专利名称：生产类胡萝卜素的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物生产类胡萝卜素的生物学方法，所用微生物为Xanthophyllomyces(Phaffia)属微生物，能在存在抑制焦磷酸法呢酯(farnesyl pyrophosphate)(此后称为FPP)生物合成甾醇的抑制剂的前提下生产类胡萝卜素。
已报道的类胡萝卜素有600多种不同的种类，来自在细菌、酵母、真菌和植物中发现的类胡萝卜素源生物体。现在商业上以微生物生产的只有其中两种，β-胡萝卜素和虾青素，用于食品和饲料业。这些类胡萝卜素作为天然色素以及有益于人体健康的强抗氧化性的功能性物质，具有重要的工业价值。此外，从商业前景来看，对染色剂虾青素的需求在增长，尤其是在养鱼业中，比如鲑鱼养殖，因为虾青素(astaxanthin)使鱼类带鲜明的桔红色而有助于吸引消费者。
其它类胡萝卜素，例如番茄红素、玉米黄素、角黄素和β-隐黄素，它们作为天然的色素和抗氧剂也具有重要的工业价值。番茄红素经体外试验显示能有效去除单态氧。番茄红素抑制脂质过氧化作用，其血清水平与发生胰腺癌和子宫癌的危险成反比。水果和蔬菜，例如西红柿、粉红葡萄柚、中的红色、红葡萄皮、西瓜和红番石榴之所以呈红色，都是因为番茄红素。其它膳食资源包括木瓜和杏。玉米黄素是黄色的胡萝卜素，它是一种氧化的β-胡萝卜素羟基衍生物。玉米黄素富含于菠菜、玉米和许多其它植物品种中。这是一种强抗氧化剂，在视网膜中也有发现。公认玉米黄素可以起到过滤器的作用，并能防护来自于眼睛的有害蓝光和抵抗与年龄相关的斑点样退化。角黄素是红色的类胡萝卜素，在许多植物和动物身上都有发现。用于鸡蛋黄、小鸡和养殖的鳟鱼的着色，以及用于要求更显桔红色的食品和化妆品中。角黄素也可起到单态氧的猝灭剂和自由基的灭火剂的作用。β-隐黄素是黄色的类胡萝卜素，存在于桔子、芒果、番木瓜、南瓜和许多其它水果中。β-隐黄素也被认为是一种预防癌症的强抗氧剂。
在能大量生产类胡萝卜素的微生物中，法夫红酵母(Phaffiarhodozyma)是一种最为人所熟知的类胡萝卜素源菌株。该酵母菌株产生虾青素，是现在用于供应食品和饲料业所需虾青素的几种微生物之一。在近期的分类学研究中，披露了一种法夫红酵母的雄分生孢子(sexual cycle)，其远距离刺激变形态(telemorphic state)被命名为Xanthophyllomycesdendrorhous[Golubev，Yeast 11101-110(1995)]。在本申请的描述中，取其众所周知的名称法夫红酵母。
为了提高微生物生产类胡萝卜素的水平开展了一些研究，比如，包括使用合适的宿主菌株通过基因工程构造重组微生物使其获得大量生产几种类胡萝卜素的能力，这类菌株有大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母[Misawa等，J.Bacteriol.1726704(1990)；Yamano等，Biosci.Biotech.Biochem.581112(1994)；Miura等，Biotechnol.Bioeng.58306(1998)]，改进菌株以获得高产发生器，例如来自法夫红酵母的虾青素的高产发生器[Johnson等，Critical Reviews inBiotechnology11297-326(1991)]，改进方法以获得最佳的发酵工艺，例如已实施的通过法夫红酵母(US5,972,642)生产虾青素的方法。US5,356,809公开了在法夫红酵母细胞中加入抗霉素或另一种主要呼吸链抑制剂提高了虾青素的产出。但该方法并不是特别有效和方便。显然，仍然需要有一个简单有效的方法来提高类胡萝卜素的产率。
本发明的一个实施方式是生产类胡萝卜素的生物学方法，其中包括有氧条件下在含水营养培养基中培养一种能在抑制剂抑制FPP生物合成甾醇的前提下生产类胡萝卜素的微生物。
更优选使用高度类胡萝卜素源微生物，例如属于Xanthophyllomyces(Phaffia)属的微生物。因而，本发明所述微生物优选的例子是Xanthophyllomyces(Phaffia)属的微生物。本发明优选的Xanthophyllomyces(Phaffia)菌株得自美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，U.S.A.称为Xanthophyllomyces(Phaffia)ATCC96594(根据布达佩斯条约再次于1998年4月8日保藏，保藏号ATCC74438)。
因而本发明特别地涉及到一种生产类胡萝卜素的方法，其中包括培养一种Xanthophyllomyces(Phaffia)属的微生物在抑制剂抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生产类胡萝卜素，一种用于有氧条件下在含水营养培养基中生产类胡萝卜素的底物，以及从所述微生物的细胞或从培养基中分离出所得到的类胡萝卜素。
尤其是，对于本发明所述的生物学方法，更优选抑制甾醇途径的初始反应，该反应由角鲨烯合酶催化。
据报道，角鲨烯合酶(在本领域也称作角鲨烯合成酶)抑制剂可以降低细胞的甾醇水平。角鲨烯合酶是一种催化甾醇生物合成甾醇初始关键步骤的酶。两分子的FPP缩合形成角鲨烯。
因而，本发明的另一个实施例是生产类胡萝卜素的生物学方法，其中包括培养一种能在抑制剂抑制角鲨烯合酶的前提下生产类胡萝卜素的微生物。
