专利名称：天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶m型测定方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及天冬氨酸基转移酶线粒体同工酶m型(ASTm)测定方法。
背景技术：
血清天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminosferase，AST)或称谷草转氨酶(GOT)有二种同工酶，一种是ASTs型，主要来源于细胞浆。一种是ASTm型，存在于细胞线粒体内。这二种同工酶广泛存在于心、肝、骨骼肌、肾等脏器组织中，尤以心脏和肝组织中含量最高达60-80％，这些脏器损伤可使血清中同工酶增高。损伤的程度不同，二种同工酶在血清中的比例亦不同。
当肝脏或心脏等脏器受到损害时，现在临床检验测定血清中AST的总活性(包括有ASTs型和ASTm型)升高，ASTs型存在于细胞浆中，主要是炎症使细胞通透性改变而释放进入血液系统，是一反映炎症的指标，在这种情况下细胞并没有坏死。而ASTm型一般要在细胞坏死，胞质内线粒体破坏后，才释放入血。因此，ASTm型值反映细胞的坏死程度，其ASTm活性与坏死灶的大小有关。二种同工酶在血清中半衰期亦不同，ASTm型在血中消除率比ASTs型快5倍以上。当细胞不再破坏和修复时，血中ASTm值很快降至正常水平。因此，ASTm又是预后评价的指标。
临床上若测定AST的总活性，包含有ASTs和ASTm二种类型。分不出患者是炎症性改变，还是细胞坏死。如心肌梗塞要诊断心肌细胞坏死程度、坏死病灶多少，判断治疗和预后。总活性升高包含70％的炎症性的ASTs无法判断或错误判断。
临床上心肌梗塞疾病的检测，主要测定CKMB肌红蛋白和肌钙蛋白I或肌钙蛋白T活性升高，可在短时间内判断心肌梗塞，但过了24小时诊断价值不高。而ASTm测定，主要测其细胞坏死程度。损伤愈严重，血清中ASTm值愈高。如损伤不继续加重，因ASTm在血清中半衰期非常短，迅速降至正常值，预后良好。用溶栓治疗和其它药物治疗后，如细胞坏死程度减少，ASTm活性下降则说明预后良好。
急性心肌梗塞后，ASTm在血清中升高的出现较肌酸激酶、肌红蛋白晚。心肌缺氧阶段，细胞膜的通透性发生改变，ASTs首先释放入血清，当ASTm在血中出现则表明心肌细胞坏死。通过对ASTm的动态观察可判定心肌梗塞的治疗效果和预后情况。
成人和小儿心肌类的鉴别诊断，主要测定ASTm活性改变，炎症时AST总活性升高，而ASTm不升高(细胞没有坏死)。
近年来，临床上已充分认识到ASTm的测定对肝病及急性心肌梗塞的诊断和预后判断具有重要意义，对ASTm的测定方法目前常用的有(1)电泳法，该方法较简单，但只能定性和半定量，且灵敏度低；(2)离子交换柱层析法，该方法耗时又费力，且洗脱ASTm时还可能将与ASTs相结合的某种血清巨分子一起洗下，造成误差；(3)免疫沉淀法，该方法较上二种方法来得简便、精确，但必须在专用的实验室中进行，无法实现临床上的快速及时检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于采用免疫抑制法，提供一种快速准确检测ASTm型的方法，作为临床判断心肌或肝细胞损害程度及疗效评估、预后判断的参考依据。
本发明公开的采用免疫抑制法测定ASTm的方法采用的试剂包括试剂I含pH8.0±0.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、天冬氨酸钾、乳酸脱氢酶、羊抗人ASTs抗血清、α-酮戊二酸钠；和试剂II含pH8.0±0.2三羟甲基氨基甲烷缓冲液、α-酮戊二酸钠、还原型辅酶I。
本发明ASTm测定方法具体包括在待测血液试样中加入试剂I，使试剂I中的羊抗人ASTs抗体与血清中ASTs特异性结合，抑制ASTs为无活性，血清中剩余的是ASTm，采用酶动力学方法测定ASTm型活性(U/L)，诊断心肌梗塞和肝脏疾病中细胞坏死量多少，作为判断和预测预后的评价指标。
本发明ASTm测定方法基本测定参数为取试剂I，加入质控样品中，置37℃水浴5分钟后加入试剂II，置37℃水浴1分钟后，在分光光度计上，用波长340nm测定3分钟吸光度变化值，除以3，计算平均每分钟的吸光度变化值ΔA/min，按ASTm(U/L)＝ΔA/min×F计算结果，其中F为常数-3225。
