淀粉加工方法

专利名称：淀粉加工方法
技术领域：
本发明涉及在将颗粒淀粉水解成可溶性淀粉水解产物的一步法，该方法在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行。
背景技术：
已经描述了许多将淀粉转化成淀粉水解产物、诸如麦芽糖、葡萄糖或特种糖浆的方法，这些水解产物既可以用作增甜剂、也可以用作诸如果糖这类其它糖的前体。还可以将葡萄糖发酵成酒精或其它发酵产物。
淀粉是由葡萄糖单位组成的高分子量聚合物。它通常由约80％的支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉为支链多糖，其中α-1，4 D-葡萄糖残基的直链通过α-1，6糖苷键连接。
直链淀粉为由彼此通过α-1，4糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖单位构成的直链多糖。在将淀粉转化成可溶性淀粉水解产物的情况中，淀粉解聚。常用的解聚法由胶凝步骤和两个连续的工艺步骤、即液化工艺和糖化工艺组成。
颗粒淀粉由在室温下不溶于水的微观颗粒组成。当将含水淀粉浆加热时，颗粒溶胀且最终破裂，从而使淀粉分子分散于溶液中。在这种″胶凝″工艺过程中，粘度显著增加。当典型的工业化方法中固体浓度为30-40％时，必须使淀粉变稀或″液化″以便可以对其进行操作。目前主要通过酶促降解使粘度降低。在液化步骤过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解成较小的支链和直链单位(麦芽糖糊精)。液化步骤一般在约105-110℃下进行约5-10分钟、随后在约95℃下进行约1-2小时。然后使温度降至60℃，加入葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和任选的脱支酶、诸如异淀粉酶或支链淀粉酶并使糖化步骤进行约24-72小时。
从上述讨论中显然可以看到常规的淀粉转化法因在各种步骤中对温度的需求而极其耗能。由此需要能够选择在该方法中所用的酶以便整个工艺可以在不必使淀粉胶凝的条件下进行。这类方法是US4591560、US4727026和US4009074以及EP0171218专利的主题。
本发明涉及将颗粒淀粉在低于该淀粉的起始胶凝温度的温度下转化成可溶性淀粉水解产物的一步法。
发明概述本发明在第一个方面中提供了用于生产可溶性淀粉水解产物的一步法，该方法包括使含水颗粒淀粉浆在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行下列酶活性的同时作用的步骤第一种酶，它为第13族苷水解酶的成员、具有α-1.4-糖苷水解活性且包括第20族糖类结合成分(Carbohydrate-Binding Module Family 20)；和第二种酶，它为真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)或葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。
本发明在第二该方面中提供了基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)的生产方法，该方法包括使用本发明第一个方面的方法生产可溶性淀粉水解产物且进一步包括将该可溶性淀粉水解产物转化成基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)的步骤。
本发明在第三该方面中提供了燃料酒精或可饮用酒精的生产方法，该方法包括使用本发明第一个方面的方法生产可溶性淀粉水解产物且进一步包括将该可溶性淀粉水解产物发酵成酒精的步骤，其中发酵步骤与颗粒淀粉的水解步骤同时或分别/依次进行。
发明详述定义应将术语″颗粒淀粉″理解为生未热制的淀粉(raw uncooked starch)，即未进行胶凝的淀粉。淀粉作为微小的不溶于水的颗粒在植物中形成。这些颗粒在低于起始胶凝温度的温度下在淀粉中得到保护。当放入冷水中时，这些颗粒可以吸收少量液体。在高达50℃-70℃下，溶胀是可逆的，可逆性的程度取决于特定的淀粉。在较高的温度下，称作胶凝的不可逆溶胀开始发生。
应将术语″起始胶凝温度″理解为淀粉开始胶凝的最低温度。淀粉在60℃-70℃之间开始胶凝，确切的温度取决于具体的淀粉。起始胶凝温度取决于所加工淀粉的来源。小麦的起始胶凝温度约为52℃，马铃薯的起始胶凝温度约为56℃，而玉米的起始胶凝温度约为62℃。然而，淀粉原始的质量随特定植物种类的和生长条件的不同而改变且由此应对每批淀粉测定起始胶凝温度。
应将″可溶性淀粉水解产物″理解为本发明方法的可溶性产物且可以包括单糖类、二糖类和寡糖类，诸如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、环糊精及其任意的混合物。优选将至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的颗粒淀粉干固体转化成可溶性淀粉水解产物。
术语″特制糖浆″是本领域众所周知的术语且通过DE和糖类光谱表征(参见教科书″Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate″中p.50+上的文章″新特制的葡萄糖浆″，G.G.Birch和L.F.Green编辑，AppliedScience Publishers LTD.，London)。一般来说，特制糖浆具有35-45范围的DE。
在本发明的上下文中，将″第13族苷水解酶″定义为包括具有(β/α)8或TIM桶(barrel)结构且通过α-保留反应机制对淀粉和相关底物起作用的催化结构域的水解酶族(Koshland，1953，Biol.Rev.Camp.Philos.Soc 28，416-436)。
在本发明的上下文中，将具有″α-1.4-糖苷水解活性″的酶定义为包括由定义的Takata(Takata等，1992，J.Biol.Chem.267，18447-18452)和Koshland(Koshland，1953，Biol.Rev.Camp.Philos.Soc 28，416-436)催化α-1.4-糖苷键水解和/或合成的酶族。
在本发明的上下文中，将″第20族糖类结合成分″或CBM-20成分定义为与Joergensen等(1997)在Biotechnol.Lett.191027-1031

图1中公开的多肽的糖类结合成分(CBM)具有至少45％同源性的约100个氨基酸的序列。CBM包括该多肽的最末的102个氨基酸，即来自第582位氨基酸-第683位氨基酸的亚序列。
(a)属于第13族苷水解酶族成员、(b)具有α-1.4-糖苷水解活性且(c)包括第20族糖类结合成分，并且为本发明特别关注的酶包括分类为EC 2.4.1.19的酶、即环糊精葡聚糖转移酶和EC 3.2.1.133、即生麦芽糖α-淀粉酶和3.2.1.1α-淀粉酶和3.2.1.60麦芽四糖形成淀粉酶中的选择成员。
通过在与淀粉一起保温过程中按照Wind，R.D.等1995在Appl.Environ.Microbiol.611257-1265所述测定还原能力(reducing power)的增加来确定CGTases和生麦芽糖α-淀粉酶的″水解活性″。使用Bernfield(Bernfield，P.1955.Amylases alpha and beta.Methods Enzymol.1149-158)的二硝基水杨酸法经适当修改来测定还原糖的浓度。在60℃下将稀释的酶与1％(wt/v)可溶性淀粉(来自荷兰Avebe的Paselli SA2淀粉或可以选择来自Merck的可溶性淀粉)一起在10mM柠檬酸钠(pH 5.9)缓冲液中保温适当时间期限。将一个单位的水解活性定义为在标准条件下每分钟产生1微摩尔麦芽糖的酶量。
将在本说明书中涉及的多肽″同源性″理解为表示第一种序列从第二种序列衍生的两种序列之间的同一性程度。可以通过本领域中公知的计算机程序适当测定同源性，诸如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin Package程序手册，Version 8，8月，1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Joumal of Molecular Biology，48，443-453。使用下列对多肽序列比较的设定GAP生成补偿(penalty)3.0且GAP扩展补偿为0.1。
环糊精葡聚糖转移酶(CGTases)用作本发明方法中的第一种酶的具体酶可以为环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(E.C.2.4.1.19)、也称作环糊精葡聚糖转移酶或环糊精糖基转移酶，在下文中称作CGTase，它通过分子内转糖基反应将淀粉和相似底物催化转化成环麦芽糖糊精，由此形成各种大小的环麦芽糖糊精。大部分CGTases既具有转糖基活性、又具有降解淀粉的活性。所关注的CGTases优选来源于微生物且最优选来源于细菌。特别关注的CGTases包括与WO02/06508中SEQ ID NO2的第1-679位氨基酸所示序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的CGTases；与Joergensen等1997在Biotechnol.Lett.191027-1031图1中公开的多肽氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的CGTases；以及US5278059和US5545587中所述的CGTases。优选作为所述方法第一种酶使用的CGTase具有的水解活性至少为3.5、优选至少为4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或最优选至少为23微摩尔/分钟/mg。可以加入0.01-100.0NU/g DS、优选0.2-50.0NU/g DS、优选10.0-20.0NU/g用量的DS CGTases。