已报道了几种角鲨烯合酶抑制剂[Biler等，Current PharmaceuticalDesign21-40(1996)]。报道的角鲨烯合酶抑制剂大致有三类，铵离子基角鲨烯合酶抑制剂、含FPP类似物的磷，和羧化物基抑制剂。本发明优选任一种角鲨烯合酶抑制剂。这些角鲨烯合酶抑制剂优选的例子之一是铵离子基角鲨烯合酶抑制剂。
而且，优选的铵离子基角鲨烯合酶抑制剂之一是苯氧丙胺型角鲨烯合酶抑制剂[Brown等，Journal of MedicinalChemistry384157-4160(1995)]。已知有很多苯氧丙胺型角鲨烯合酶抑制剂，比如，包括[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-甲基-N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-环戊基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-环丁基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(2-烯丙基-4-丁酰胺基苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-氯-苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-丙基苯氧基)丙胺，和N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)-1-甲基丙胺，和其生物学上可接受的盐。
本发明实施例中所使用的优选的角鲨烯抑制剂包括[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺和N-甲基-N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺。
类胡萝卜素一般通过在培养基中培养一种类胡萝卜素源微生物来进行生产，培养基中包括适合于细胞的常量营养物或微量营养物，如糖蜜、蔗糖或葡萄糖，用作细胞生长的糖源，也作为类胡萝卜素生长的底物，以及氮源如玉米浸渍液、酵母提取物、硫酸二铵、磷酸铵、氨水或脲，磷源如磷酸铵和磷酸和加入的微量营养物或矿物盐如硫酸镁、硫酸锌和生物素或脱硫生物素。
进行培养时优选的条件是pH值的范围在4到8之间，且温度范围在15到26℃之间，培养时间24到500小时，更优选的培养条件是pH值的范围在5到7之间，且温度范围在18到22℃之间，培养时间48到350小时。
进行培养时，进行通气和搅拌通常会使类胡萝卜素的生产取得良好的结果。
在本发明中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制剂被加入培养基中。相应地，抑制剂的浓度应根据抑制剂和用于生产类胡萝卜素的微生物的种类而改变，比如，浓度范围使得在类胡萝卜素生产条件下细胞生长的减少小于50％。更优选的抑制剂浓度可以是在使细胞生长的减少小于30％浓度范围内。
在本发明中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制剂可以在培养的任何阶段被加入培养基中。
按照本发明的方法通过培养类胡萝卜素源微生物所生产的类胡萝卜素，可以在被分泌进入培养基的情况下从培养基中将其分离出来，或者可以从微生物细胞中分离出来，并且如果想要一种特定的类胡萝卜素在需要时也可将其与其它的类胡萝卜素分开，分离方法是本领域所公知的[例如，Carotenoids VolIAIsolation and Analysis，Britton等，BirkhuserVerlag，Basel(1995)]。
根据本发明生产的类胡萝卜素可用于加工生产食品或饲料。本领域普通技术人员对此类方法都很熟悉。某些复合食品或饲料还可包括一些一般用于某种目的且为本领域所公知的添加剂或成分。
下述实施例进一步举例说明本发明，但并不因此而限定了本发明的范围。
实施例所用的角鲨烯合酶抑制剂是[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺，属于苯氧丙胺型抑制剂系列中的一种。该化合物的合成是根据Brown等(supra)公开的方法将联苯-4-酚(产品代码H7751，Sigma，USA)与烯丙基溴和碳酸钾在丁烷-2-酮中通过热重排反应来生产3-烯丙基-联苯-4-酚。3-烯丙基-联苯-4-醇与1，3-二溴丙烷和碳酸钾在丁烷-2-酮中进行反应，随后与异丙胺在2-丙醇中反应得到[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺。
实施例1加入角鲨烯合酶抑制剂对法夫红酵母细胞生长的影响将法夫红酵母ATCC96594接种到YPD培养基上(DIFCO，Detroit，U.S.A.，在试管中有10mL)，在20℃下摇动试管培养2天。将0.5mL的培养物接种到新鲜的YPD培养基上(在试管中有10mL)，培养基含有30g/L的葡萄糖和各自0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μg/mL的[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺，在20℃下摇动试管培养5天。
不时地通过取回等量样品的培养物，通过使用UV-1200光度计(ShimadzuCorp.，Kyoto，Japan)测量660nm下的光密度，来分析细胞生长。结果见表1。
当角鲨烯合酶抑制剂的浓度不高于2.0μg/mL时细胞生长不受影响。在第2天抑制剂5.0μg/mL条件下观察到细胞生长约23％受到抑制。
