专利名称：改进食品发酵程序的方法
技术领域：
本发明涉及与乳酸细菌有关的食品发酵程序领域，并且特别涉及改进乳产品特性如酸度、发酵后的酸化、芳香、香味、温和性、稠度以及质地。特别地，本发明提供一种使用耐热的耐热链球菌和嗜温的乳酸乳球菌生产乳产品的方法，该菌表达小热激蛋白质使得发酵可以在高于正常发酵温度的温度下进行。表达所述热激蛋白质的该耐热及嗜温的乳酸细菌也表现出对较低pH和较高盐浓度的耐受性以及在升高的发酵温度下对噬菌体攻击的减弱的易感性。
序言在食品工业中，同型发酵的耐热乳酸细菌耐热链球菌在乳产品发酵中通常与耐热乳杆菌一起用作起始种。在商业上，最重要的这种发酵是酸乳生产。酸乳得自两种乳酸细菌耐热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的原共生生长。原共生表现了生物间的代谢相互关系，这意味着两种乳酸细菌都通过提供优化生长所需的营养物来促进相互的生长。作为结果，酸化是快速的并且导致了低至3.5的最终pH值。
尽管一般认为德氏乳杆菌保加利亚亚种是导致香味形成的最主要的酸乳起始成分，然而从用耐热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的不同组合的发酵实验获得的结果显示了耐热链球菌对香味形成有重要的影响(C.Mller，W.Bockelmann，和K.J.Heller，未发表)。
喜爱具有较温和芳香的酸乳的消费者数量近年来一直在增多。如果发酵在4.0到4.7的pH值时已停止，就可以得到这种温和的口味。此外，发酵后的酸化是导致酸乳中苦味和/或酸味的一个主要原因。为了克服酸乳的这种不合需要的特性，通过使用显示无或仅有少许发酵后的酸化作用的起始成分能够阻止苦味和/或酸味的形成。
除了酸乳之外，耐热的起始培养物也用于不同类型的硬干酪和半硬干酪如莫泽雷勒干酪以及酸凝乳酪的生产。特别是对于后一种干酪，发酵后得到的最终pH值对于产品的质量具有显著的影响。
嗜温的乳酸细菌乳球菌被用作许多干酪品种和黄油乳的起始成分。虽然对于干酪生产的酸化作用通常是通过切除凝乳以及除去伴随的可发酵乳糖而得以终止，但黄油乳发酵在pH4.6时终止，而这非常接近于该生物的最低pH。
在温暖的国家，例如像埃及，由于制冷系统不能令人满意，鲜乳的保存期非常短。为了克服快速变质的问题，将较多量的NaCl加入乳中。而这在另一方面妨碍了随后的乳品发酵。因此，在这样的国家对于耐盐的起始培养物有着强烈的需求。
乳品发酵通过有不同温度需求的起始生物得以进行。包括有不同温度需求的起始生物的发酵在某一温度时引起这些生物中之一的亚优化生长。例如，在酸乳的生产中，德氏乳杆菌保加利亚亚种在终产品中的细胞数量由于在亚优化温度下的发酵而非常低。
因而迫切需要发展可以在比其通常的发酵温度和盐浓度更高的温度和盐浓度下发酵乳的乳酸细菌以及在较低pH值下更持久地保持存活的物种。另一方面，在较高的温度下发酵将抑制污染物的增多。由此可以降低盐浓度以利于人类健康。
在随附的权利要求书以及在下面的描述及附图中对本发明的各个方面进行介绍。这些方面展示在各个部分的标题下。然而，应理解各部分下的教导并不必要限于该特定部分的标题。
发明概述令人感兴趣地，本专利申请的发明人显示表达小热激蛋白质的某些乳酸细菌菌种能够在比正常乳发酵温度和/或盐浓度更高的温度和/或盐浓度下发酵乳。本专利申请的发明人进一步显示了表达热激蛋白质的乳酸细菌在较低的pH下更持久地保持存活并由于高的发酵温度而变得对噬菌体侵染更不敏感。
重要地，发明人发现本发明的乳酸细菌当与乳一起温育时能够生产出一种与通过相应的不表达热激蛋白质的乳酸细菌生产的发酵产品相比具有较温和口味特性的发酵产品。
据此，本发明的第一个方面涉及一种基于温和发酵的生产乳产品的方法，所述方法包括下列步骤将乳与一种能够表达小热激蛋白质的乳酸细菌混合，并在比通常的发酵温度更高的温度和/或比通常的发酵盐浓度更高的盐浓度下培养乳/细菌混合物，其中发酵产品与通过相应的不表达热激蛋白质的乳酸细菌生产的发酵产品相比具有较温和口味的特性。
在另一方面中，提供了用于乳发酵程序的耐热的和/或嗜温的乳酸细菌，其带有编码小热激蛋白质的基因并且其生产一种与通过相应的不表达热激蛋白质的耐热的和/或嗜温的乳酸细菌生产的发酵产品相比具有较温和口味特性的发酵产品。
优选地，产品的pH值高于4.0。
在另一方面中，本发明提供了一种方法，包括将乳与第一和第二乳酸细菌混合，其中至少第一和第二乳酸细菌中的一种各自都能够表达小热激蛋白质，以及按照具体要求培养乳/细菌混合物。
在另一方面中，本发明也提供了一种方法，其中第一乳酸细菌和第二乳酸细菌中的每一个包含一种嗜温细菌。
在另一方面，本发明也提供了一种方法，其中第一乳酸细菌和第二乳酸细菌中的每一个包含一种耐热细菌。
在另一方面，本发明也提供了一种方法，其中在加入第二耐热乳酸细菌之前，将乳与含有第一耐热乳酸细菌的起始培养物混合。
在另一方面，本发明也提供了一种方法，其中第一乳酸细菌包含一种嗜温乳酸细菌而第二乳酸细菌包含一种耐热细菌。
在另一方面，本发明也提供了一种方法，其中在加入耐热乳酸细菌之前，将乳与含有嗜温乳酸细菌的起始培养物混合。
在另一方面，本发明也提供了一种方法，其中每个嗜温细菌独立地选自但不限于乳球菌属(Lactococcus spp)、明串珠菌属(Leuconostoc spp)、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种，以及乳酸乳球菌乳亚种。
在另一方面，本发明也提供了一种方法，其中每个耐热细菌独立地选自但不限于含有带有编码小热激蛋白质的基因的质粒的链球菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp)、片球菌属、乳杆菌属(Lactobacillus spp)、耐热链球菌、德氏乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种。
在另外一方面，提供了具有增强的耐酸性的嗜温的和耐热的乳酸细菌。
在进一步的方面，提供了具有由升高的发酵温度引起的对噬菌体的敏感性减小的嗜温的和耐热的乳酸细菌。
在进一步的方面，本发明涉及由本发明的方法获得的乳以及由发酵这样的乳获得的当与通过相应的不表达本发明的小热激蛋白质的乳酸细菌生产的发酵产品相比时具有较温和口味特性的发酵产品，如酸乳、酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪像莫泽雷勒干酪、鲜干酪、夸克、黄油乳以及松软的干酪。
在另外一方面，本发明涉及由本发明的方法获得的乳以及由发酵这样的乳获得的发酵产品，其中该发酵产品能够选自酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪像莫泽雷勒干酪、鲜干酪、夸克、黄油乳以及松软的干酪。
在进一步的方面，本发明涉及由本发明的方法获得的乳以及由发酵这样的乳获得的当与通过相应的不表达本发明的小热激蛋白质的乳酸细菌生产的发酵产品相比时具有较温和口味特性的酸乳。
在另一方面，本发明提供了一种发酵乳的方法，其中乳酸细菌包括一种重组的乳酸细菌，其已被工程化从而在与相应的未改进的细菌相比时能在更高的水平上表达小热激蛋白质。
在另一方面，本发明提供了一种发酵乳的方法，其中乳酸细菌包含一种重组的乳酸细菌，其已被工程化从而与相应的未改进的细菌相比超量表达小热激蛋白质。
在另一方面，提供了携带小热激蛋白质基因的用于乳产品发酵程序的耐热的和/或嗜温的乳酸细菌。
在另一方面，本发明提供了一种能够在比通常的发酵温度和/或盐浓度更高的温度和盐浓度下进行乳发酵的重组微生物。
已知小热激蛋白质(sHsp)形成了阻止不可逆聚合以及辅助变性蛋白质重新折叠的分子伴侣家族之一。这些蛋白质存在于各组织中并且其特征在于具有12-30kDa范围内的低分子量、低聚物结构以及存在保守的结构域。这种结构域与脊椎动物的α-嵴高度相似。优选能够用于本发明方法的小热激蛋白质具有16-18kDa的分子量。
一般来说，术语“小热激蛋白质或(sHsp)”是指一种能够结合及稳定变性蛋白质并且阻止它们的不可逆聚合的不依赖于ATP的sHsp。
对完整的细菌基因组序列的分析揭示，大多数细菌仅含有少量的小热激蛋白质。在乳酸细菌中仅有少量的耐热链球菌菌株携带sHsps基因，其位于分离自细菌基因组的小质粒上。
尽管本发明的描述是针对小热激蛋白质进行的，但其应被本领域技术人员理解为其它的热激蛋白质也能够适合并用于本发明的方法中。
本发明的详述改进的乳酸发酵本发明的一个基本目标是提供一种改进基于发酵的乳产品的特性的方法。对于酸乳，其可以通过提供一种在温和香味、酸度、发酵后的酸化、口味以及外观等方面具有非常合意品质的酸乳的生产方法来实现，并且该酸乳另外还具有延长的保存期，如反映在乳清产物减少、香味的温和性以及活体培养物的高密度方面，也就是相对于不用本发明的微生物制成的乳产品，该发酵乳产品的变质被延缓了。
如这里所用的，术语“较温和的口味特性”是指以显著减少的苦味和/或酸味为特征的发酵乳产品。此外或可供选择地，术语“较温和的口味特性”也可以被认为是关于该产品的pH。据此，具有温和的口味特性的本发明的产品的pH高于4.0，优选地在4.0至5.0范围内，更加优选地为4.0至4.7。因此，具有较温和的口味特性的发酵乳产品是指通过本发明的方法将本发明的乳酸细菌与乳一起培养而获得的发酵乳产品。
如这里所用的术语“相应的不表达本发明的小热激蛋白质的乳酸细菌”是指已消除了(也就是它们已失去了)携带本发明的小热激蛋白质(见实施例)的质粒的乳酸细菌。消除细菌中的质粒可以通过本领域公知的方法实现。或者，不表达本发明的热激蛋白质的乳酸细菌可以依然包含质粒但是对可以用遗传重组和/或突变技术编码shsp的基因进行特异性的修饰以阻止这些基因的表达。
尽管目前优选将本发明的方法用于酸乳生产，但是也考虑将该方法用于任何其它类型的基于发酵的乳产品，如硬干酪、半硬干酪像莫泽雷勒干酪、酸凝乳酪、夸克、黄油乳、鲜干酪以及松软干酪，其品质能够通过加入本发明的微生物而得以提高。
本发明涉及的乳能够从反刍动物获得，这些动物优选地选自水牛、奶牛、绵羊、美洲驼、山羊或骆驼。乳也可以经脱脂或半脱脂。乳也可以得自植物如大豆或大米或可以是合成生产的乳。