生麦芽糖α-淀粉酶用作本发明方法的第一种酶的另一种具体酶为生麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。生麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。此外，生麦芽糖α-淀粉酶能够水解麦芽三糖和环糊精。特别关注的生麦芽糖α-淀粉酶可以来源于芽孢杆菌属的种类、优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌、最优选来源于诸如描述在EP120.693中的嗜热脂肪芽孢杆菌C599。这种特定的生麦芽糖α-淀粉酶具有如US6162628中SEQ ID NO1的第1-686位氨基酸所示的氨基酸序列。优选的生麦芽糖α-淀粉酶含有的氨基酸序列与US6162628中SEQ ID NO1的第1-686位氨基酸具有至少70％的同一性、优选至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％的同一性。最优选的生麦芽糖α-淀粉酶的变体包括WO99/43794中公开的变体。
含有如US6162628中SEQ ID NO1的第1-686位氨基酸所示的氨基酸序列的生麦芽糖α-淀粉酶具有714的水解活性。优选用作本发明方法第一种酶的生麦芽糖α-淀粉酶具有至少3.5、优选至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、100、200、300、400、500、600或最优选至少700微摩尔/分钟/mg的水解活性。
可以加入0.01-40.0MANU/g DS、优选0.02-10MANU/g DS、优选0.05-5.0MANU/g用量的生麦芽糖α-淀粉酶。
真菌α-淀粉酶用作本发明方法第二种酶的具体酶为真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，诸如芬加密尔样(Fungamyl-like)α-淀粉酶。在本说明书中，术语″芬加密尔样α-淀粉酶″指的是表现出与WO96/23874的SEQ ID No.10中所示氨基酸序列具有高度同源性、即与WO96/23874的SEQ ID No.10中所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％以上同源性的α-淀粉酶。可以加入0.001-1.0AFAU/g DS、优选0.002-0.5AFAU/g DS、优选0.02-0.1AFAU/g DS用量的真菌α-淀粉酶。
β-淀粉酶用作本发明方法中的第二种酶的另一种具体酶为β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)。β-淀粉酶是一般对起外切作用的麦芽淀粉酶给予的名称，它催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物上的1，4-α-糖苷键的水解。
已经从各种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具40℃-65℃范围的最佳温度和4.5-7.0范围的最佳pH。关注的β-淀粉酶包括来自大麦SpezymeBBA 1500、SpezymeDBA和OptimaltTMME的β-淀粉酶、来自Genencor int的OptimaltTMBBA以及来自Novozymes A/S的NovozymTMWBA。
葡糖淀粉酶用作本发明方法中的第二种酶的另一种具体酶也可以为来源于微生物或来源于植物的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。优选来源于真菌或细菌的葡糖淀粉酶，它们选自曲霉属葡糖淀粉酶、特别是黑色曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)或其诸如公开在WO92/00381和WO00/04136中的变体、泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)、米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)或其变体或片段组成的组。
其它关注的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括提高热稳定性的变体G137A和G139A(Chen等(1996)，Prof.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；和A435和S436位上导入的Pro残基(Li等(1997)，Protein Engng.10，1199-1204。此外，Clark Ford在1997年10月17日的ENZYMEENGINEERING 14，Beijing/China 10月，12-17，97，摘要文集p.0-61中提供了为论文。该摘要中提出了为改善热稳定性而在泡盛曲霉葡糖淀粉酶中G137A、N20C/A27C和S30P位上的突变。其它关注的葡糖淀粉酶包括Talaromyces葡糖淀粉酶，特别是来源于Talaromycesemersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(US patent no.Re.32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus(US patent no.4,587,215)的葡糖淀粉酶。关注的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属、特别是C.thermoamylolyticum(EP135，138)和热硫化氢热厌氧杆菌(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。优选的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，诸如与WO00/04136的SEQ ID NO2中所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同一性的葡糖淀粉酶。另外关注的是商品AMG 200L、AMG 300L、SANTMSUPER和AMGTME(来自Novozymes)、OPTIDEXTM300(来自Genencor Int.)、AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)、G-ZYMETMG900(来自EnzymeBio-Systems)、G-ZYMETMG990 ZR(黑色曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。
可以加入0.02-2.0AGU/g DS、优选0.1-1.0AGU/g DS、诸如0.2AGU/gDS用量的葡糖淀粉酶。
其它酶还可以在有第三种酶存在的情况下实施本发明的方法。具体的第三种酶可以为芽孢杆菌属的α-淀粉酶(通常称作″透阿米尔样(Termamyl-like)α-淀粉酶″)。众所周知的透阿米尔样α-淀粉酶包括来源于地衣形芽孢杆菌(作为透阿米尔商购)、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌菌株α-淀粉酶的α-淀粉酶。其它透阿米尔样α-淀粉酶包括来源于全部具体描述在WO95/26397中的芽孢杆菌属种类NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375菌株的α-淀粉酶和由Tsukamoto等在Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31中描述的α-淀粉酶。在本发明的上下文中，透阿米尔样α-淀粉酶为WO99/19467中第3页第18行至第6页第27行上定义的α-淀粉酶。关注的变体和杂种描述在WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中。特别关注含有突变I181*+G182*+N193F的重组嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体。可以加入本领域技术人员众所周知的有效量的芽孢杆菌属α-淀粉酶。
所述方法中的另一种第三种具体酶可以为脱支酶，诸如异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)或支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精上的α-1，6-D-糖苷支化键且可以在不能与出芽短梗霉聚糖发生化学反应和在对α-极限糊精的有限作用方面不同于支链淀粉酶。可以加入本领域技术人员众所周知的有效量的脱支酶。
本发明的实施方案用于实施本发明方法的淀粉浆可以含有20-55％的干固体颗粒淀粉、优选25-40％的干固体颗粒淀粉、更优选30-35％的干固体颗粒淀粉。
在实施本发明第一个方面的方法后，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或优选99％的干固体颗粒淀粉被转化成可溶性淀粉水解产物。
本发明第一个和第二个方面的方法在低于起始胶凝温度的温度下进行。优选实施该方法的温度至少为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或优选至少60℃。
实施本发明第一个方面的pH可以在3.0-7.0、优选3.5-6.0或更优选4.0-5.0的范围。
本发明第一个方面的方法中的产物可溶性淀粉水解产物的确切组成取决于所用酶的组合和所加工的颗粒淀粉的类型。优选可溶性水解产物为具有至少85％、90％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5、99.0％或99.5％纯度的麦芽糖。甚至更优选可溶性淀粉水解产物为葡萄糖且最优选淀粉水解产物具有至少94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5、99.0％或99.5％的DX(溶解的干固体中葡萄糖的百分比)。不过，同样关注的是本发明方法中的产物可溶性淀粉水解产物为特制糖浆(specialty syrup)的方法，所述的特制糖浆诸如含有葡萄糖、麦芽糖、DP3和DPn的混合物的用于冰淇淋、蛋糕、糖果、水果罐头的特制糖浆。