本发明试剂I中所述的羊抗人ASTs抗体由下述方法制得人心脏死后24小时内取出，分成100g左右，保存-80℃条件保存待用。
1、粗提取待冻原料，加入含有磷酸吡哆醛蛋白稳定剂的缓冲液，用细胞粉碎机破坏细胞制成匀浆，低温超速离心，取上清液加热至50℃-55℃，再低温超速离心除去变性杂蛋白，经50％和33％二次饱和硫酸铵沉淀得到粗提物匀浆，匀浆用蒸馏水溶介透析、浓缩(在4℃条件下操作)。
2、层析分离将粗浓缩液上亲和层析柱和离子交换柱，收取ASTs洗脱液，待到纯化的ASTs抗原。然后测定纯化品的纯度(鉴定用醋酸纤维素薄膜电泳分离，电泳位置在α2球蛋白位)，酶活力测定(用临床生物，IFCC推荐的生化方法测定AST活性)。
3、免疫动物取健康、雄性约50kg重成年锦羊，进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福代佐剂混匀，注射锦羊颈淋巴和肌肉组织，每2周一次，共免疫4次-5次，抗原量根据动物体重增减。免疫最后一次的二周后采血。血清经过纯化(用50％硫酸铵饱和液处理)，得到羊抗人ASTs抗血清，测定效价，备用。
本发明羊抗人ASTs抗体对ASTs的抑制率≥75％，对血清或血浆(无溶血)样本均适用。
为评价本发明天冬氨酸氨基转移酶同工酶(ASTs)抗体对血清ASTs活性的抑制能力，特进行了相关的抑制能力评估试验一、抗体对ASTs活性的抑制能力取从人肝脏细胞胞浆中提纯的ASTs加至低活性的血清标本中，用不同量的ASTs抗体分别抑制该ASTs标本，观察ASTs抗体浓度对抑制率的影响。步骤及结果见表1。
表1 抗体对ASTs的抑制能力抗体含量(μl) 0 5 1015 20 25 30 35ASIs标本(μl) 35 35 3535 35 35 35 3537℃5min剩余AST活性(U/L) 346 84.2 42.6 43.4 43.3 42.9 45.1 44.1抑制率(％) 75.7 87.7 87.5 87.5 87.6 87.0 87.3结果分析5μl抗体量尚不足以达到其应有的抑制能力，10μl以后抑制率趋于稳定，可以这样认为，该ASTs抗体能抑制ASTs中约88％的活性。
二、抗体对血清中ASTs的抑制能力取一高AST活性血清，分别用不同量的ASTs抗体抑制血清标本，观察ASTs抗体浓度对抑制率的影响。步骤及结果见表2。
表2 抗体对血清中ASTs的抑制能力抗体含量(μl) 0 5 1015 20 25 30 35血清标本(μl) 35 35 3535 35 35 35 3537℃5min剩余AST活性(U/L) 883 384241 237 228 230 231 227抑制率(％) 56.5 72.7 73.274.274.073.874.3结果分析该血清样品中含有ASTm。在本实验条件下，用该ASTs抗体10μl以上能抑制大部份ASTs，且对AST总活性达900U/L、ASTs达800U/L左右的血清标本也有抑制能力。
三、抗体对ASTm的交叉抑制用醋酸纤维素薄膜电泳分离观察血清样品AST同工酶分布情况。取三份AST活性分别为883，563，241U/L的血清，分别用10μl抗体抑制后进行电泳分析，观察抑制前后AST同工酶图谱的变化。
结果分析三份血清AST同工酶电泳均可见ASTs和ASTm区带，且染色深浅与总活性呈正相关，ASTs区带染色较深，ASTm区带染色较浅。经抑制后，电泳也可见ASTs抗体对ASTm区带，ASTm区带染色程度与未经抑制的相似，ASTs区带染色变浅。结果表明，该ASTs抗体对ASTm基本无交叉抑制，能抑制大部分的ASTs活性。
结论该ASTs抗体与血清样品比值在1∶3.5～1∶1之间，37℃5min，能抑制约88％的ASTs，对ASTm基本无交叉抑制。
使用本发明试剂组成的检测试剂盒在体外对人体血清或血浆中的ASTm进行测定，经联机分析，五分钟左右即可获得测定结果，实现了ASTm的及时检测。
图1实施例3血清稀释试验ASTm线性曲线图2实施例3反应进程曲线