实施例2加入角鲨烯抑制剂对法夫红酵母生产虾青素的影响如实施例1在YPD培养基中培养法夫红酵母ATCC96594，20℃下摇瓶培养2天。将2.5mL的培养物接种到新鲜的YPD培养基上(在烧瓶中有50mL)，培养基含有22g/L的葡萄糖和各自0、0.5、1.0、2.0和5.0μg/mL的[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺，在20℃下摇瓶培养7天。培养的第2天，在培养基中加入50g/L的葡萄糖。也试验了在培养的中期加入抑制剂。培养的第4天和第7天取回等量样品的培养物，测定在660nm下的光密度(按照和实施例1所述的相同方法)和培养物中虾青素的含量。
为了分析虾青素的含量，将取回的培养液和溶剂混合物(乙醇、己烷和乙酸乙酯)混合，通过用玻璃珠剧烈摇瓶以从法夫红酵母中提取类胡萝卜素。提取后，破裂的细胞和玻璃珠经离心除去，所得上清液用HPLC分析虾青素含量。所用的HPLC条件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)温度室温洗脱液丙酮/己烷(18/82)加1ml/L的水到洗脱液上样量10μl流速2.0ml/minute检测UV在450nm下虾青素的对照品得自Hoffmann La-Roche(Basel，Switzer-land)。结果见表2。
*相对值计算以没有抑制剂时第7天的虾青素含量为100。
**培养开始时没有抑制剂，培养第2天加入5.0μg/mL的抑制剂。
在所有试验条件下虾青素的生产都有提高。当培养第2天加入抑制剂时所获得的结果最好，而对于生产虾青素来说在培养开始时加入抑制剂也同样有效。
权利要求
1.一种生产类胡萝卜素的生物学方法，其中包括有氧条件下在含水营养培养基中，在存在抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制剂下，培养一种能生产类胡萝卜素的微生物。
2.一种生产类胡萝卜素的生物学方法，其中包括在存在抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制剂前提下，培养一种Xanthophyllomyces(Phaffia)属的微生物生产类胡萝卜素，一种用于有氧条件下在含水营养培养基中生产类胡萝卜素的底物，以及从所述微生物的细胞或从培养基中分离出所得到的类胡萝卜素。
3.权利要求2的方法，其中的微生物是Xanthophyllomycesdendrorhous(法夫红酵母)ATCC96594。
4.权利要求1或2的方法，其中用于抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制剂选自角鲨烯合酶抑制剂类。
5.根据权利要求4的方法，其中的角鲨烯合酶抑制剂选自铵离子基的角鲨烯合酶抑制剂类。
6.根据权利要求5的方法，其中铵离子基的角鲨烯合酶抑制剂选自苯氧丙胺型角鲨烯合酶抑制剂类。
7.根据权利要求6的方法，其中苯氧丙胺型角鲨烯合酶抑制剂选自[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-甲基-N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-环戊基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-环丁基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(2-烯丙基-4-丁酰胺基苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-氯-苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-丙基苯氧基)丙胺，和N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)-1-甲基丙胺，和其生物学上可接受的盐。
8.根据权利要求7的方法，其中苯氧丙胺型角鲨烯合酶抑制剂是[3-(3-烯丙基-联苯-4-基氧基)-丙基]-异丙基-胺，或其生物学上可接受的盐，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺或N-甲基-N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺。
9.根据权利要求1或2的方法，其中所述抑制剂的浓度范围使得在类胡萝卜素生产条件下细胞生长的减少小于50％。
10.根据权利要求9的方法，其中所述抑制剂的浓度范围使得在类胡萝卜素生产条件下细胞生长的减少小于30％。
11.根据权利要求1或2的方法，其中进行培养时pH值的范围在4到8之间，且温度范围在15到26℃之间，培养时间24到500小时。
12.根据权利要求11的方法，其中进行培养时pH值的范围在5到7之间，且温度范围在18到22℃之间，培养时间48到350小时。
全文摘要
本发明涉及一种利用微生物生产类胡萝卜素的生物学方法，所用微生物为Xanthophyllomyces(Phaffia)属微生物，能在抑制剂抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生产类胡萝卜素。
文档编号C12R1/645GK1662658SQ03813933
公开日2005年8月31日 申请日期2003年4月10日 优先权日2002年6月21日
发明者星野达雄, 益田节子, 濑户口丰 申请人:Dsm Ip资产公司