本发明方法中加工的颗粒淀粉特别可以获自块茎、根、茎、豆类、谷类或全谷物。更具体地说，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米穗轴(cobs)、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁(milo)、西米(sago)、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、高梁、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。特别关注蜡类和非蜡类玉米和大麦。所加工的颗粒淀粉可以具有为高度精制的淀粉质量、优选纯度高于90％、95％、97％或99.5％或其可以为含有包括磨碎的全谷物的物质的更粗的淀粉，所述的磨碎的全谷物包括非淀粉部分，诸如胚芽残余部分和纤维。磨碎诸如全谷物这样的粗物质是为了使结构开放并进行进一步加工。本发明优选两种研磨法湿磨和干磨。在干磨法中，磨碎完整的谷粒并使用。湿磨法可以使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)得到良好分离且该方法可以用于除少数情况外的任意生产糖浆中使用淀粉水解产物的情况。干磨和湿磨是淀粉加工领域中众所周知的且同样关注本发明的方法。本发明的第一个方面的方法可以在超滤系统中进行，其中回流液保持在有酶。生淀粉(raw starch)和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。同样关注在带有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。还关注在带有微滤膜的连续膜反应器中进行的方法且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
在本发明第二个方面的方法中，将本发明第一个方面方法中的可溶性淀粉水解产物转化成基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，诸如高果糖玉米浆(HFCS)。优选使用葡萄糖异构酶且更优选通过固相支持体上支持的固定化葡萄糖异构酶进行这种转化。关注的异构酶包括来自Novozymes A/S的商品SweetzymeTMIT、来自Rhodia的G-zymeTMIMGI和G-zymeTMG993、KetomaxTM和G-zymeTMG993、来自Genemcor Int的G-zymeTMG993液体和GenSweetTM。
在本发明第三该方面的方法中，本发明第一个方面方法中的可溶性淀粉水解产物用于生产燃料酒精或可饮用酒精。在第三个方面的方法中，发酵可以与颗粒淀粉浆的水解同时或分别/依次进行。当发酵与水解同时进行时，温度优选在30℃-35℃且更优选在31℃-34℃。本发明第三个方面的方法可以在超滤系统中进行，其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。同样关注在带有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法且其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。
材料和方法α-淀粉酶活性(KNU)使用马铃薯淀粉作为底物测定淀粉分解活性。该方法基于酶对改性的马铃薯淀粉的分解且在该反应后浆淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。开始形成蓝黑色，但在淀粉分解的过程中，蓝色变浅且逐步变成浅红棕色，将其与有色玻璃标准品比较。
将一个Kilo Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)使5.26g可溶性淀粉干物质糊精化的酶用量。
更具体地描述这种分析方法的文件AF 9/6获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
CGTase活性(KNU)通过使用Phadebas片作为底物测定CGTase α-淀粉酶活性。Phadebas片(Phadebas淀粉酶试验，由Pharmacia Diagnostic提供)含有已经与牛血清清蛋白和缓冲物质混合的交联不溶性蓝色淀粉聚合物。
对每次单一测定而言，将一片悬浮于含有5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM乙酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mMCaCl2，用NaOH将pH调节至有意义的值)的管中。该试验在所关注温度下的水浴中进行。用xml的50mM Britton-Robinson缓冲液稀释所测试的α-淀粉酶。将1ml这种α-淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中。用α-淀粉酶水解淀粉，得到可溶性蓝色部分。在620nm处通过分光光度法测定的所得蓝色溶液的吸收度为α-淀粉酶活性的函数。
重要的是在保温10或15分钟(测试时间)后测定的620nm处吸收度在620nm处为0.2-2.0吸收度范围。在该吸收度范围内，活性与吸收度之间呈线性关系(Lambert-Beer定律)。由此必须调节酶稀释液以适合这种标准。在一组具体条件(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，1mg指定的α-淀粉酶会水解一定量的底物且产生蓝色。在620nm处测定颜色强度。测定的吸收度与所述α-淀粉酶的特异性活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)在指定的一组条件下成正比。
更具体地描述这种分析方法的文件EAL-SM-0351获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
生麦芽糖α-淀粉酶活性(MANU)将一个麦芽淀粉酶Novo单位(MANU)定义为在标准条件下每分钟裂解1微摩尔麦芽三糖的酶量。标准条件为10mg/ml麦芽三糖、37℃、pH 5.0和30分钟反应时间。在形成NADH的条件下用葡萄糖脱氢酶(GlucDH，Merck)将形成的葡萄糖将转化成葡糖酸内酯，在340nm处通过分光光度法测定。更具体地描述这种分析方法的文件(EAL-SM-0203.01)获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
葡糖淀粉酶活性(AGU)将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃和pH 4.3下每分钟裂解1微摩尔麦芽糖的酶量。
用使用来自Boehringer Mannheim，124036的葡萄糖GOD-Perid试剂盒的(AEL-SM-0131，根据需要从Novozymes得到)后修改的方法将活性测定为AGU/ml。标准品AMG-标准品，批号7-1195，195 AGU/ml。在37℃下将375microL底物(在50mM乙酸钠中的1％麦芽糖，pH 4.3)保温5分钟。加入用乙酸钠稀释的25microL酶。10分钟后通过添加100microL 0.25MNaOH使反应终止。将20microL转入96孔微量滴定板并加入200microLGOD-Perid溶液(124036，Boehringer Mannheim)。在室温下30分钟后，在650nm处测定吸收度并根据AMG-标准品计算按AGU/ml计的活性。更具体地描述这种分析方法的文件(AEL-SM-0131)根据需要获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
真菌α-淀粉酶活性(FAU)以FAU(真菌α-淀粉酶活性单位)测定α-淀粉酶活性。一个单位(1)FAU为在标准条件(即在37℃和pH 4.7下)下每小时分解5260mg固体淀粉(Amylum solubile，Merck)的酶量。更具体地描述这种分析方法的文件AF9.1/3根据需要获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶活性单位)测定酸性α-淀粉酶活性，将它们对比酶标准品测定。
所用的标准品为AMG 300L(来自Novozymes A/S，葡糖淀粉酶野生型黑色曲霉G1，还公开在Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102WO92/00381中)。在这种AMG中的中性α-淀粉酶在室温下储存3周后从约1FAU/mL下降至0.05FAU/mL以下。
按照下列描述测定这种AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性。在这种方法中，将1个AFAU定义为在标准条件下每小时使5.26mg淀粉干固体降解的酶量。
碘与淀粉、而不与其降解产物形成蓝色复合物。颜色强度由此与淀粉浓度成正比。使用反相比色法将淀粉酶活性测定为在具体分析条件下淀粉浓度的下降。
蓝色/紫色t＝23秒 脱色标准条件/反应条件(每分钟)底物 淀粉，约0.17g/L缓冲液 柠檬酸盐，约0.03M碘(I)0.03g/LCaCl2 1.85mMpH 2.50-0.05保温时间 40℃反应时间 23秒波长 λ＝590nm酶浓度 0.025AFAU/mL酶工作范围 0.01-0.04AFAU/mL如果优选其它具体内容，则可以根据需要在从获自Novozymes A/S的EB-SM-0259.02/01中找到它们并将它们引入作为参考。
β-淀粉酶活性(DP°)用糖化力(DP)程度表示SPEZYMEBBA 1500的活性。它是当在20℃下将样品与100ml底物一起保温1小时时产生足以还原5ml费林氏溶液的还原糖类的0.1ml 5％酶制品样品溶液中含有的酶量。
支链淀粉酶活性(新支链淀粉酶单位Novo(NPUN)相对出芽短梗霉聚糖底物测定支链淀粉酶活性。出芽短梗霉聚糖是主要由通过1，6-α-键连接的麦芽三糖基单位组成的直链D-葡萄糖聚合物。内切-支链淀粉酶随机水解1，6-α-键，释放麦芽三糖、63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖、63-α-(63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖基)-麦芽三糖。