具体实施例方式实施例1 ASTm检测试剂盒1、试剂试剂I三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH8.0±0.21.2g天冬氨酸钾 2.72mg乳酸脱氢酶 0.32mg苹果酸脱氢酶0.12mg羊抗人AST抗血清 0.96mlα-酮戊二酸钠 0.24g纯水80ml试剂II三羟甲基甲烷缓冲液pH8.0±0.20.0784gα-酮戊二酸钠 0.06g
还原型辅酶I0.0224g纯水 20ml2、仪器日立7150(7170)型全自动生化分析仪。
3、分析方法免疫抑制法和酶动力学法。
4、标本要求血清或血浆(无溶血)，采血后尽快测定。
5、技术要求使用条件使用温度37℃；使用波长340nm5.1羊抗休ASTs血清性能指标ASTs抗体对ASTs的抑制率≥75％5.2试剂空白吸光度值1.00A≤试剂I+试剂II≤1.600A(340nm，比色皿光径1cm)5.3测定范围5U/L-130U/L相关系数γ≥0.9955.4灵敏度5±2(U/L)5.5稳定性在35℃储存24h空白吸光度值应≥1.30A，48h≥1.20A，72h时≥1.00A(340nm，比色皿光径1cm)。
5.6重复性CV≤5％(水平115U/L，水平2130U/L，n＝20)。
5.7试剂外观应为无色澄清液体。
6、试验方法6.1羊抗人ASTs抗血清性能试验6.1.1取一定量的ASTs抗体加入已知高AST活性的血清中，37℃温育5min后测定剩余的ASTm活性计算对ASTs的抑制率，其结果应符合5.1要求。
6.2试剂空白吸光度值试验取试剂I 1.6ml，加入纯水0.12ml，置37℃水浴5分钟后加入试剂II0.4ml，置37℃水浴1分钟后，在722分光光度计上，用340nm波长测定吸光度值，应符合5.2要求。
6.3测量范围试验取5U/L、15U/L、30U/L、65U/L、130U/L五种浓度质控样品按下述方法重复进行三次测定，取均值。
取试剂I1.6ml试剂，加入质控样品0.2ml，置37℃水浴5分钟后加入试剂II0.4ml，置37℃水浴1分钟后，在722分光光度计上，用波长340mm波长测定3分钟吸光度变化值，除以3，即用ΔA/min计算结果，应符合5.3要求，即在5-130U/L内呈线性。
6.4灵敏度试验取试剂I1.6ml，加入5U/L质控样品0.12ml，置37℃水浴5分钟后加入试剂II0.4ml，置37℃水浴1分钟后，在722分光光度计上，用波长340nm波长测定3分钟吸光度变化值，除以3，所得结果应符合5.4要求。
6.5稳定性将试剂盒放在35℃储存24、48、72小时后，按6.2所述方法测定空白吸光度值，应符合5.5要求。
6.6重复性试验用15U/L和130U/L两个质控品进行试验。
按5.4所述方法分别对15U/L和130U/L两个质控品进行20次重重测定，求出每分钟吸光度变化均值X和标准差S，按下式计算CV值，应符合5.6要求CV=SX‾×100%]]>实施例2、使用仪器HITACHI 7060C；温度37℃；波长340nm(主波长)，405nm(副波长)；样品量20μl，缓冲液试剂I(同实施例1)240μl混匀，37℃孵育五分钟，然后加入酶液试剂II(同实施例1)60μl混匀，37℃孵育一分钟后，测A1＝1.3285，37℃孵育三分钟后，测A2＝1.3111，计算平均每分钟的吸光度变化值(ΔA/分)＝(A2-A1)/3＝(1.3111-1.3285)/3＝-0.0058，计算结果m-AST(U/L)＝ΔA/min×F，F＝-3225，ΔA/min＝-0.0058m-AST(U/L)＝-0.0058×(-3225)＝19(U/L)。
实施例3 本发明ASTm检测方法线性、反应进程、精度、回收率和干扰性试验一、血清稀释试验取一血清AST-m为190U/L的标本，分别作1/5、2/5、3/5、4/5原倍稀释，分别测得AST-m值为42.4U/L、81.1U/L、121.2U/L、151U/L和189.4U/L，见图1。
由图可见，AST-m至少在120U/L以下线性很好，120U/L以上略呈偏低趋势。
二、反应进程曲线图2所示为反应进程曲线。由图2可见反应进程线性佳，说明本测定方法稳定可信。
三、批内精度分别取低、中、高、三个血清样本，由于实际上用作试验的三个血清样本的量差异较大，故低、中、高各个样本的重复次数无法一致，其实际重复次数分别为18、13和9次，结果见表1。