合成生产的乳是一个用于本领域的术语，用以描述一种类似乳的人工产品。合成乳的组成可以经特别设计以排除例如某些消费者耐受不良或过敏的成分。合成乳也可以是强化乳。例如，强化乳可以包含具有或没有营养价值的化合物如矿物质、维生素、多糖、寡糖、稠化剂或吸水物质。
通常地，一种生物的生长温度范围是一个具有重要分类学价值的特性。依赖于其喜爱的生长温度，将一般的以及包括乳酸细菌的细菌宽泛地分入嗜温细菌和耐热细菌。已知嗜温细菌具有20℃到44℃的最适温度。而耐热细菌的最适温度则在35℃到55℃的范围。
本发明涉及通过组合嗜温的和/或耐热的乳酸细菌发酵乳来生产不同乳品的方法。
根据本发明，嗜温的乳酸细菌被定义为具有20℃到30℃的一般生长温度的细菌。然而，显示出具有30℃到44℃的一般生长温度的嗜温乳酸细菌也可以用于本发明的方法中。
根据本发明，耐热的乳酸细菌被定义为具有35℃到47℃的一般生长温度的细菌。然而，显示出具有50℃到55℃的一般生长温度的耐热乳酸细菌也可以用于本发明的方法中。
下面的总结列出了一些不同的嗜温的和耐热的乳酸细菌，这是为了举例说明的目的而非以任何方式将所述的细菌限于包括在下面总结中的特定乳酸细菌。
起始培养物的最适生长温度
本方法包括一个必要的步骤，即在发酵条件下，有效量的本发明的乳酸细菌在比通常的发酵温度更高的温度对于嗜温的乳球菌最高为43℃(特别是对于乳酸乳球菌乳脂亚种)以及对于耐热的耐热链球菌最高为55℃下发酵乳品。
酸乳的发酵温度是42℃(或为40℃-43℃)，它是介于两种起始生物耐热链球菌(39℃)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(45℃)的最优值之间的折衷值。当耐热链球菌携带shsp时，最适的发酵温度得以改变并且该生物的最适温度得到提高。这意味着你能够在45℃发酵酸乳并且因此携带shsp的德氏乳杆菌保加利亚亚种和耐热链球菌都可以在最适的温度下生长。
据此，本发明提供了嗜温的乳酸细菌，其作为本发明的表达小热激蛋白质的结果，能够在比相应的嗜温乳酸细菌更高的温度下发酵乳，该相应的嗜温细菌不表达根据本发明的小热激蛋白质。
本发明也提供耐热的乳酸细菌耐热链球菌，该细菌在表达根据本发明的小热激蛋白质时能够在42℃-55℃的范围发酵乳，此温度高于不表达本发明的小热激蛋白质的相应耐热链球菌的最适温度。
重要地，当与有效量的德氏乳杆菌保加利亚亚种一起培养时，有效量的表达小热激蛋白质的耐热链球菌细菌能够在高于正常温度时发酵乳，这导致了具有温和口味特性的产品的产生。
如这里所用的，术语“有效量”描述了足以发酵存在于乳中的可检测量的糖化合物的耐热和/或嗜温细菌物如耐热链球菌或乳球菌中的各自的量。更为具体地，本发明的微生物的存在不仅导致了乳中糖化合物的可检测的发酵，而且它也导致了在某一水平上发酵终产品的形成，而这带来了乳产品品质的改良，如显著改善的酸度、质地、口味、外观以及香味的温和性，这些可以归因于添加了本发明的微生物。
在一个方面，本发明提供了在提高的温度下发酵乳以生产具有温和香味的发酵乳产品的耐热链球菌，这些发酵乳产品包括但不限于酸乳、酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪像莫泽雷勒干酪，或鲜干酪。
在另一方面，本发明提供了能在提高的温度下发酵乳以生产具有温和香味的发酵乳产品的乳酸乳球菌，这些发酵乳产品包括但不限于夸克、黄油乳、鲜干酪，或松软干酪。
如这里所用的术语“提高的温度”或“较高的温度”可互换使用并且指嗜热乳酸细菌和耐热乳酸细菌在高于正常发酵温度时发酵乳的能力。
对于嗜温乳酸细菌，术语“提高的温度”是指与通常的发酵温度范围相比，在39℃-48℃，优选在41℃-47℃，更加优选在43℃-46℃，尤其更加优选在43℃-46℃并且最优选在43℃发酵乳(见上面的总结)。
对于耐热乳酸细菌来说，术语“提高的温度”是指与通常的发酵温度范围相比，在48℃-58℃，优选在53℃-57℃，更加优选在54℃-57℃，尤其更加优选在54℃-56℃并且最优选在55℃发酵乳(见上面的总结)。
此外，在高于39℃的温度生长的嗜温起始细菌的获得使用于生产新发酵产品的嗜热的和/或耐热的起始者的新组合得以产生。
在另外一方面，本发明提供了具有减弱的噬菌体侵染敏感性的乳酸细菌。这是由于本发明的乳酸细菌能在升高的温度下发酵乳而导致的。
在另一方面，本发明提供了对于较高的盐浓度例如高于1％，优选地高于2％，更加优选地高于2.5％的盐浓度具有增强的耐受性的乳酸细菌。值得注意的是，正常乳的盐浓度在0.7-0.8％的范围。
本发明的微生物的特性对于南方国家特别重要，在这些国家中在乳中加入盐以阻抑腐物以及致病微生物的生长。与通过不表达本发明的小热激蛋白质的相应的乳酸细菌生产的乳产品相比，当由发酵这样的乳来生产获得具有温和口味特性的乳产品时，这种乳可以更容易地由本发明的乳酸细菌发酵。
在另一方面，本发明提供了一种在4℃保藏时产品的保藏期增长的包含表达本发明的小热激蛋白质的乳酸细菌的发酵产品。
在另一方面，本发明提供了含有42℃以上的耐热起始培养物并且在最终产品中具有较高的活体乳杆菌计数的酸乳产品。
在另一方面，本发明提供了一种发酵乳的方法，其中乳酸细菌包括一种重组的乳酸细菌，其已被工程化从而在一个比相应的未修饰的细菌更高的水平上表达小热激蛋白质，这种未修饰的细菌能够在比通常的发酵温度和/或盐浓度更高的温度和/或盐浓度下进行乳发酵。
在另一方面，本发明提供了一种发酵乳的方法，其中乳酸细菌包含一种重组的乳酸细菌，其已被工程化从而与相应的未修饰的细菌相比超量表达小热激蛋白质，这种未修饰的细菌能够在比通常的发酵温度和/或盐浓度更高的温度和/或盐浓度下发酵乳。
在一方面，本发明提供了源自pSt04和pER1-1的多肽。
在一方面，本发明提供了基本上由用于本发明方法的SEQ ID No1和SEQ ID No2所示氨基酸序列构成的多肽。
如这里所用的术语“氨基酸序列”是指肽、多肽或蛋白序列或它的变异体、同源物或衍生物。
如这里所用的术语“衍生物”包括能够用于本发明方法的多肽的化学修饰。这类修饰的示例为烷基、酰基或氨基团对氢的取代。
优选地，能够用于本发明方法的多肽不包括在其自然环境时的天然多肽和由也在自然环境中的它们的天然核苷酸编码序列表达的天然多肽以及其核苷酸序列在它的也于自然环境中的在天然启动子控制下的天然多肽。
更加优选地，能够用于本发明方法的多肽包括在其自然环境时的天然多肽，和由也在自然环境中的其天然核苷酸编码序列表达的天然多肽，以及其核苷酸序列在它的也于自然环境中的天然增强子控制下的天然多肽。
在本发明的一个方面，多肽将通过与由相应的不表达本发明的多肽的乳酸细菌生产的酸乳相比具有较温和的口味特性的酸乳生产中的乳酸细菌来提供改进的乳发酵方法。
本发明也包括基本上呈现为编码能够用于本发明方法的多肽的SEQ ID No3和SEQ ID No4的核苷酸序列。
在本发明的正文中，编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列可以与自然发生形式或是它的突变体、同源物、片段或衍生物相同。优选地，编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列包含在一种乳酸细菌之内。
如这里所用的术语“核苷酸序列”是指一种寡核苷酸序列或多聚核苷酸序列和它的突变体、同源物、片段及衍生物(例如它的部分)。
核苷酸序列可以是基因组的或合成的或重组源的DNA或RNA，其无论代表有义链或反义链都可以是双链的或单链的。核苷酸序列不必是一个完整的自然发生的DNA序列。因而，该DNA序列可以是，例如，合成的DNA序列、重组的DNA序列(也就是通过使用重组技术制备的)、cDNA序列或部分的基因组DNA序列，包括它们的各种组合。该DNA序列不必是一个编码区。如果它是一个编码区的话，它不必是一个完整的编码区。此外，该DNA序列可以是有义向或反义向的。优选地，它是有义向的。然而，在一些反义DNA序列被转录并用作蛋白质合成模板的实例中，优选反义序列。优选地，该DNA是cDNA或包含cDNA。
因而，优选地，术语“核苷酸序列”意为DNA。更加优选地，术语“核苷酸序列”意为通过使用重组DNA技术制备的DNA(也就是重组DNA)。因而，优选地，本发明涉及一种编码能够用于本发明方法的多肽的DNA序列(优选地为一个cDNA序列)。
在一个优选的方面，本发明提供了基本上由能够用于本发明方法的多肽编码序列构成的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了SEQ ID No3和SEQ ID No4所示的编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列。
在进一步的方面，本发明提供了SEQ ID No3或SEQ ID No4所示的编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列或它的突变体、同源物、片段及衍生物。
经过改变的编码能够用于本发明方法的多肽/小热激蛋白质的多聚核苷酸序列可以根据本发明进行使用并可以包括导致编码本发明的多肽或功能等同的多肽产生的不同核苷酸残基，该多肽可以在其间发生删除、插入或取代。
如这里所用的“删除”被定义为一种核苷酸或氨基酸序列的改变，其中分别有一个或多个核苷酸或氨基酸残基缺失了。
如这里所用的“插入”或“添加”是一种核苷酸或氨基酸序列的改变，其导致了与本发明的自然发生的多肤或编码序列相比，分别添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
如这里所用的“取代”起因于一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸替换。
根据本发明，编码能够用于所述方法的多肽、多肽片段、融合蛋白或它的功能等同物的核苷酸序列，其可以用于产生在合适的宿主细胞中指导表达的重组DNA分子。在本发明的一个实施方案中，将一个编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列有效地连接至一个能够指导在合适的宿主细胞中编码多肽的核苷酸序列的表达的启动子序列上。当导入宿主细胞时，可以在合适的条件下培养转化的宿主/重组微生物直到获得足够水平的本发明的多肽，其后细胞可以被用于在本发明方法下的乳发酵。