一个新支链淀粉酶单位Novo(NPUN)为内切-支链淀粉酶活性单位且对比Novozymes A/S Promozyme D标准品测定。标准条件为在40℃和pH 4.5下的30分钟反应时间和将0.7％出芽短梗霉聚糖用作底物。在510nm出通过分光光度法测定红色底物降解产物的量且该量与样品中的内切-支链淀粉酶活性成正比。更具体地描述这种分析方法的文件(EB-SM.0420.02/01)根据需要获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
在标准条件下，一个NPUN约等于释放具有等于2.86微摩尔葡萄糖/分钟还原力的还原糖的酶量。
CGTase水解活性的测定通过如Wind等1995在Appl，Environ.Microbiol.611257-1265中所述测定与Paselli SA2淀粉(来自Avebe，The Netherlands)一起保温过程中还原力的增加来确定CGTase的水解活性。
糖分布和溶解的干固体的测定通过HPLC测定淀粉水解产物中的糖组成且随后将葡萄糖产率计算为DX。通过测定折射率来确定淀粉水解产物中溶解的(可溶性)干固体°BRIX。
材料使用下列酶活性。生麦芽糖α-淀粉酶含有WO9/943794的SEQ ID No1中所示的氨基酸序列。葡糖淀粉酶来源于含有WO00/04136的SEQ ID No2中所示氨基酸序列或公开的变体之一的米曲霉。酸性真菌α-淀粉酶来源于黑色曲霉。芽孢杆菌属α-淀粉酶为含有突变I181*+G182*+N193F的重组嗜热脂肪芽孢杆菌变体。真菌α-淀粉酶来源于米曲霉。CGTase O含有如本文SEQ ID NO 2所示的序列。CGTase T含有Joergensen等(1997)在Biotechnol.Lett.191027-1031中的图1中所公开和本文SEQ ID NO 3中所示的氨基酸序列。CGTase A含有如本文SEQ ID NO 4中所示的序列。
普通玉米淀粉(C x PHARM 03406)获自Cerestar。
实施例1本实施例解释了使用CGTase T和葡糖淀粉酶以及酸性真菌淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖。通过在搅拌条件下将247.5g常用的玉米淀粉加入到502.5ml水中制备具有33％干固体(DS)颗粒淀粉浆。用HCl将pH调节至4.5。使颗粒淀粉浆分布于100ml蓝盖烧瓶中，每只烧瓶含有75g。在磁性搅拌的同时将烧瓶在60℃的水浴中保温。在0小时时对烧瓶给予表1中给出的酶活性。在24、48、72和96小时后抽取样品。
表1.所用的酶活性水平为CGTase T 葡糖淀粉酶酸性真菌α-淀粉酶KNU/kg DS AGU/kg DSAFAU/kg DS12.5 2005025.0 20050100.0 20050使用下列方法测定总固体淀粉。通过加入过量的α-淀粉酶(300KNU/Kg干固体)且随后将样品置于95℃下的油浴中45分钟使淀粉完全水解。在通过0.22microM滤膜过滤后，通过测定折射率来确定干固体。
在通过0.22microM滤膜过滤后对样品测定淀粉水解产物中的可溶性干固体。通过测定折射率确定可溶性干固体且通过HPLC测定糖分布。将葡萄糖的量计算为DX。结果如表2和3中所示。
表2.在三种CGTase活性水平下可溶性干固体占总干物质的百分比。
KNU/kgDS 24小时 48小时 72小时 96小时12.568 82 89 9425.076 89 93 97100.0 83 96 98 99
表3.在三种CGTase活性水平下可溶性水解产物的DX。
KNU/kgDS 24小时 48小时 72小时 96小时12.5 92.694.595.195.325.0 92.494.895.495.5100.092.794.995.495.4实施例2本实施例解释了使用CGTase T、葡糖淀粉酶、酸性真菌α-淀粉酶和芽孢杆菌α-淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述制备保温。在0小时时对烧瓶给予表4中给出的酶活性。
表4.所用的酶活性水平为CGTase T 葡糖淀粉酶 酸性真菌α-淀 芽孢杆菌α-淀KNU/kg DS AGU/kg DS粉酶 粉酶AFAU/kg DSKNU/kg DS5.0 20050 300在24、48、72和96小时后抽取样品并如实施例1中所述分析。结果如表4和5中所示。
表5.可溶性干固体占总干物质的百分比。
24小时 48小时72小时96小时82.8 93.0 96.3 98.7表6.可溶性水解产物的DX。
24小时 48小时72小时96小时92.8 94.9 95.5 95.8
实施例3本实施例解释了使用生麦芽糖α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和酸性真菌α-淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时对烧瓶给予表6中给出的酶活性。
表6.所用的酶活性水平为生麦芽糖α-淀葡糖淀粉酶酸性真菌α-淀粉酶MANU/kg AGU/kg DS 粉酶DS AFAU/kg DS烧瓶15000 200 50烧瓶220000200 50在24、48、72和96小时后抽取样品并如实施例1中所述分析。结果如表7和8中所示。
表7.在两种生麦芽糖α-淀粉酶的活性水平下可溶性干固体占总干物质的百分比。
MANU/kgD24小时 48小时72小时 96小时S500063.1 7579.3 85.320000 67.0 77.9 82.7 88.1表8.在两种生麦芽糖α-淀粉酶的活性水平下可溶性水解产物的DX。
MANU/kgD24小时 48小时72小时 96小时S5000 95.2 95.4 95.3 95.52000093.8 94.9 94.9 94.8实施例4本实施例解释了使用葡糖淀粉酶和酸性真菌α-淀粉酶仅将部分颗粒淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时对烧瓶给予表9中给出的酶活性。在24、48、72和96小时后抽取样品。如实施例1中所述分析样品。结果如表10和11中所示。
表9.所用的酶活性水平为葡糖淀粉酶 酸性真菌α-淀粉酶AGU/kg DS AFAU/kg DS200 50表10.可溶性干固体占总干物质的百分比。
24小时 48小时72小时 96小时28.5 36.3 41.6 45.7表11.可溶性水解产物的DX。
24小时 48小时72小时 96小时27.7 34.9 39.2 42.2实施例5本实施例解释了作为可溶性干固体和DX出现所测定的在使用CGTase和葡糖淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖浆的过程中4种不同的CGTases(CGTase A、CGTase N、CGTase O和CGTase T)与产率之间的相关性。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时全部给予100KNU/kg DS的CGTases与200AGU/kg DS的葡糖淀粉酶。在48小时时抽取样品并如实施例1中所述进行分析。将结果列在表12中。
表12.水解活性(微摩尔/分钟/mg蛋白质)以及48小时后的可溶性干固体(DS)和DXCGTase水解活性可溶性DS DXCGTase N0.2737.435.1CGTase A0.3849.946.7CGTase O1.6260.957.1CGTase T4.5997.991.2
实施例6本实施例解释了在超滤系统中进行的所述方法，其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。在带有管状膜组件(PU 120型)的分批超滤系统(PCI型)中处理包括悬浮于233L城市自来水的100kg颗粒玉米淀粉和CGTase T(12.5KNU/kg淀粉)、芽孢杆菌α-淀粉酶(300KNU/kg淀粉)和葡糖淀粉酶(200AGU/kg淀粉)的浆。以100rpm搅拌该淤浆，使用170mL的30％HCl将pH调节至4.5并将反应温度设定在57℃。
分析透过物和回流液样品中的干固体含量和糖的组成。
不溶性物质的校正因子为q＝(100-S％)/(100-BRIX)。糖的离心指数为ciS％＝BRIX/S％(未校准)。糖(葡萄糖)的理论产率S产率＝ciS％*q*100/111*100％。由此对100kg淀粉进行校正，作为水解反应的结果得到约111kg葡萄糖干物质。
使用相同的酶系统在单程系统中进行试验作为膜试验。作为比较，表15a和b中显示膜系统先于达到淀粉的最大溶出。
表13.回流液和透过物中干固体含量和糖组成
表14.3、28、53和77小时时回流液中的干固体分布。
3小时 28小时 53小时 77小时可溶性DS16 28 31 39总DS 38 37 42 45表15a.膜系统的葡萄糖理论产率与时间的关系
表15b.分批反应器系统中的葡萄糖的理论产率与时间的关系。
结论为当在膜系统中糖化过程中维持底物饱和时，溶解度与用于对生淀粉进行冷糖化的简单分批反应系统相比得到改善。
实施例7本实施例解释了在使用陶瓷组件的连续工作微滤膜反应器中同时进行的本发明冷液化和糖化过程。
使200L进料混合器罐通过反应器进料泵与带有温控的200L反应器罐连接。使用具有0-20I/小时容量的泵使来自反应器的混合物通过用于分离葡萄糖的APV陶瓷微量过滤组件再循环。孔大小为0.2微米且膜的面积为0.2m2。
反应器使用100KNU/kg DS CGT-ase T和300AGU/kg DS的葡糖淀粉酶的剂量工作约200小时。使用35-45小时的反应器中的平均保持时间，系统以稳态运转整个期限而产生DP1＝93％葡萄糖浆，产率接近100％。
在搅拌下给反应器罐加载悬浮于140L 58℃城市自来水中的60kgCerestar C x PHARM 03406型玉米淀粉。使用蒸汽加热的罩将温度调节至60℃。使用30％HCl使pH从6.1降至4.5。15分钟后再次检查pH(pH＝4.5)。在0小时时，加入酶CGTase T(100KNU/kg淀粉)和葡糖淀粉酶(300AGU/kg淀粉)前立即取样用于测定在台式离心机中以3000rpm离心3分钟后的淤渣体积％。此外，使用折射计测定上清液中的BRIX。反应过程后定期如上所述测定淤渣体积和上清液中的BRIX。