表1批内精度试验
四、批间精度分别取低、中、高三个样本，每日测定一次，共测定七天，结果见表2。由表2可见同一样本7天内测定结果稳定，低、中、高三个样本的批间CV值分别在7.4％、2.84％、和0.9％，即使是低值，测定最高值和高低值之差也不过2U，高值也只是4U，这在临床应用上不会干扰诊断。
表2 批间精度测定日期低值中值高值第1天 9.2 42.8133.7第2天 9.8 43.1130.1第3天 8.3 40.4132.0第4天 10 42.5132.2第5天 10 43.4133第6天 9.9 44.3134第7天 10.543.4132X 9.7 42.8132.4SD 0.711.221.31CV 7.4％ 2.84％ 0.98％五、回收实验向一份血清标本加不同量的标准液，得出回收率为94.5％～103.7％，平均99.0％。
六、干扰试验经试验4g/L的血红蛋白，50μmol/L的胆红素，5.5μmol/L的甘油三酯和6g/L抗坏血酸对m-AST的活性测定不产生干扰作用，说明此法的抗干扰能力较强。
七、参考值本发明测定了健康人200例，其参考范围如下6.2～17.5U/L，如X±3SD则可认定20U/L为参考上限(在200例测定值中最高的一例为20.5U/L，最低的为6.8U/L)。
权利要求
1.天冬氨酸基转移酶线粒体同工酶m型测定方法，其特征在于该方法为免疫抑制法，通过采用羊抗人ASTs抗体与血清中ASTs特异性结合，抑制ASTs为无活性，然后采用酶动力学方法测定血清中剩余的ASTm活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法具体步骤包括取试剂I，加入质控样品中，置37℃水浴5分钟后加入试剂II，置37℃水浴1分钟后，在分光光度计上，用波长340nm测定3分钟吸光度变化值，除以3，计算平均每分钟的吸光度变化值ΔA/min，按ASTm(U/L)＝ΔA/min×F计算结果，其中F为常数-3225；试剂I含pH8.0±0.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、天冬氨酸钾、乳酸脱氢酶、羊抗人ASTs抗血清、α-酮戊二酸钠；试剂II含pH8.0±0.2三羟甲基氨基甲烷缓冲液、α-酮戊二酸钠、还原型辅酶I。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于试剂I中所述的羊抗人ASTs抗体由下述方法制得人心脏死后24小时内取出，分成100g左右，保存-80℃条件保存待用；1)粗提取待冻原料，加入含有磷酸吡哆醛蛋白稳定剂的缓冲液，用细胞粉碎机破坏细胞制成匀浆，低温超速离心，取上清液加热至50℃-55℃，再低温超速离心除去变性杂蛋白，经50％和33％二次饱和硫酸铵沉淀得到粗提物匀浆，匀浆用蒸馏水溶介透析、浓缩，在4℃条件下操作；2)层析分离将粗浓缩液上亲和层析柱和离子交换柱，收取ASTs洗脱液，待到纯化的ASTs抗原。然后测定纯化品的纯度一鉴定用醋酸纤维素薄膜电泳分离，电泳位置在α2球蛋白位，酶活力测定，用临床生物，IFCC推荐的生化方法测定AST活性；3)免疫动物取健康、雄性约50kg重成年锦羊，进行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福代佐剂混匀，注射锦羊颈淋巴和肌肉组织，每2周一次，共免疫4次-5次，抗原量根据动物体重增减，免疫最后一次的二周后采血，血清经过50％硫酸铵饷和液处理纯化，得到羊抗人ASTs抗血清，测定效价，备用。
全文摘要
本发明涉及天冬氨酸基转移酶线粒体同工酶m型、(ASTm)测定方法。该方法采用免疫抑制法通过羊抗人ASTs抗体与血清中ASTs特异性结合，抑制ASTs为无活性，血清中剩余的是ASTm，再采用酶动力学方法测定ASTm型活性(U/L)，诊断心肌梗塞和肝脏疾病中细胞坏死量多少，作为判断和预测预后的评价指标。
文档编号C12Q1/25GK1546683SQ20031010942
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月15日 优先权日2003年12月15日
发明者刘中令, 刘颖冰 申请人:上海北加生化试剂有限公司