肽序列与能够用于本发明方法的多肽序列相关的术语“突变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”，包括将提供所得的核苷酸序列的表达产物的序列中的任何一个(或多个)核酸取代、修饰、替换、删除或向所述的序列中添加一个(或多个)核酸，将会使得乳酸细菌在高于正常温度和/或盐浓度下发酵乳，优选以至少与被SEQ ID No1和SEQ IDNo2覆盖的一个序列的表达产物相同的容量在高于正常的温度和/或盐浓度下使得乳酸细菌发酵乳。
蛋白质也可以发生氨基酸残基的删除、插入或取代，其产生沉默的变化或导致功能等同的多肽。只要本发明多肽的生物学活性得以保持，可以在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性，和/或两亲性相似的基础上有目的地进行氨基酸的取代。例如，包括天冬氨酸和谷氨酸在内的负电荷氨基酸；包括赖氨酸和精氨酸在内的正电荷氨基酸；以及具有相似亲水性值的带有无电荷的极性头端基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
保守的取代例如可以根据下表进行。
第二栏中以及优选第三栏中同一行的氨酸酸可以互相替换。
本发明也包括可以发生同源的取代(取代和替换都可以用于此处以表示一个已存在的氨基酸残基与一个备选的残基的互换)，即相似对相似的取代如碱性的对碱性的、酸性的对酸性的、极性的对极性的等。可以发生非同源的取代，即可以从一类残基替换为另一类或者备选地，涉及将非天然氨基酸如鸟氨酸(此后用Z代表)、二氨基丁酸鸟氨酸(此后用B代表)、正亮氨酸鸟氨酸(此后用O代表)、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸包括在内。
替代也可以通过非天然氨基酸完成包括α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基已酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-戊氨酸*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。符号*用于上面讨论的目的(与同源的或非同源的取代相关)，以显示衍生物的疏水本性，而#用来显示衍生物的亲水本性，#*显示两性分子的特性。
变异的氨基酸序列可以包括可插至该序列的任何两个氨基酸残基之间的合适的间隔子基团，包括除了氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外的烷基如甲基、乙基或丙基。
修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、血红素蛋白的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质体或脂质体衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰基化、γ羧化、羟基化、甲基化、氧化、蛋白分解处理、硒化、硫酸化。
能够用于本发明方法的多肽也可以作为添加了一个或多个多肽结构域的重组蛋白质来表达以方便蛋白质的纯化。这种方便纯化的结构域包括但不限于，使得纯化在固定的金属上进行的金属螯合肽如组氨酸-色氨酸模块(Porath J(1992)Protein Expr Purif 3-263281)、使得纯化在固定的免疫球蛋白上进行的蛋白质A结构域，以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle，WA)中使用的结构域。将可剪切的连接子序列如介于纯化结构域和能够用于本发明方法中的多肽之间的因子XA或肠激酶(Invitrogen，San Diego，CA)包含在内，这对于方便纯化是有用的。
核苷酸序列与能够用于本发明方法的多肤序列相关的术语“突变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括将提供所得的核苷酸序列的表达产物的序列中任何一个(或多个)核酸取代、修饰、替换、删除或向所述的序列中添加一个(或多个)核酸，这将会使乳酸细菌在高于正常的温度和/或盐浓度下具有发酵乳的能力，优选以至少与被SEQ ID No3和SEQ ID No4覆盖的一个序列的表达产物相同的容量在高于正常温度和/或盐浓度下使得乳酸细菌发酵乳的能力。
特别地，术语“同源物”包含了结构上和/或功能上的等同物，其提供的所得的核酸序列具有使得乳酸细菌在高于正常的温度和/或盐浓度下发酵乳的能力。关于序列的等同性(也就是相似性)，优选地至少有75％，更加优选地至少有85％，更加优选地至少有90％的序列等同性。更加优选地至少有95％，更加优选地至少有98％的序列等同性。这些术语也包括序列的等位基因变异。
关于SEQ ID No3和SEQ ID No4的序列等同性能够通过以任何一个或多个序列与另一个序列进行一种简单的“眼球(eyeball)”比较(也就是一种严格的比较)来进行确定，来看另一个序列是否具有例如与所述序列至少75％的序列等同性。
相关序列的等同性也能够通过商业上现有的计算机程序进行确定，这些程序能够运用任何合适的用于确定等同性的算法，使用例如默认的参数来计算两个或更多个序列之间的等同性百分比。这样的计算机程序的一个典型例子是CLUSTAL。有利地，应用带有设定为默认值的参数的BLAST算法。BLAST算法在http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html进行了详细描述，此处引用作为参考。将搜索参数定义如下，可以将参数有利地设定为默认参数。
有利地，由BLAST分析时，“基本等同性”等同于与至少约为7，优选地至少约为9，并且更加优选地为10或更多的EXPECT值匹配的序列。在BLAST搜索中，EXPECT的默认阀值通常为10。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是由程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx运用的启发式检索算法；这些程序利用具有一些改进的Karlin和Altschul(见http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html)将意义归于它们的发现。BLAST程序是专为序列相似性检索，例如鉴别与查询序列的同源性而设计的。对于在序列数据库的相似性检索中的基本问题的讨论，参见Altschul等，1994，Nature Genetics 6119-129。
在http//www.ncbi.nih.gov上可利用的5种BLAST程序执行下列任务blastp-将一种氨基酸查询序列与一个蛋白质序列数据库进行比较。
blastn-将一种核苷酸查询序列与一个核苷酸序列数据库进行比较。
blastx-将一种核苷酸查询序列(两条链)的六框概念的翻译产物与一个蛋白质序列数据库进行比较。
tblastn-将一种蛋白质查询序列与一个在所有六个框(两条链)上动态翻泽的核苷酸序列数据库进行比较。
tblastx-将一种核苷酸查询序列的六框翻译与一个核苷酸序列的六框翻译进行比较。
BLAST使用下列检索参数HISTOGRAM-显示每次检索得分的柱状分布图；默认是yes。(见BLAST手册中的参数H)。
DESCRIPTIONS-将报告的匹配序列的简单描述的数限制到一个特定的数目；默认的限定值为100次描述。(见手册页中的参数V)。
EXPECT-报告相对于数据库序列的匹配的统计显著性阀值，默认值为10，所以根据Karlin和Altschul(1990)的随机模型，10次匹配仅仅有望偶然发现。假如归于一种匹配的统计显著性大于EXPECT的阀值，则该匹配该不予报告。较低的EXPECT阀值更为严格，导致匹配以更少的机会得到报告。小数值是可接受的。(见BLAST手册中的参数E)。
CUTOFF-报告高分片段对的截止分。默认值由EXPECT值计算而得(见上面)。仅仅在归于其的统计显著性至少和具有与CUTOFF相等分值的单独的HSP一样高时HSPs才予以报告。较高的CUTOFF值更加严格，导致匹配以更少的机会得到报告。(见BLAST手册中的参数S)。一般地，使用EXPECT能够更加直观地掌握显著性阀值。
ALIGNMENTS-将数据库序列限制到一个高分片段对被报告的特定数目；默认的限定值为50。假如大于此数的数据库序列碰巧满足了报告的统计显著性阀值(见下面的EXPECT和CUTOFF)，则仅仅报告那些归于最大的统计显著性的匹配。(见手册页中的参数B)。
MATRIX-指定一种交替的Blastp、Blastn、Blastx、Tblastn和Tblastx分值矩阵。默认矩阵是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff，1992Proc Natl Acad Sci U S A.89(22)，10915-9)。有效的可替代的选择包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。对于BLASTN没有交替的分值矩阵可利用；在BLASTN请求中指定MATRIX指示回答一个错误的应答。
STRAND-将TBLASTN检索限定到仅为数据库序列的顶部或底部链；或将BLASTN、BLASTX或TBLASTX检索限定到仅为查询序列的顶部或底部链的阅读框。
FILTER-屏蔽掉具有低组分复杂性的查询序列片段，像由Wootton&Federhen 1993 Computers and Chemistry 17149-163的SEG程序所决定的，或由短周期性的内部重复单元组成的片段，像Claverie&States 1993 Computers and Chemistry 17191-201的XNU程序所决定的，或对于BLASTN，由Tatusov和Lipman(见http//www.ncbi.nlm.nih.gov)的DUST程序所决定的。过滤能够从blast输出中消除统计学上显著的但生物学上不令人感兴趣的报告(例如，针对普通的酸性-、碱性-或脯氨酸富集区的命中数据)，留下相对于数据库序列的特异匹配的可利用的在生物学上更加令人感兴趣的区域。