给进料混合器罐加载186L冷城市自来水和80kgCerestar C x PHARM03406型玉米淀粉。保持对进料混合器的缓慢搅拌并用30％HCl将pH调节至4.5。使用冷却水将温度保持在7-8℃并加入酶CGTase T(100KNU/kg淀粉)和葡糖淀粉酶(300AGU/kg淀粉)。确保低温以便不发生反应。
连续突然开启(upstart)反应器至30小时后的°Brix-值稳定在27左右。然后使用0.15Bar的压降和确保这一压力的最大回流液流动启动微量过滤。使滤液再循环至反应器罐第一个5.7小时。此后在分离罐中收集滤液并将体积测定为时间的函数。在这一时间点处启动反应器进料泵并调节至流速等同于滤液流量(L/分钟)。通过实施该步骤使反应器罐内的体积保持恒定。
连续使淀粉浆进料，同时如上所述取样。此外，取滤液样品。通过增加回流液流量补偿任何滤液流量的下降，由此破碎膜上的滤饼。从而使压降也增加。将样品看作HPLC和BRIX滤液的时间的函数并测定收集的体积。同时从反应器中取样用于测定总DS、淤渣、°Brix并对糖组成进行HPLC。
本试验持续220小时。在该时间点时，压降增加至约0.4Bar。
作为加工时间函数测定的滤液流量(基于单次测定)和平均滤液流量值(积分的)显示由CGTase和葡糖淀粉酶组成的酶系统在长加工时间内得到单独维持和确保稳定流量。这一结果强调了这种稳定系统的潜在工业化优势。
将结果和物料衡算列在表16-18中。
表16.对收集的滤液的分析。
日期和 从开始 收集的 ％DS 密度， DS的质量 平均流量时间 的小时数滤液，L w/w kg/Lkg mL/分钟13/03/0 30*-- - - -2 16:0514/03/0 55 142 25.8 1.12 41.1 95.62 16:5016/03/0 102 187 25.6 1.12 53.7 66.12 16:0018/03/0 147 200 28.7 1.14 65.2 74.02 13:0219/03/0 174 100 29.6 1.14 33.8 60.12 16:45总体收 629.027.3 1.13 193.7 -集*开始连续给反应器进料表17.产生的糖浆的组成％DP1 ％DP2 ％DP3 ％ DP493 5 1 2表18.实施例7试验的物料衡算
*连续生产时的基本底物消耗。
与搅拌的简单罐中进行的分批试验相比，使用上述水解颗粒淀粉的设定值使反应时间得到显著减少。如果使用30％DS没有遇到粘度问题，那么认为使DS增加至40％，乃至45％高且仍然维持稳定操作是切实可行的。
实施例8本实施例比较了用于从干磨碎的玉米形式的生淀粉Yellow Dent No.2生产燃料酒精或可饮用酒精的本发明方法和常规方法。
在250ml蓝盖烧瓶中用自来水制备干磨玉米的30％DS淤浆并用本发明方法使粗玉米淀粉同时接触冷液化和糖化。将该淤浆在磁性搅拌的水浴中加热至60℃，使用30％HCl将pH调节至4.5并加入CGTase T(75KNU/kgDS)和葡糖淀粉酶(500AGU/kg DS)。48小时后，将烧瓶在水浴中冷却至32℃。
使干磨玉米的30％DS淤浆在由预液化容器、喷射式蒸煮器、闪蒸器(flash)和液化后容器组成的常规连续工艺中预液化。在70-90℃下的预液化过程中加入芽孢杆菌α-淀粉酶(10KNU/kg DS)且在约85-90℃的液化后过程中再加入芽孢杆菌α-淀粉酶(20KNU/kg DS)。在115-120℃下进行喷射式蒸煮。在磁性搅拌下通过在水浴中的蓝盖烧瓶中将醪液加热至60℃进行预糖化。在使用30％HCl将pH调节至4.5后，加入剂量等于500AGU/kg DS的葡糖淀粉酶。48小时后，将烧瓶在水浴中冷却至32℃。
在安装了酵母锁的充入大豆油的蓝盖烧瓶中直接进行发酵。加入等于1千万/mL活酵母细胞的用量的Bakers酵母(啤酒糖酵母)并将0.25％脲形式的酵母营养物加入到每一烧瓶中。每次处理均按一式三份进行。
通过如在定期间隔称重烧瓶所测定的CO2消耗监测发酵。然后使用下列公式计算L EtOH/100kg谷物干物质(DS) 醪液含有30％w/w谷物干物质。0.79g/mL为酒精密度。
表19和20中显示了一式两份的发酵结果，包括对两种类型预处理的粗物质的统计学计算(通过内推法估计的缺失结果)。
表19.使用CGTase T(75KNU/kg DS)和葡糖淀粉酶(500AGU/kg DS)的本发明方法的发酵结果。
小时 L EtOH/100kg谷物STDEV0 - -25.5 28.3 0.94835.4 0.66937.1 0.279*37.5 -9738.3 0.2*估计值表20.使用芽孢杆菌α-淀粉酶(10+20KNU/kg DS)和葡糖淀粉酶(500AGU/kg DS)的常规方法的发酵结果小时 L EtOH/100kg谷物STDEV0 - -25.5 22.5 1.3
48 33.9 0.769*37.2-79 38.8 0.497 40.5 0.5*估计值使用约48-70小时的间隔的模拟工业化发酵时间从本发明方法生产的醪液获得的酒精产率等于或高于可以从通过消耗更多能量的两步热淤浆预液化和喷射式蒸煮法生产的醪液获得的产率。
实施例9本实施例解释了在60℃下使用CGTase、葡糖淀粉酶和酸性真菌α-淀粉酶将颗粒小麦和普通玉米淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS普通玉米或小麦颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时对烧瓶给予表20中给出的酶活性。在24、48、72和96小时后抽取样品并如实施例1中所述分析样品。结果如表21和22中所示。
表20.所用的酶活性水平CGTase 葡糖淀粉酶酸性真菌α-淀粉酶NU/g DS AGU/g DS AFAU/g DS100.00.20.05表2 1.使用两种不同淀粉类型的可溶性干固体占总干物质的百分比。
淀粉 24小时 48小时 72小时96小时普通玉米 85.9 96.299.4 100.0小麦 95.7 98.999.6 100.0表22.使用两种不同淀粉类型的可溶性水解产物的DX。
淀粉 24小时 48小时 72小时96小时普通玉米 76.2 89.293.4 94.7小麦 86.2 92.493.6 94.4
序列表<110>诺维信公司(Novozymes)<120>冷液化方法<130>10270-WO<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>706<212>PRT<213>芽孢杆菌属<220>
<221>mat_peptide<222>(29)..()<400>1Val Phe Leu Lys Asn Leu Thr Val Leu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Ala-25 -20 -15Leu Leu Leu Phe Ile Leu Leu Ser Leu Pro Thr Ala Ala Gln Ala Asp-10 -5 -1 1Val Thr Asn Lys Val Asn Tyr Thr Arg Asp Val Ile Tyr Gln Ile Val5 10 15 20Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asp Pro Ser Asn Asn Pro Thr Gly Ala25 30 35Ile Tyr Ser Gln Asp Cys Ser Asp Leu His Lys Tyr Cys Gly Gly Asp40 45 50Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp Leu55 60 65Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Tyr Ala70 75 80Leu His Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp85 90 95 100Tyr Lys Arg Thr Asn Pro Phe Tyr Gly Asp Phe Ser Asp Phe Asp Arg105 110 115Leu Met Asp Thr Ala His Ser Asn Gly Ile Lys Val Ile Met Asp Phe120 125 130Thr Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu Thr Asp Pro Ser Tyr Ala135 140 145Glu Asn Gly Ala Val Tyr Asn Asp Gly Val Leu Ile Gly Asn Tyr Ser150 155 160Asn Asp Pro Asn Asn Leu Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser165 170 175 180
