H2SO4终止反应。用酶联仪Microplate Reader(BioRad Mode 1550)在495nm处读取OD值。
ELISA实验结果见图2和图3。
本试验用柠檬酸处理嗜水气单胞菌溶血素以暴露其疏水区，使其更容易与Quil A结合。在免疫刺激复合物组中使用20ug、40ug、80ug三个剂量组，其中40ug剂量组效果最佳，保护率达到100％，80ug剂量组的血清抗体滴度与40ug组相同，但保护率与40ug组相同，也达到100％。第II组(弗氏佐剂)与第III组所产生的血清抗体滴度基本相同，但其保护率却比免疫刺激复合物组低，说明免疫刺激复合物在低的抗体滴度下能产生较高的保护率。
实施例2将实施例1的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺的步骤中的柠檬酸用pH2.5的甘氨酸缓冲液代替用于制备嗜水气单胞菌的免疫刺激复合物；将毒素浓缩至1mg/ml后加入pH2.5的甘氨酸缓冲液处理1h；加入Quil A佐剂至终浓度为0.05％；其余的实验材料及实验步骤与实施例1相同，实验效果40ug剂量组效果最佳，保护率达到100％，次之为80ug剂量组，可见采用甘氨酸处理毒素蛋白与柠檬酸处理毒素蛋白所获得的免疫刺激复合物用于对免疫受体进行体液免疫的效果基本相同。
最佳实施例将实施例1的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺的步骤如下步骤修改为将毒素浓缩至3mg/ml后加入0.25M柠檬酸处理3h；加入Quil A佐剂至终浓度为0.2％；其余的实验材料及实验步骤与实施例1相同，而实验效果与实施例2相同。
本发明各实施例未述部分与现有技术相同。
权利要求
1.嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，具有如下步骤(1)提供一种嗜水气单胞菌菌株，(2)在培养基中对该菌株进行扩大培养而得培养液，(3)从培养液中提取毒素，①提供一种离心机，②在离心机中对培养液离心后得上清液，③用饱和硫酸铵处理上清液于离心机中离心后取沉淀，④将沉淀溶用PBS重悬，并透析，获取悬液即为毒素，(4)依如下顺序制备免疫刺激复合物，①将毒素浓缩至1～3mg/ml后第一次加有机酸处理1～3h，②加入Mega-10至终浓度为2％，在37℃下处理4h，③加入Quil A佐剂至终浓度为0.05～0.2％，④加入胆固醇、卵磷脂至终浓度为125μg·mL-1而得组合物，(5)第二次加有机酸处理组合物后透析4h，再用0.01M PBS透析72h，获取悬液即为免疫刺激复合物。
2.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，所用的有机酸为柠檬酸。
3.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，第一次加柠檬酸的浓度为0.25M。
4.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，第二次加柠檬酸的浓度为0.01M。
5.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，所用的有机酸为pH2.5的甘氨酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，对嗜水气单胞菌进行扩大培养的具体步骤如下(1)将菌株接种于普通琼脂培养基，(2)在29℃培养24-48小时得第一培养物，(3)从第一培养物中挑取单个菌落，接种于5ml LB培养液中，(4)在29℃培养24-48小时，当OD值为1.0时，取1ml分别接种于100ml TSB培养基中培养30小时，收获。
7.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，从培养液中获取含有毒素的上清液的具体步骤为在离心机中对培养液10000rpm离心30min后得上清液。
8.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，用饱和硫酸铵处理上清液，并于离心机中离心后取沉淀的具体步骤(1)在上清液中加入硫酸铵至20％的饱和度，4℃静置4小时，于离心机中10000rpm离心30min，弃沉淀，得第一上清液，(2)在第一上清液中加入硫酸铵至60％的饱和度，4℃静置4小时，于离心机中10000rpm离心30min，收集沉淀。
9.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，将沉淀用PBS重悬，并透析，每4小时换液一次，换液5-6次后收获悬液即为毒素，并于-20℃保存备用。
10.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，其特征在于，组合物先用冰浴超声波处理8～10min，而后再用有机酸处理后透析。
全文摘要
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，特别涉及一种嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，步骤为将嗜水气单胞菌菌株培养而得培养液；培养液离心后得上清液，用饱和硫酸铵处理上清液，离心后取沉淀用PBS重悬、透析，获取悬液即为毒素；将毒素浓缩至1～3mg/ml后加入有机酸处理1～3h，加入Mega－10至终浓度2％，37℃处理4h，加入Quil A佐剂至终浓度0.05～0.2％，加入胆固醇、卵磷脂至终浓度125μg·mL－1，用有机酸处理后透析4h，获取悬液即为免疫刺激复合物。该免疫刺激复合物的免疫效果稳定，增效显著，可产生强烈而持久的免疫应答，使受免疫动物产生坚强的免疫保护力而不受刺激。
文档编号C12P21/00GK1583171SQ03152830
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月22日 优先权日2003年8月22日
发明者方勤美, 龚晖, 林天龙 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 方勤美, 龚晖, 林天龙