由过滤器程序发现的低复杂性序列在核苷酸序列中用字母“N”代替(例如，“NNNNNNNNNNNNN”)并在蛋白质序列(例如“XXXXXXXXX”)中用字母“X”代替。
过滤仅仅应用于查询序列(或其翻译产物)，并不应用于数据库序列。默认的过滤是对于BLASTN为DUST，对于其它程序为SEG。
当应用于SWISS-PROT中的序列时，没有任何东西被SEG、XNU或二者屏蔽是正常的，因而不应期望过滤总能产生效果。另外，在一些情况下，序列全部被屏蔽，意味着相对于未过滤的查询序列，被报告的任何匹配的统计显著性都应是不可信的。
NCBI-gi-使得NCBI gi标识符除了被显示在登记号和/或位点名称中之外还显示在出口中。
最优选地，序列比较利用在http//www.ncbi.nih.gov/BLAST上提供的简单的BLAST检索算法进行。
如果在进行序列相同性测定时使用Gap Penalties，那么优选使用下列参数
测定两个序列间等同性和相似性的其它计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，1984 Nucleic Acids Research 12387)和FASTA(Atschul等，1990 J Molec Biol 215403-410)。
本发明也包括与能够用于本发明方法的序列互补的序列或能够与本发明SEQ ID No3和SEQ ID No4的序列或与其互补的序列杂交的序列。
如这里所用的术语“杂交”将包括“一个核苷酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明也包括核苷酸序列的用途，这些核苷酸序列能够与跟这里介绍的序列互补的序列、或任何衍生物、片段或其衍生物杂交。
术语“突变体”也包括与能够和这里介绍的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
优选地，术语“突变体”包括与能够和这里介绍的核苷酸序列在严格条件下(例如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})杂交的序列互补的序列。
更加优选地，术语“突变体”包括与能够和这里介绍的核苷酸序列在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})杂交的序列互补的序列。
本发明也涉及可以与能够用于本发明方法的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括这里介绍的那些互补序列)。
本发明也涉及与能够用于本发明方法的核苷酸序列互补的核苷酸序列(包括这里介绍的那些互补序列)。
能够在中等至最高严格条件下与这里介绍的核苷酸序列杂交的多聚核苷酸序列也包括在本发明的范围内。
术语“可选择性地杂交的”意为核苷酸序列，当其用作探针时，在被发现可用于本发明方法的靶核苷酸序列能够在显著高于背景的水平上与探针杂交的条件下进行使用。由于存在其它核苷酸序列，因此背景杂交可能会发生，例如，在筛选的cDNA或细菌基因组DNA文库中。在这种情况下，背景意指由探针和文库中的非特异性DNA成员间相互作用产生的信号水平，该背景强度比观察到的与靶DNA的特异性相互作用小10倍，优选小100倍。相互作用的强度例如可以通过放射性标记探针，例如用32P来测量。
如Berger和Kimmel(1987，分子克隆技术指南，酶学方法，152，学术出版社，圣地亚哥)所教导的，杂交条件基于核苷酸结合复合物的变性温度(Tm)，并如下面所阐释的，赋予了经定义的“严格”。
最高度的严格一般发生于约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高度严格发生在比Tm低大约5℃到10℃的温度下；中等严格发生在比Tm低大约10℃到20℃的温度下；低度严格发生在比Tm低大约20℃到25℃的温度下。本领域技术人员将会理解，最高度严格的杂交能够用于鉴别或检测相同的核苷酸序列而中等(或低度)严格的杂交能够用于鉴别或检测相似的或相关的多核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明包括可以在严格条件下与能够用于本发明方法的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})。在能够用于本发明方法的核苷酸序列为双链时，双链的两条链，或是单个地或是一起被本发明所包括。在该核苷酸序列为单链时，应当理解该核苷酸序列的互补序列也包括在本发明的范围内。
与能够用于本发明方法的序列并非100％同源但落入本发明范围的核苷酸序列能够以许多方法获得。这里所描述的序列的其它突变体例如可以通过用探针检测由一系列来源制得的DNA文库而获得。此外，可以获得其它病毒/细菌、或细胞同源物尤其是在哺乳动物细胞中(例如大鼠、小鼠、牛或灵长类细胞)发现的细胞同源物，并且其同源物或片段通常能够与这里的序列表所示的序列杂交。这些序列可以通过用探针检测由其它动物物种制得的cDNA文库或基因组DNA文库，并且用包含全部或部分的在本发明的序列表中SEQ ID No3和SEQ IDNo4所示的核苷酸序列的探针在中等至高度严格的条件检测这些文库而获得。
突变体以及菌株/物种同源物也可用简并PCR来获得，简并PCR将使用针对编码能够用于本发明方法的序列之中的保守氨基酸序列的突变体或同源物之中的靶序列而设计的引物。保守序列能够，例如，通过对几种突变体/同源物的氨基酸序列进行比对而预测。序列比对能够利用本领域已知的计算机软件进行。例如GCG Wiconsin PileUP程序被广泛使用。在简并的PCR中使用的引物将包含一个或多个简并位置并将在严格条件下进行，该严格条件比使用单一的序列引物针对已知序列来克隆序列的严格性低。
或者，这样的核苷酸序列可以通过经过表征的序列的定点突变来获得，比如在本发明的序列表中SEQ ID No3和SEQ ID No4所示的核苷酸序列。这在例如当需要对沉默的密码子的改变进行测序以优化偏好特定的宿主细胞的密码子时是有用的，其中在该宿主细胞中所述的核苷酸序列得以表达。
能够用于本发明方法的核苷酸序列可以用于制备引物，例如PCR引物、交替扩增反应的引物以及例如通过使用放射性或非放射性标识的传统方法以指示性标识标记的探针或可以克隆到载体中的核苷酸序列。这样的引物、针和其它片段的长度将至少为15，优选至少为20，例如至少为25、30或40个核苷酸，并且也被包括在可用于本发明方法的这里所用的术语核苷酸序列中。
根据本发明的核苷酸如DNA多聚核苷酸和探针的可以以重组方式、合成方式或通过任何本领域技术人员可利用的任何方法制备。也可以通过标准技术对它们进行克隆。
通常，引物是通过合成的方法进行生产的，包括一次一个核苷酸地逐步地制造所要的核酸序列。使用自动化的技术完成这一生产的技术可以容易地从本领域获得。
更长的核苷酸序列通常是利用重组技术进行制备的，例如，使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这包括制备一对位于待克隆的靶序列的一个区域的两侧的引物(例如大约15到30个核苷酸的)，使引物与得自一个细菌细胞的mRNA或cDNA接触，在引发目标区扩增的条件下进行聚合酶链反应(PCR)，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)以及回收扩增的片段。可以将引物设计成包含合适的限制性酶识别位点使得扩增的DNA能够被克隆到一个合适的克隆载体中。
由于遗传密码固有的简并性，基本上编码相同的或功能等同的氨基酸序列的DNA序列，可以用于克隆并表达本发明的多肽。如本领域技术人员将会理解的，对于一定的表达系统，生产由具有非天然发生的密码子的核苷酸序列编码的能够用于本发明方法的多肽是有利的。例如，可以选择受特定的原核细胞偏爱的密码子(Murray E等，1989，Nuc Acids Res 17477-508)，以提高通道表达的比率或生产具有所要特性(如与天然发生序列的转录产物相比更长的半衰期)的重组RNA转录物。
在一个实施方案中，能够用于本发明方法的多肽是一种重组多肽。
优选地使用一种遗传载体来制备可用于本发明方法的重组多肽。
构建体术语“构建体”包括这里所述的核苷酸序列，其直接附着于一个启动子上。对于与本发明相关的术语“融合的”也是如此，包括直接附着。在每一种情况中，这些术语并不包括为与野生型基因启动子以普通方式联系的蛋白编码的核苷酸序列的天然组合以及当它们都处于其自然环境中时。
构建体甚至可以包含或表达一个允许在例如细菌中进行遗传构建体选择的标记，这样的细菌优选为埃希氏菌属，如大肠杆菌，或链球菌属，如耐热链球菌，或乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳亚种，明串珠菌属，片球菌属或双歧杆菌属。可以使用各种存在的标记，比如提供抗生素耐性的标记-例如耐卡那霉素、庆大霉素和氨苄青霉素、青霉素的标记。
优选地，本发明的构建体至少包含与启动子可操作地连接的能够用于本发明方法的核苷酸序列。
载体术语“载体”包括表达载体、转化载体和附加体。
术语“表达载体”意指能够在体内或在体外表达的构建体。
优选地，本发明的载体是质粒。
按照如下所述，在控制的条件下，可以把本发明的载体转化至一个合适的宿主细胞中，为能够用于本发明方法的多肽的表达提供合适环境。因此，在本发明的一个进一步的方面，提供了一种表达本发明多肽的方法，其包括在为编码能够用于本发明方法的多肽的编码序列的载体表达提供的条件下培养如上所述的用一种表达载体转化的宿主细胞。