Ser Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Tyr185 190 195Asp Leu Asn Asn Thr Val Met Asp Gln Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Lys200 205 210Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys215 220 225His Met Ser Glu Gly Trp Gln Thr Ser Leu Met Ser Asp Ile Tyr Ala230 235 240His Glu Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Ser Gly Glu245 250 255 260Val Asp Pro Gln Asn His His Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu265 270 275Leu Asp Phe Gln Phe Gly Gln Thr Ile Arg Asp Val Leu Met Asp Gly280 285 290Ser Ser Asn Trp Tyr Asp Phe Asn Glu Met Ile Ala Ser Thr Glu Glu295 300 305Asp Tyr Asp Glu Val Ile Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp310 315 320Met Ser Arg Phe Ser Phe Glu Gln Ser Ser Asn Arg His Thr Asp Ile325 330 335 340Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Thr Ile Tyr Tyr345 350 355Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly Gly Asn Asp Pro Glu Asn Arg Lys360 365 370Pro Met Ser Asp Phe Asp Arg Thr Thr Asn Ser Tyr Gln Ile Ile Ser375 380 385Thr Leu Ala Ser Leu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Asn390 395 400Thr Ser Glu Arg Trp Ile Asn Ser Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Ala405 410 415 420Phe Gly Asp Ser Val Val Leu Thr Ala Val Asn Ser Gly Asp Thr Ser425 430 435Tyr Thr Ile Asn Asn Leu Asn Thr Ser Leu Pro Gln Gly Gln Tyr Thr440 445 450Asp Glu Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gly Asn Glu Ile Thr Val Asn Ser455 460 465Asn Gly Ala Val Asp Ser Phe Gln Leu Ser Ala Asn Gly Val Ser Val470 475 480Trp Gln Ile Thr Glu Glu His Ala Ser Pro Leu Ile Gly His Val Gly485 490 495 500Pro Met Met Gly Lys His Gly Asn Thr Val Thr Ile Thr Gly Glu Gly505 510 515
Phe Gly Asp Asn Glu Gly Ser Val Leu Phe Asp Ser Asp Phe Ser Asp520 525 530Val Leu Ser Trp Ser Asp Thr Lys Ile Glu Val Ser Val Pro Asp Val535 540 545Thr Ala Gly His Tyr Asp Ile Ser Val Val Asn Ala Gly Asp Ser Gln550 555 560Ser Pro Thr Tyr Asp Lys Phe Glu Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Ser565 570 575 580Ile Arg Phe Ala Val Asn Asn Ala Thr Thr Ser Leu Gly Thr Asn Leu585 590 595Tyr Met Val Gly Asn Val Asn Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Asp Gln600 605 610Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Met Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp615 620 625Tyr Tyr Asp Ile Ser Val Pro Ala Glu Glu Asn Leu Glu Tyr Lys Phe630 635 640Ile Lys Lys Asp Ser Ser Gly Asn Val Val Trp Glu Ser Gly Asn Asn645 650 655 660His Thr Tyr Thr Thr Pro Ala Thr Gly Thr Asp Thr Val Leu Val Asp665 670 675Trp Gln<210>2<211>705<212>PRT<213>芽孢杆菌属<220>
<221>mat_peptide<222>(32)..()<400>2Met Leu Asn Lys Leu Ser Leu Lys Met Lys Ala Ile Ala Phe Phe Gly-30 -25 -20Ile Val Phe Val Val Phe Leu Ala Leu Ala Asn Asp Val Tyr Ala Ala-15 -10 -5 -1 1Asn Gln Leu Asn Lys Val Asn Tyr Ala Lys Asp Thr Ile Tyr Gln Ile5 10 15Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asp Pro Ser Asn Asn Pro Asp Gly20 25 30Ala Leu Tyr Ser Glu Thr Asp Leu His Lys Tyr Met Gly Gly Asp Trp
35 40 45Lys Gly Ile Thr Glu Lys Ile Glu Asp His Tyr Phe Thr Asp Leu Gly50 55 60 65Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Tyr Ala Val70 75 80His Pro Glu Gly Tyr Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Tyr85 90 95Lys Lys Thr Asn Pro Phe Tyr Gly Asn Phe Asn Asp Phe Asp Glu Leu100 105 110Ile Ser Thr Ala His Ser His Gly Ile Lys Ile Ile Met Asp Phe Thr115 120 125Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Lys Thr Asp Ser Asp Tyr Val Glu130 135 140 145Asn Gly Ala Ile Tyr Asp Asn Gly Ser Leu Ile Gly Asn Tyr Ser Asn150 155 160Asp Leu Asp Ile Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Ser Tyr165 170 175Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Tyr Asp Leu180 185 190Gln Asn Gln Thr Ile Asp Gln Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Glu Leu Trp195 200 205Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met210 215 220 225Ser Gln Gly Trp Gln Glu Thr Leu Thr Asn His Ile Tyr Ser Tyr Gln230 235 240Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Glu Asn Glu Ile Asp245 250 255Pro Arg Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp260 265 270Phe Gln Phe Gly Gln Gln Ile Arg Gly Val Leu Met Ser Gln Glu Asp275 280 285
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<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..()<400>3Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Val Val Asn Tyr Ser Thr Asp Val1 5 10 15Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asn Pro Ser Asn20 25 30Asn Pro Thr Gly Asp Leu Tyr Asp Pro Thr His Thr Ser Leu Lys Lys35 40 45Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly
50 55 60Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val65 70 75 80Glu Asn Ile Tyr Ala Val Leu Pro Asp Ser Thr Phe Gly Gly Ser Thr85 90 95Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Phe100 105 110Phe Gly Ser Phe Thr Asp Phe Gln Asn Leu Ile Ala Thr Ala His Ala115 120 125His Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro130 135 140Ala Ser Glu Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp145 150 155 160Asn Gly Val Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Asn Gly Tyr Phe165 170 175His His Tyr Gly Gly Thr Asn Phe Ser Ser Tyr Glu Asp Gly Ile Tyr180 185 190Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asp Gln Gln Asn Ser Thr Ile195 200 205Asp Ser Tyr Leu Lys Ala Ala Ile Lys Leu Trp Leu Asp Met Gly Ile210 215 220Asp Gly Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Ala Phe Gly Trp Gln225 230 235 240Lys Asn Phe Met Asp Ser Ile Leu Ser Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe245 250 255Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Thr Asn Glu Val Asp Pro Asn Asn Thr Tyr260 265 270Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln275 280 285Lys Val Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Thr Met Tyr Gly Leu290 295 300
Asp Ser Met Ile Gln Ser Thr Ala Ala Asp Tyr Asn Phe Ile Asn Asp305 310 315 320Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Tyr Thr Gly325 330 335Gly Ser Thr Arg Pro Val Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser340 345 350Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly355 360 365Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asp Thr Thr370 375 380Thr Thr Ala Tyr Asn Val Ile Lys Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser385 390 395 400Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Lys Gln Arg Trp Ile Asn Asn405 410 415Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Asn Ash Val Ala Leu Val420 425 430Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Thr Ser Tyr Tyr Ile Thr Gly Leu Tyr435 440 445Thr Ala Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Met Leu Gly Gly Leu Leu450 455 460Asn Gly Ser Ser Ile Thr Val Ser Ser Asn Gly Ser Val Thr Pro Phe465 470 475 480Thr Leu Ala Pro Gly Glu Val Ala Val Trp Gln Tyr Val Ser Thr Thr485 490 495Asn Pro Pro Leu Ile Gly His Val Gly Pro Thr Met Thr Lys Ala Gly500 505 510Gln Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Thr Thr Ala Gly Gln515 520 525Val Leu Phe Gly Thr Thr Pro Ala Thr Ile Val Ser Trp Glu Asp Thr530 535 540Glu Val Lys Val Lys Val Pro Ala Leu Thr Pro Gly Lys Tyr Asn Ile545 550 555 560
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<221>mat_peptide<222>(28)..()<400>4Met Lys Arg Phe Met Lys Leu Thr Ala Val Trp Thr Leu Trp Leu Ser-25 -20 -15Leu Thr Leu Gly Leu Leu Ser Pro Val His Ala Ala Pro Asp Thr Ser-10 -5 -1 1 5Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val Ile Tyr Gln Ile Phe10 15 20Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn Asn Pro Thr Gly Ala25 30 35Ala Phe Asp Gly Ser Cys Thr Asn Leu Arg Leu Tyr Cys Gly Gly Asp
40 45 50Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Gly Met55 60 65Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ser70 75 80 85Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala Tyr His Gly Tyr Trp90 95 100Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr Gly Thr Met Gln Asp105 110 115Phe Lys Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His Asn Ile Lys Val Ile120 125 130Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Ser Asp Asp Pro135 140 145Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Asn Leu Leu Gly150 155 160 165Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His His Tyr Gly Gly Thr170 175 180Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu185 190 195Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Ser Val Asp Val Tyr Leu Lys Asp200 205 210Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp Gly Ile Arg Val Asp215 220 225Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Phe Met Ala Thr230 235 240 245Ile Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly250 255 260Val Asn Glu Ile Ser Pro Glu Tyr His Gln Phe Ala Asn Glu Ser Gly265 270 275Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys Ala Arg Gln Val Phe280 285 290
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Gln Val Lys Ile Pro Ala Val Pro Gly Gly Ile Tyr Asp Ile Arg Val550 555 560 565Ala Asn Ala Ala Gly Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Asp Asn Phe Glu Val570 575 580Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Val Ile Asn Asn Ala Thr585 590 595Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Phe Leu Thr Gly Asn Val Ser Glu Leu600 605 610Gly Asn Trp Asp Pro Asn Asn Ala Ile Gly Pro Met Tyr Asn Gln Val615 620 625Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser Val Pro Ala Gly630 635 640 645Gln Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr650 655 660Trp Glu Gly Gly Ala Asn Arg Thr Phe Thr Thr Pro Thr Ser Gly Thr665 670 675Ala Thr Val Asn Val Asn Trp Gln Pro680 68权利要求