可操作地连接至编码能够用于本发明方法的蛋白质的序列上的控制序列包括启动子/增强子以及其它的表达调节序列。可以选择这些控制序列使其与宿主细胞兼容，其中所述的表达载体被设计成用于该宿主细胞。术语启动子在本领域是公知的，例如作为一个RNA聚合酶结合位点并且包含了在大小及复杂性范围方面从最小的启动子到包括上游调节序列和增强子的启动子的核酸区。
术语“启动子”在本领域通常的意义上使用，例如一个RNA聚合酶结合位点。启动子可以任选地包含一个增强子元件。
术语“增强子”包括一个DNA序列，其结合至转录起始复合物的其它蛋白质组分上并且因此促进由与其相关联的启动子指导的转录的起始。
启动子可以包括确保或提高在合适的宿主细胞中表达水平的特征。例如，这些特征可以是保守区如Pribnow盒、Kozak序列或TATA盒。启动子还可以包含其它序列以影响(如保持、增强、降低)核苷酸序列的表达水平。例如，合适的其它序列包括转录调节蛋白的靶序列、延伸的-10个基序、RNA引导序列、增量元件及其它。其它序列包括可诱导的元件-如温度、化学品、光或应激诱导元件。并且，提高转录或翻译，可以存在合适的元件。
在另一个实施方案中，可以选择一种组成性启动子来指导能够用于本发明方法的所要多肤的表达。由于其避免了在含诱导底物的培养基上培养表达宿主的需要，因此这样的表达构建体可以带来额外的益处。
启动子一般选自在细菌或真菌中具有功能的启动子，被称为原核启动子或真核启动子。
更加优选地，启动子选自在乳酸细菌中具有活性的启动子。
启动子的可诱导性也可能是有益的，从而能够在细胞的生命周期内对异源基因的表达水平进行调节。可诱导性意指利用启动子所得的表达水平能够被调节。
此外，任何这些启动子都可以通过添加额外的调节序列，例如增强子序列来进行修饰。也可以使用包含来自两个或更多个上述的不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
本发明的载体可以包含一个或多个可选择的标记基因，例如氨苄青霉素或青霉素耐性基因。
对于工业微生物，优选的选择系统是由在宿主生物中不需要突变的选择标记组形成的那些。真菌选择标记的实例是乙酰胺酶的基因(amdS)、ATP合成酶的基因、亚基9的基因(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸-脱羧酶的基因(pvrA)、腐草霉素和苯菌灵耐性基因(benA)。非真菌选择标记的实例为细菌的G418耐性基因(这也可以用于酵母中，但不用于丝状真菌中)、氨苄青霉素或卡那霉素耐性基因(大肠杆菌)、新霉素耐性基因(Bacillus)以及编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大肠杆菌uidA基因。
载体可以用于体外，例如用于生产RNA或用于转染宿主细胞。
本发明的载体也包含附加体。
如在这里所用的术语，“附加体”意指由一系列任选地含有一个启动子的基因组成的遗传物质的单位，其有时作为染色体外的单位，在宿主细胞中具有独立的存在形式，而在另外一些时侯则被整合至细胞的染色体中，与染色体一起进行自身复制。已在细菌中研究了附加体。一组附加体事实上是侵染细菌的病毒。被称为性别因子的附加体决定了染色体物质是否会从一个细菌转移至另一个细菌。其它的附加体携带令细菌耐抗生素抑制作用的基因。另外，附加体携带使细菌能够在高于通常温度、酸度、盐等的情况下存活的基因。
因此，能够用于本发明方法的多肽可以被整合至一个重组载体中(一般是一个可复制的载体)，例如一个克隆或表达载体中。该载体可以用于在一个兼容的细胞中复制核苷酸。因此，在一个进一步的实施方案中，本发明提供了一种通过将多聚核苷酸导入可复制的载体，将载体导入兼容的宿主细胞，以及在引起载体复制的条件下培养宿主细胞来生产能够用于本发明方法的多肽的方法。可以从宿主细胞中回收该载体。合适的宿主细胞在下面结合表达载体一起进行描述。
细胞本发明在它的范围内包括含有本发明的核苷酸分子、构建体或载体的细胞。如这里所述，这些细胞例如可以用于表达。
用编码能够用于本发明方法的多肤的核苷酸序列进行转化的宿主细胞可以在适合于从细胞培养物中表达和回收多肽的条件下进行培养。根据所用的序列和/或载体的不同，重组细胞产生的蛋白质可以被分泌或包含在细胞内。如本领域技术人员将会理解的，含有编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列的表达载体可以被设计成含有信号序列，该信号序列指导多肽通过一种特定的原核细胞膜而被分泌。其它的重组构建体可以将编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列连接至一个编码可促进可溶性蛋白的纯化的多肽结构域的核苷酸序列上(Kroll DJ等，1993，DNA Cell Biol 12441-53，也参见上面对含融合蛋白的载体的讨论)。
能够用于本发明方法的细胞可以以任何适当的形式提供。例如，它们可以以分离的形式、培养物的形式、以保藏的形式等提供。保藏例如可以涉及冷冻保存、缓冲、无菌条件等。能够用于本发明方法的细胞可以通过基因克隆技术或通过任何其它手段提供。
优选地，将能够用于本发明方法的核苷酸序列可操作地连接至一个转录单位上。
如这里所述的术语“转录单位”是含有编码序列以及信号的核酸区域，信号用于使独立于任何其它编码序列的那些编码序列得到表达。因此，每一个转录单位通常至少包含一个启动子、一个任选的增强子以及一个多聚腺苷酸信号。
杂交启动子也可以用于增强表达构建体的可诱导调节。
术语“转化的细胞”意指具有经修饰的基因结构的细胞。对于本发明，当根据本发明的载体导入细胞时细胞具有经修饰的基因结构。
本发明也提供一种方法，包括用能够用于本发明方法的核苷酸序列转化宿主细胞。
本发明也提供一种方法，包括培养转化的宿主细胞，该细胞已在适于由这里所述的核苷酸序列编码的能够用于本发明方法的多肽表达的条件下，用本发明的核苷酸序列进行了转化。
本发明也提供一种方法，包括培养转化的宿主细胞，该细胞已在适于由这里所述的核苷酸序列编码的能够用于本发明方法的多肽表达的条件下，用根据本发明的核苷酸序列或衍生物、同源物、突变体或其片段进行了转化。
本发明也包括与这里所述的序列互补的核苷酸序列或任何片段或其衍生物。假如序列与其片段互补，那么该序列能够用作识别其它生物中的相似的启动子序列的探针。
能够用于本发明方法的多肽及其片段可以在重组的大肠杆菌或真菌中生产。优选地，用于本发明方法的多肽及其片段是在重组乳酸细菌中进行生产的。
术语“转化载体”意指能够从一个实体转移到另一个实体的构建物，其可以来源于该物种或可以出自不同的物种。如果构建体能够从一个物种转移至另一个物种，如从一个大肠杆菌质粒转移到一个细菌中，如链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属或片球菌属中，则该转化载体有时被称为“穿梭载体”。
与本发明相关的术语“宿主细胞”包括任何可以包含编码本发明的重组蛋白和/或从中所得的产物的核苷酸序列的细胞，其中一个启动子使得本发明的核苷酸序列当其出现在宿主细胞中时可以表达。另外，本发明的载体和多聚核苷酸(上述的报道基因构建体)也可以被导入宿主细胞中以复制载体/多聚核苷酸。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞为一个乳酸细菌。例如，该乳酸细菌可以是一种细菌，其选自但不限于链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属或片球菌属。
宿主细胞/宿主生物的转化如前所示，宿主生物可以是原核的或真核的生物。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌。更加优选地为乳酸细菌如链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、片球菌属、明串珠菌属或双歧杆菌属。对于原核宿主转化的教导在本领域中得到大量记载，例如见Sambrook等(分子克隆实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社)以及Ausubel等，分子生物学中的最新方法(1995)，John Wiley&Sons，Inc。
如果使用原核宿主，则需要在转化前对核苷酸序列进行适当的改进，如通过去除内含子来改进。
尽管标记基因表达的存在/缺失提示也存在能够用于本发明方法的核苷酸序列和/或多肤，然而应当确认其存在以及表达。例如，如果编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列被插入至一个标记基因序列中，则可以通过标记基因功能的缺失而识别包含该多肽编码区的细胞。或者，可以在一个单独启动子的控制下随机地标记基因将与编码能够用于本发明方法的多肽的核苷酸序列置于一起。对于诱导以及选择作出应答的标记基因的表达通常也指示多肽的表达。
测定特定分子表达量的另外的方法包括放射性标记(Melby PC等，1993，J Immunol Methods 159235-44)或生物素标记(Duplaa C等，1993，Anal Biochem 229-36)核苷酸、对照核酸的共扩增，以及将实验结果插入其中的标准曲线。多重样品的量化可以通过进行ELISA形式的分析而得以加速，其中以各种稀释度制备能够用于本发明方法的多肽并且分光光度计测量或量热反应提供了快速的量化。
为了在体内或体外生产该多肽，著眼于通过发酵乳来生产本发明的不同乳产品，本发明也涉及包含编码能够用于本发明方法的多肽或突变体、同源物、片段或其衍生物的核苷酸序列的表达载体和转化的宿主细胞。
实施例现在通过实施例对本发明进行阐明，其中参考下列图和表。
图1.A.显示一个SDS-PAGE图1.B显示一个蛋白质印迹图2.A和B.显示一个曲线2-1.显logOD620的曲线图像图2-2.显示一个曲线3.显示一个示意4.显示存活的细胞百分比的曲线图像图5.显示log集落形成单位(％)的曲线图像图6.A显示一个曲线6.B显示一个曲线6.C显示一个曲线7.显示log集落形成单位/ml的曲线图像图8.显示一个曲线9.显示序列表表1.细菌菌株和噬菌体表2.用耐热链球菌S4和保加利亚乳杆菌92063在42℃和50℃生产的酸乳在4℃保存期间pH值的变化。
更加详细解释的附1.A.
耐热链球菌S4-1(泳道2)和S4w/o的可溶性蛋白及其在40℃(泳道3和4)、45℃(泳道5和6)和55℃(泳道7和8)温育60分钟后进行热激的SDS-PAGE。泳道1包含6.5、14.2、18.4、29、48.5和60kDa分子量的蛋白大小标记。泳道9包含从超量表达的大肠杆菌菌株中分离的部分纯化的sHsp。于温育前在指示的时间在52℃进行热激30分钟。
图1.B.在耐热链球菌S4中sHsp表达的诱导。收集在LTM17培养基中生长至对数生长晚期(OD620～1.0)的耐热链球菌S4和S4-1的细胞，以无糖培养基洗涤，并在含0.05％葡萄糖的TM17中进行重悬。将5ml的等份在37、46和52℃温育30分钟(A)或在52℃温育5-60分钟(B)。制备细胞提取物并进行蛋白质斑点分析。A从大肠杆菌中部分纯化的sHsp，泳道1；在52、46和37℃温育的耐热链球菌S4，泳道2-4；在52℃温育的S4-1(阴性对照)，泳道5。B阳性对照，泳道1；5分钟，泳道2；15分钟，泳道3；30分钟，泳道4；60分钟，泳道5。
图2.A.显示在42℃温育的耐热链球菌S4(实心圆圈，(●S4))、其消除质粒后的衍生物S4-1(空心圆圈，(○S4-1))、用重组质粒p99-17-2(shsp+)转化的S4-1(实心三角形，(S4-1))和p00-8-1(shsp)(空心三角形，(S4-1))的生长曲线。
图2.B.显示在52℃温育的耐热链球菌S4(实心圆圈，(●S4))、其消除质粒的衍生物S4-1(空心圆圈，(○S4-1))、用重组质粒p99-17-2(shsp+)转化的S4-1(实心三角形，(S4-1))和p00-8-1(shsp)(空心三角形，(S4-1))的生长曲线。
图2-1耐热链球菌S8(圆圈，(○S8))、其不含质粒的衍生物S8-1(三角形，(S8-1))和以重组质粒p99-17-2转化的菌株S8和S8-1(菱形，正方形，(◇含有p99-17-2转化的S8，□含有p99-17-2的S8-1))。
图2-2乳酸乳球菌菌株Bu2-60、IL1403和MG1363及其用重组质粒p99-17-2转化的衍生物的生长。在37℃或41/42℃下的Bu2-60、IL1403、MG1363(1-三角形和4-正方形，(37℃和□41/42℃))；在37或41/42℃下的转化的菌株(2-圆圈和3-菱形，(○37℃和◇41/42℃))。
从图中看出所有的乳酸乳球菌菌株在37℃生长良好(1)而在42℃生长得不好(4)。在42℃用质粒p00-17-2转化的菌株增强了生长(3)而在37℃的生长则没有改变。
图3.质粒pSt04、p99-17-2和p00-8-1的物理图谱。
图4.耐热链球菌S4(圆圈，(○)S4，在52℃预温育和(●)S4，在42℃预温育)及其无质粒的衍生物S4-1(三角形，()S4-1，在52℃预温育和()S4-1，在42℃预温育)在60℃于TM17培养基中的热存活曲线。在暴露于60℃之前，将细胞在42℃(实心符号，(●)S4和()S4-1)或52℃(空心符号，(○)S4和()S4-1)进行预温育30分钟。
从图4看出，S4显示了比无质粒菌株S4-1更好的存活力。
图5.耐热链球菌S4及其无质粒的衍生物S1在不同的pH值下于4℃保存期间的存活。将细胞重悬在通过加入乳酸预调至适合pH的生长培养基中并于4℃保存至多15天。每隔三天通过将适合的稀释物铺平在LTM17琼脂培养基上来测定细胞计数。(●)S4，pH5.5；(○)S4，pH4.5；()S4，pH3.5；()S4-1，pH5.5；(■)S4-1，pH4.5；(□)S4-1，pH3.5。
从该图能够看出在所有提及的pH值下S4表现了较好的存活。在1-2天的保存后S4-1的存活急剧减少，并且在4-6天后几乎没有细菌存活。
图6.在不同温度下用耐热链球菌S4和S4-1以及保加利亚乳杆菌92063进行的单一或混合菌株发酵中的脱脂乳酸化。接种混合菌株中的每一种菌株以5×106CFU/ml的量给脱脂乳，而对于单一的菌株发酵则接种107CFU/ml。根据多频道pH计自动跟踪pH的降低。
图6.A在50℃下的Lb92063(1)；在50℃下的S4(2)；在42℃时的S4(3)；在50℃时S4和Lb(4)；在42℃时的Lb(5)；在42℃时的S4和Lb(6)。然后是图6.B在50℃时的Lb92063(1)；在50℃时的S4-1(2)；在42℃时的S4-1(3)；在50℃时的S4-1和Lb(4)；在42℃时的Lb(5)；在42℃时的S4-1和Lb(6)。
图6.C在50℃时的Lb HM(1)；在50℃时的S4-1(2)；在50℃时的S4(3)；在50℃时的S4和Lb HM(4)；在42℃时的S4(5)；在42℃时的S4-1(6)；在42℃时的Lb HM(7)；在42℃时的S4和Lb HM(8)。
从图6A和B看出，在两图中的6号曲线都对应于一种正常的酸乳发酵曲线。在15-20小时的发酵后达到pH3.6左右。图6A和6C中的曲线4显示在50℃进行的发酵，其中耐热链球菌携带shsp。这些发酵达到pH5.2左右的水平。图6B中的曲线3显示用S4-1和Lb92063进行的发酵终止于pH5.2左右。
图7.耐热链球菌S4以及保加利亚乳杆菌于50℃在单一或混合菌株培养液中生长以及随后的保存后的存活。将脱脂乳接种至107CFU/ml的细胞终密度并在50℃温育24小时。随后在4℃将发酵后的乳保藏15天。每隔3天测量每一种菌种的全部细胞计数以及总的细胞计数(乳杆菌与S4加在一起的计数)。全部计数(空心正方形，(□))；混合培养基中的S4和Lb(空心三角形，()S4)和实心方形(■Lb)；S4(实心圆圈，(●)S4)；Lb(实心三角形，()Lb)。
图8.耐热链球菌S8及其经过转化的衍生物S8(pSt04-shsp+)在42℃和48℃的酸化。以107CFU/ml给脱脂乳接种并在存在或不存在噬菌体s8和感染复数(m.o.i)为10的情况下于所示温度下进行温育。使用多频道pH计自动地跟踪酸化。S8(pSt04)+噬菌体s8，42℃(1)；S8(pSt04)+噬菌体s8，48℃(2)；S8(pSt04)w/o噬菌体，48℃(3)；S8(pSt04)w/o噬菌体，42℃(4)。
图9.序列表SEQ ID No1SEQ ID No2SEQ ID No3SEQ ID No4具体实施例携带小热激蛋白质的基因的质粒pSt04和pER1-1的一般特性对质粒pSt04和pER1-1的核苷酸序列进行了测定(登录号分别为AJ242477和AJ242476)，该质粒属于来自耐热链球菌的DNA同源组I(Janzan等，1992)。这些质粒在大约1200bp的DNA区域上具有超过90％的同源性，该区域对于质粒复制是必需的。
除repA基因外，质粒pSt04和pER1-1各自还具有一个第二开放阅读框，该阅读框分别编码具有155和142个氨基酸残基的多肽(SEQID No1和SEQ ID No2)，对应于18，042和16，422Da的分子量。这些开放阅读框相对于repA基因按逆时针方向排列。起始密码子的上游8bp处的推定的核糖体结合位点(GAa/gGAAAG)的前面是5’-TTGAAA...(16bp)...TATAAT启动子区。预期的基因产物与在其它耐热链球菌菌株(O’Sullivan等，1999，Somkuti等，1998)中观察到的小热激蛋白质(sHsp)高度相似(＞90％)。这些sHsp属于普遍存在于原核和真核生物中的休克反应蛋白质家族。sHsp合成从一个在pH值低于pH4.5或温度高于45℃时的低的基础水平开始显著地提高了并且可以通过在pH4.0或者在52℃时的一个短的30分钟的休克而得到进一步提高(图1)。
小热激蛋白质的功能i)在升高的温度下的生长和耐热性将携带有质粒pSt04和pER1-1的耐热链球菌菌株S4和ER1在不同温度下的生长行为分别与它们的消除了质粒的衍生菌株S4-1和ER1-1的生长行为进行了比较。在42℃时所有的菌株都以相同的速率生长到大约2×109CFU/ml的细胞终密度。在45℃时不含质粒的菌株生长得稍显缓慢，但也达到了几乎相同的细胞终密度。在52℃时只有带有质粒(shsp)的菌株能够以减小的生长速率生长至大约1×109的细胞终密度(图2)。
为了证实shsp基因是负责在高温下的生长能力的，用重组质粒p99-17-2和p00-8-1转化不含质粒的菌株S4-1。质粒p99-17-2含有克隆入大肠杆菌载体pBluescript(SK+)中的整个pSt04序列并且携有来自金黄色葡萄球菌质粒pE194的红霉素抗性基因作为革兰氏阳性细菌的选择标记。质粒p00-8-1是失去了整个shsp序列的p99-17-2的删除衍生物(图3)。菌株S4-1(p99-17-2)和S4-1(p00-8-1)分别显示了与S4和S4-1相同的生长行为，证明shsp基因的存在是负责在最高达52℃的温度下的生长能力的(图2)。
随后通过电穿孔将重组的质粒p99-17-2转移入耐热链球菌菌株S8和S11以及嗜温的乳酸乳球菌乳亚种菌株LL1403和Bu2-60和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株MG1363中。S8和S11的最大生长温度分别从45℃提高到了最高达48℃(图2-1)和52℃(图2)，并且乳球菌菌株的最大生长温度由37℃提高到了最高达42℃(图2-2)。
与不含质粒的衍生菌相比，耐热链球菌菌株S4和ER1显示了更高的耐热性。大约50％带有质粒的细胞在60℃培养时存活了2小时，而不含质粒的细胞则没有一个存活。通过短暂的热休克(在52℃30分钟)，耐热性可以得到进一步的提高(图4)。
ii)耐酸性除了提高最大生长温度和改善耐热性外，sHsp的存在还提高了耐酸性。表达sHsp的细胞表现出在低pH保藏时生存能力的显著提高。甚至在pH3.5时，该pH值低于大多数发酵乳产物中的pH值，超过40％的细胞可以在4℃保藏时存活15天，而在相同条件下在7天后没有检测到sHsp阴性突变子的细胞。