1.用于生产可溶性淀粉水解产物的一步法，该方法包括使含水的颗粒淀粉浆在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行下列酶的同时作用的步骤第一种酶(a)第13族苷水解酶的成员；(b)具有α-1.4-糖苷水解活性；和(c)包括第20族糖类结合成分；和至少一种属于真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、B-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)或葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)的第二种酶。
2.上述权利要求中所述的方法，其中淀粉浆含有20-55％的干固体颗粒淀粉、优选25-40％的干固体颗粒淀粉、更优选30-35％的干固体颗粒淀粉、尤其是约33％的干固体颗粒淀粉。
3.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中将至少85％、86％、87％、88％、89％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的颗粒淀粉干固体转化成可溶性淀粉水解产物。
4.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶来源于微生物且优选来源于细菌。
5.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为CGTase(EC 2.4.1.19)。
6.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为具有至少3.5、优选至少4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或最优选至少23微摩尔/分钟/mg的水解活性的CGTase。
7.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为与Joergensen等在(1997)，Biotechnol.Lett.191027-1031的图1中所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的CGTase。
8.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为生麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。
9.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中生麦芽糖α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属、优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。
10.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为与WO9943794的SEQ ID NO1中所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的生麦芽糖α-淀粉酶。
11.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为含有WO9943794的SEQ ID NO1中所示氨基酸序列或所述专利中公开的该氨基酸序列的变体的生麦芽糖α-淀粉酶。
12.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为具有至少3.5、优选至少4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、100、200、300、400、500、600或最优选至少700微摩尔/分钟/mg的水解活性的生麦芽糖α-淀粉酶。
13.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第二种酶为与WO9623874的SEQ ID NO10中所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的真菌α-淀粉酶。
14.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第二种酶为大麦β-淀粉酶(E.C.2.4.1.2)，诸如来自Genencor int的SpezymeBBA1500或SpezymeDBA。
15.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第二种酶为葡糖淀粉酶。
16.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的第二种酶为来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，诸如与WO00/04136的SEQ ID NO2中所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的葡糖淀粉酶。
17.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中存在第三种酶，所述的第三种酶为来源于芽孢杆菌属种类的α-淀粉酶，诸如WO99/19467、WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中公开的酶、变体和杂种。
18.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中存在第三种酶，所述的第三种酶为异淀粉酶或支链淀粉酶。
19.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的温度至少在58℃、59℃或更优选至少为60℃。
20.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的pH在3.0-7.0、优选3.5-6.0或更优选4.0-5.0的范围。
21.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的可溶性淀粉水解产物具有至少94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或至少99.5％的DX。
22.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中可溶性淀粉水解产物中主要的糖为葡萄糖或麦芽糖。
23.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉获自块茎、根、茎或全谷物。
24.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉获自谷类。
25.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉获自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯淀粉、高梁、稻或马铃薯。
26.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉通过干磨全谷物或湿磨全谷物得到。
27.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中该方法在超滤系统中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
28.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中该方法在带有超滤膜的连续膜反应器中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
29.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中该方法在带有微滤膜的连续膜反应器中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
30.基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)的生产方法，其中将上述权利要求中任意一项所述方法中的可溶性淀粉水解产物转化成基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，诸如高果糖玉米糖浆(HFCS)。
31.燃料酒精或可饮用酒精的生产方法，其中将权利要求1-29中任意一项所述方法中的可溶性淀粉水解产物发酵成酒精。
32.权利要求31所述的方法，其中所述的发酵步骤与颗粒淀粉的水解步骤同时或分别/依次进行。
33.权利要求31-32中任意一项所述的方法，其中该方法在超滤系统中进行，其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。
34.权利要求31-33中任意一项所述的方法，其中该方法在带有超滤膜的连续膜反应器中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。
全文摘要
本发明涉及在将颗粒淀粉酶促水解成可溶性淀粉水解产物的方法，该方法在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行。
文档编号C12P19/00GK1633503SQ03803986
公开日2005年6月29日 申请日期2003年2月10日 优先权日2002年2月14日
发明者巴里·E·诺曼, 安德斯·维克索-尼尔森, 汉斯·S·奥尔森, 斯文·佩德森 申请人:诺维信公司