iii)耐盐性将耐热链球菌菌株S4及其不含质粒的衍生菌S4-1在0-3％浓度的NaCl下进行生长。在最高到1％的NaCl浓度下，在生长速率或细胞终浓度上都没有观察到明显的差别。在1.5到2.5％的盐浓度上野生型菌株比消除了质粒的菌株生长得更快。而在3％的NaCl盐浓度上则没有生长发生。
将耐热的耐热链球菌菌株应用到含有保加利亚乳杆菌的混合培养液上进行乳发酵携带有质粒编码的shsp基因的耐热链球菌菌株显示了耐热性和耐酸性的明显提高。为了证明两个现有的shsp阳性耐热链球菌菌株S4和ER1是否适合于酸乳生产，将这些菌株中的每个菌株与德氏乳杆菌保加利亚亚种(保加利亚乳杆菌)92063和HM组合进行脱脂乳的发酵。保加利亚乳杆菌与消除了包含shsp基因的质粒的S4和ER1的等基因衍生物混合培养物作为对照。
在乳发酵期间的酸化作用菌株组合S4/Lb92063在42℃以及50℃的发酵中显示了显著的原共生效应。在42℃时在7小时后，pH值降到4.0以下，并且在24小时后减少到pH3.6。在50℃时在8-10小时后，pH值是4.3，在24小时后pH值为4.1(图6A)。S4-1和LB 92063的菌株组合在42℃显示了显著的原共生效果，但是在50℃时没有观察到酸化作用(图6B)。
对于耐热链球菌菌株ER1和Lb92063的组合，得到了相似的结果。但是酸化作用稍微低一些。在42℃时的对照发酵(耐热链球菌ER1-2和Lb 92063)与在这个温度下的测试发酵非常相似；在50℃时的酸化作用是不充分的。
耐热链球菌菌株S4与保加利亚乳杆菌HM的组合也给出了与S4/Lb92063组合相似的结果(图6C)。
在乳发酵和随后的保藏期间的细胞计数对于每种菌株以2×106cfu/ml的细胞数开始，在50℃时在含有S4/Lb92063混合培养物的发酵中细胞数增加到109(S4)和6×108(Lb)cfu/ml。在单一的菌株发酵中，菌株S4生长到大约5×108cfu/ml的细胞数量，而消除了质粒的shsp阴性的菌株S4-1和Lb92063仅仅缓慢生长到大约8×106的细胞终密度。在发酵24h后，将发酵后的乳于4℃下贮藏15天。每隔三天对单个菌株的细胞数量和总的细胞数进行一次测定。在贮藏期结束的时候，观察到耐热链球菌S4和Lb92063的细胞数量只有轻微的减少。Lb92063的高存活尤其令人感到惊奇，因为该菌株在50℃进行单一的菌株培养生长时，在贮藏12天后就不再能被检测到了(图7)。对于这种保加利亚乳杆菌在50℃在与耐热的耐热链球菌一起混合培养时的存活的积极效果的原因尚不知道。使用耐热链球菌S4和保加利亚乳杆菌92063的混合菌株培养物在42和50℃时进行酸乳的生产将S4和Lb92063的混合培养物接种到巴氏灭菌乳中并且在42℃和50℃培养12小时。在发酵结束的时候，对酸乳产物的质地、pH、细胞数量、口味和香味进行测试。随后将酸乳产物在4℃贮藏2个星期，并且每隔三天进行如上测试。在42℃生产的酸乳质地坚实，有轻微的乳清分离，pH值为3.6到3.5，每个菌株的细胞数量都达到了大约109cfu/ml。其口味非常酸并且具有发酸的香味。在50℃时生产的酸乳也具有坚实的质地，并且没有乳清分离，发酵结束后pH值约为4.3，而在贮藏期结束的时候pH值为4.0(表2)。细胞数量与42℃时的发酵相当。在贮藏期间只有轻微的减少。酸乳口味温和，与良好发酵的“温和的酸乳”相当，并且具有丰富的香味。用耐热的耐热链球菌和保加利亚乳杆菌的适当组合在50℃进行发酵得到了一种酸乳，其具有“温和的酸乳”的特性，但是在至少经过了产品的保藏期的贮藏后还具传统酸乳的原始微生物区系并且具有高的细胞密度。
发酵温度对噬菌体敏感性的影响为了测试发酵温度对噬菌体敏感性的影响，在42和48℃时在感染复数约为10时的情况下在烈性噬菌体S8不存在或存在时对用shps-质粒pSt04转化的耐热链球菌S8的酸化作用的活性进行了测定。在42℃下没有观察到酸化作用，而在48℃时得到的最终pH值为5.0(图8)。这表明，甚至在这种不切实际的高噬菌体负载下较高的发酵温度对噬菌体的攻击也具有保护作用。
材料与方法细菌菌株、噬菌体和培养基在本研究中使用的菌株列在表1中。耐热链球菌和乳球菌在添加了1％乳糖的TM17培养基上生长(Krusch等.1987)，保加利亚乳杆菌在MRS上生长(Merck，Darmstadt，德国)。大肠杆菌在LB培养物中在37℃生长(Sambrook等，1989)。在适当时，按如下方式加入抗生素分别对于耐热链球菌和乳球菌加入3或5μg/ml的红霉素，并且对于大肠杆菌加入每毫升100μg的红霉素。象Sambrook等(1989)所描述的那样进行蓝白选择。在9％的脱脂乳培养基中测定酸化作用，使用8-频道的pH计对pH进行监测(Ingenieurbüro Messelektronik，Chemnitz，德国)。象Sambrook等1989描述的那样对噬菌体s8进行增殖并且以大约为10的感染复数将其加入到发酵分析物中。
DNA分离和操作用NucleoSpin试剂盒将质粒DNA从大肠杆菌中分离出来，并通过对该方法作相应的调整从耐热链球菌和乳酸乳球菌中分离出质粒DNA(Macherey-Nagel，Düren，德国)。酶购自New England Biolabs，Beverley，Mass，并且按照生产商说明使用。
转化通过Bio-Rad实验室，Richmond，Calif推荐的程序对大肠杆菌进行电转化，乳酸乳球菌如Holo和Nes(1989)所描述的，耐热链球菌根据Mohamed(博士论文，Univ.Koel，德国，2002)所述。
质粒p99-17-2和p00-8-1的构建通过用HinP1I消化使质粒pSt04线性化并将其克隆到pBluescrips II SK+(Cla I)中。随后通过将红霉素抗性基因盒插入pBluescript的BamHI位点来对重组的质粒p99-16-5进行遗传标记。一个小的EcoRI片段，产生了缺少整个shsp基因的p00-8-1。该重组的质粒在大肠杆菌XL-blue中增殖并且通过电穿孔而转化到耐热链球菌中。
质粒的消除基本上按照Gasson(1983)所描述的方法，通过原生质体诱导的消除来消除耐热链球菌菌株中的质粒。
参考文献Chopin，A.M，Chopin，M.C.，Moille-Batt，A.&Langella，P.(1984).Twoplasmid-determined restriction and modification systems inStreptococcus lactis.Plasmid 11，260-263.
Gasson，J.M.(1983).Plasmid complement of Streptococcus lactisNCD0712 and other lactic streptococci after protoplast-inducedcuring.J.Bacteriol.154，1-9.
Holo，H.&Nes，I.F.(1989).High-frequency transformation，byelectroporation，of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown withglycine in osmotically stabilizedmedia.Appl.Environ.Microbiol.55，3119-3123.
Janzen，T.，Kleinschmidt，J.，Neve，H.&Geis，A.(1992)Sequencingand characterization of pST1，a cryptic plasmid fromStreptococcus thermophilus.FEMS Microbiol Lett 95，175-180.
Krusch，U.，Neve，H.，Luschei，B.&Teuber，M(1987).Characterizationof virulent bacteriophages of Streptococcus salivariussubsp.thermophilus by host specificity and electronmicroscopy.Kieler Milchwirtsch Forsch Ber 39，155-167.
Mohamed，H.A.M.I(2002).New techniques for foodbiotechnology.PhD-Thesis，University Kiel，Germany.
O’Sullivan，T.，van Sinderen，D.&Fitzgerald，G.(1999).Strecturaland functional analysis of pCI65st，a 6.5kb plasmid fromStreptococcus thermophilus NDI-6.Microbiology 145.127-134.
Sambrook，J.，E.F.&Maniatis，T(1989).Molecular cloningalaboratory manual，2nded.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.
Somkuti，G.A.，Solaiman，D.K.Y.&Steinberg，D.H.(1998).Structuraland functional properties of the hsp 16.4-bearing plasmid pER341in Streptococcus thermophilus.Plasmid 40，61-72.
Gonzalez-Marquez，et al.，(1997)Microbiology，vol.1431587-1594.
此处通过参考文献将上述说明书中提到的所有出版物引入。同样通过参考文献将通过登录号或gi号所示的所有数据库序列引入。
在不背离本发明的范围和精神的情况下，对本发明所述的各种方法和系统进行各种改进和变化对于本领域技术人员是显而易见的。尽管结合特定的优选的实施方案对本发明进行的描述，然而应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限制到这些特定的实施例。事实上，对于食品发酵或相关领域的技术人员来说显而易见的是对所述的实施本发明的方式进行的多种改进被认为是在下面的权利要求书的范围之内。
表1细菌菌株和噬菌体细菌菌株或噬菌体相关的特征 参考文献的来源嗜热链球菌S4 pSt04，耐热的 BAFMa)S4-1不含质粒的S4 本研究S4-1(p99-17-2) 耐热的 本研究ER1 pER1-2(shsp)，pER1-BAFMER1-2 2 本研究S8 除去了pER1-1的 BAFMS8(pSt04) pSt08 本研究S8(p99-17-2)耐热的 本研究S11 耐热的 Nestle，Vevey，瑞士S11(p99-17-2) 不含质粒的 本研究保加利亚乳杆菌 耐热的92063 BAFMHM 工业菌株 BAFM乳酸乳球菌 工业菌株Gasson，1983MG1363不含质粒的乳酸乳球菌 本研究MG1363(P99-17-2)712Chopin等.，1984IL1403耐热的 本研究IL1403(P99-17-2)不含质粒的 BAFMBu2-60耐热的 本研究Bu2-60(P99-17-2)不含质粒的 BAFM噬菌体s8耐热的有同组异序头的a)strain collection of the Institute of Microbiology，Bundesanstalt für Milchforschung，Kiel，德国表2.使用耐热链球菌S4和保加利亚乳杆菌92063在42℃和50℃生产的酸乳在4℃贮藏期间的pH值的变化
权利要求
1.一种制备乳产品的方法，该方法包括下列步骤将乳与一种能够表达小热激蛋白质的乳酸细菌混合，并在比通常的发酵温度更高的温度下和/或在比通常的发酵盐浓度更高的盐浓度下培养该乳/细菌混合物，其中当与用相应的不表达热激蛋白质的乳酸细菌生产的乳产品相比时，该乳产品具有较温和口味的特性。
2.一种根据权利要求1的制备乳产品的方法，其中当与用相应的不表达热激蛋白质的细菌生产的乳产品的pH值相比时，所述的具有较温和口味的特性的产品具有较高的pH值。
3.一种根据权利要求1或2的方法，其中所述的产品的pH高于4.0。
4.一种根据权利要求1、2或3的方法，其中所述的细菌包含一种嗜温乳酸细菌和/或一种耐热乳酸细菌。
5.一种根据权利要求4的方法，其中所述的方法包括将乳与第一和第二乳酸细菌混合，其中所述的第一和/或第二乳酸细菌中的每一种都能够表达一种小热激蛋白质，并且如具体指出的那样培养乳/细菌混合物。
6.一种根据权利要求5的方法，其中所述的第一乳酸细菌和所述的第二乳酸细菌中的每一种都包含一种嗜温细菌。
7.一种根据权利要求6的方法，其中在加入第二嗜温乳酸细菌前将乳与含有第一嗜温乳酸细菌的起始培养物混合。
8.一种根据权利要求5的方法，其中所述的第一乳酸细菌和所述的第二乳酸细菌中的每一种都包含一种耐热细菌。
9.一种根据权利要求8的方法，其中在加入第二耐热乳酸细菌前将乳与含有第一耐热乳酸细菌的起始培养物混合。
10.一种根据权利要求5的方法，其中所述的第一乳酸细菌包含一种嗜温乳酸细菌，而所述的第二乳酸细菌包含一种耐热乳酸细菌。
11.一种根据权利要求10的方法，其中在加入耐热乳酸细菌前将乳与含有嗜温乳酸细菌的起始培养物混合。
12.一种根据权利要求11的方法，其中在加入嗜温乳酸细菌前将乳与含有耐热乳酸细菌的起始培养物混合。
13.一种根据权利要求7或9中任意一项的方法，其中将含有所述的第一乳酸细菌的起始培养物和所述的第二乳酸细菌同时加入乳中。
14.一种根据权利要求10-12中任意一项的方法，其中同时加入所述的起始培养物和所述的第二培养物。
15.一种根据前述的任意一项权利要求的方法，其中所述的嗜温细菌独立地选自乳球菌属、明串珠菌属、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种，以及乳酸乳球菌乳亚种。
16.一种根据前述的任意一项权利要求的方法，其中所述的耐热细菌独立地选自链球菌属、双歧杆菌属、片球菌属、乳杆菌属、耐热链球菌、德氏乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种。
17.一种根据权利要求8-14中任意一项的方法，其中所述的第一耐热细菌为德氏乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种，并且所述的第二耐热细菌为耐热链球菌。
18.一种根据前述的任意一项权利要求的方法，其中所述的嗜温乳酸细菌能够在最高为43℃时发酵乳。
19.一种根据前述的任意一项权利要求的方法，其中所述的耐热乳酸细菌能够在最高为55℃时发酵乳。
20.一种根据前述的任意一项权利要求的方法，其中所述的方法包括在比用相应的不表达小热激蛋白质的细菌培养乳的pH范围更低的pH范围下培养所述的乳/细菌混合物。
21.一种根据权利要求20的方法，其中所述的乳酸细菌在3.9至4.5范围的pH值下保持存活。
22.一种根据权利要求20或21的方法，其中当在pH3.9，在4℃保存15天时，在培养物中至少有106个乳酸细菌保持存活。
23.一种根据前述的任意一项权利要求的方法，其中所述的乳酸细菌包括重组的乳酸细菌，其已被工程化从而在与相应的未改进的细菌相比时在更高的水平上表达小热激蛋白质。
24.一种重组的乳酸细菌，其已被工程化从而在与相应的不表达所述的小热激蛋白质的细菌相比时在更高的水平上表达小热激蛋白质。
25.一种根据权利要求24的重组的乳酸细菌，其中所述的细菌能够在比通常的发酵温度和/或盐浓度更高的温度和盐浓度下进行乳的发酵。
26.一种根据权利要求1-23中任意一项的方法，其中所述的乳酸细菌是根据权利要求24或25中任意一项的重组细菌。
27.一种根据权利要求1-23或26中任意一项的方法，或根据权利要求24或25的重组细菌，其中所述的乳酸细菌或重组的乳酸细菌包含一种编码与组成型或可诱导的启动子可操作地相连的小热激蛋白质的核酸序列。
28.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的小热激蛋白质包含一个shsp序列或它的部分，优选源自耐热链球菌。
29.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的小热激蛋白质源自具有在18到16kDa范围内的分子量的pSt04或pER1-1。
30.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的小热激蛋白质包含如SEQ ID No1或SEQ ID No2所示的氨基酸序列或其变异体、同源物、片段或其衍生物。
31.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的核酸序列包含如SEQ ID No3或SEQ ID No4所示的序列或其变异体、同源物、片段或其衍生物。
32.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，它包含一种编码小热激蛋白质的染色体外的核酸、优选附加型核酸。
33.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，它包含一种在载体中，优选在质粒载体中编码小热激蛋白质的核酸。
34.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的乳包括半脱脂乳，或脱脂乳或源自大豆或大米的乳，或合成的乳。
35.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的乳从反刍动物，优选从选自水牛、奶牛、绵羊、美洲驼、山羊或骆驼的反刍动物获得。
36.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的乳包含高浓度的NaCl。
37.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的乳酸细菌或重组的乳酸细菌在升高的发酵温度时显示减弱的对噬菌体侵染的敏感性。
38.根据前述的任意一项权利要求的方法或重组的乳酸细菌，其中所述的乳产品是与通过所述方法或相应的不表达小热激蛋白质的重组的乳酸细菌生产的酸乳相比时具有较温和口味特性的酸乳。
39.一种制备乳产品的方法，该方法包括下列步骤将乳与一种能够表达小热激蛋白质的乳酸细菌混合，并且在比通常的发酵温度更高的温度和/或在比通常的发酵盐浓度更高的盐浓度下培养该乳/细菌混合物，其中所述的乳产品选自酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪如莫泽雷勒干酪、鲜干酪、夸克、黄油乳或松软的干酪。
40.一种通过权利要求1至23或26至39中任意一项的方法制备的乳产品。
41.一种包含权利要求26至39中任意一项的重组的乳酸细菌以及乳或乳产品的组合物。
42.一种编码权利要求31的小热激蛋白质的核苷酸序列。
43.一种包含权利要求42的核苷酸序列的构建体。
44.一种包含权利要求43的核苷酸序列的载体。
45.一种宿主细胞，其中在该细胞中掺入了权利要求42-44任意一项的核苷酸序列。
46.一种根据权利要求45的宿主细胞，其中所述的核苷酸序列能够得到表达。
47.一种基本上如这里所述的通过表达小热激蛋白质的乳酸细菌发酵乳的方法。
全文摘要
本发明涉及与乳酸细菌有关的食品发酵程序领域，并且特别涉及改进乳产品特性如酸度、发酵后的酸化、芳香、香味、温和性、稠度以及质地。特别地，本发明提供一种使用耐热的耐热链球菌和嗜温的乳酸乳球菌生产乳产品的方法，该细菌带有编码表达小热激蛋白质的质粒使得发酵可以在高于正常发酵温度的温度下进行。表达所述热激蛋白质的该耐热及嗜温的乳酸细菌也表现出对较低pH和较高盐浓度的耐受性以及在升高的发酵温度下对噬菌体攻击的减弱的易感性。
文档编号C12N1/19GK1642432SQ03805909
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月11日 优先权日2002年3月11日
发明者A·布德－尼基尔, A·盖斯, K·赫勒, M·E·－D·哈桑 申请人:丹尼斯科有限公司