专利名称：日本血吸虫的特异性抗原及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和寄生虫学。更具体地，本发明涉及日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的特异性抗原、其制备方法和用途。
背景技术：
日本血吸虫(Schistosoma japonicum)是一种严重威胁人类健康的寄生虫。
血吸虫病免疫学诊断方法的灵敏度与特异性，除与选择实验的方法的不同有关外，主要与所用诊断抗原的特性有关。目前常用粗制的成虫与虫卵抗原用于血吸虫病诊断的敏感性虽较高，但由于其常混有宿主抗原及含有其它寄生虫如肝吸虫、肺吸虫的共有抗原成分，易产生交叉反应，特异性较低。
此外由于传统抗原多为虫源性，来源较少，耗资大，难以适应大规模查病的需要。随着分子生物学技术的发展，用基因重组方法生产合成抗原用于诊断寄生虫病已成为可能，国内外也有研究证实，使用血吸虫特异性的、纯化的天然或重组的抗原不仅可以提高血吸虫病诊断的敏感性和特异性，而且检测抗某些特异抗原的短程抗体具有一定的疗效考核价值1983年Cordingley等以PJSC73为载体，成功的从曼氏血吸虫虫卵中克隆出了一个40kDa可与抗SEA兔血清发生强烈反应的多肽。从此，各国研究者对血吸虫重组抗原进行了广泛的研究。
免疫素(Immunophilin)是免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)的受体，属FK506结合蛋白(FKBP)超家族，与热休克结合免疫素p59等结构相似。其具有肽基脯氨酸顺反异构酶(PPIase)活性，是蛋白折叠中重要的伴侣分子，并可与多种胞内受体蛋白结合。存在于血吸虫体内的免疫素可与人体内FKBP12相互作用，在血吸虫感染中起重要作用。
1995年Osman从曼氏血吸虫尾蚴cDNA文库中筛选出一与免疫素基因同源的1.4kb的基因(Smp50基因)，并在大肠杆菌中进行了表达。表达的重组蛋白分子量为50kDa，可为曼氏血吸虫成虫抗原免疫的多克隆兔血清识别[Osman A，Kiang D，Lo Verde PT，et al.Schistosoma mansonicharacterization ofp50，an immunophilin.Exp Parasitol 1995；80(3)550-559]。
1992年Moser在体外重组表达了曼氏血吸虫虫卵中的一种钙结合蛋白Sm16，该蛋白可为免疫兔血清识别，被认为是一种具潜力的诊断抗原[Moser D，Doenhoff MJ，Klinkert MQ.A stage-specific calcium-binding proteinexpressed in eggs of Schistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol1992；51(2)229-238]。其后Rao的研究发现Sm16具有抗感染的作用，是一种兔疫调节蛋白在血吸虫的免疫逃避中起着重要作用，重组表达的Sm16具有强烈的免疫活性可为多克隆的免疫兔血清所识别[Rao KV，Ramaswamy K.Cloning andexpression of a gene encoding Sm16，an anti-inflammatory protein fromSchistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol 2000；108(1)101-108]。
然而，迄今为止还没有公开过日本血吸虫的特异性抗原蛋白。因此，本领域迫切需要开发日本血吸虫的特异性抗原。
发明内容
本发明的目的就是提供一种日本血吸虫的特异性抗原蛋白。
本发明的另一目的是提供所述日本血吸虫特异性抗原蛋白的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的sj16蛋白，它是日本血吸虫特异性抗原，且选自下组(a)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有针对日本血吸虫的免疫原性的蛋白。
在另一优选例中，所述的蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它编码本发明所述的sj16蛋白。
较佳地，所述的多核苷酸，它选自下组(a)SEQ ID NO1中1-438位的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO1中第1-435位的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体和含有所述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种日本血吸虫免疫原性蛋白的制备方法，该方法包含
(a)在表达条件下，培养本发明上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
在本发明的第五方面，还提供了一种能与本发明所述的sj16蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种检测样品中是否存在抗日本血吸虫抗体的方法，包括将样品与上述的与sj16蛋白特异性结合的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在抗日本血吸虫抗体。
在本发明的第七方面，提供了一种检测日本血吸虫抗体的试剂盒，它含有本发明所述的sj16蛋白和说明书。较佳地，该试剂盒还含有本发明所述的sj50蛋白。更佳地，该试剂盒还含有阳性对照和阴性对照。
在本发明的第八方面，提供了一种组合物，它含有本发明的sj16蛋白或其免疫原性片段和衍生物和药学上可接受的载体的。较佳地，该组合物还含有本发明所述的sj50蛋白或其免疫原性片段和衍生物。本发明的组合物可作为疫苗用于预防日本血吸虫。
图1是日本血吸虫Sj50和Sj16基因的PCR扩增电泳图(1％琼脂糖凝胶电泳)。各泳道是M，PCR参照分子量；1，Sj16基因扩增产物；2，Sj50扩增产物。
图2是重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16的PCR鉴定图(1％琼脂糖凝胶电泳)。各泳道是M，PCR参照分子量；1，pGEX4T-1-Sj50 PCR产物，质粒为模板；2，pGEX4T-1-Sj16 PCR产物，质粒为模板；3，pGEX4T-1-Sj50 PCR产物，扩增细菌为模板。4，pGEX4T-1-Sj16 PCR产物，扩增细菌为模板。
图3是重组质粒限制性内切酶分析图1％琼脂糖凝胶电泳)。各泳道是M，PCR参照分子量；F，经EcoR I和Xho I酶切的pGEX4T-1-Sj50；S，经EcoR I和Xho I酶切后的pGEX4T-1-Sj16。
图4是重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16在大肠杆菌BL21中表达产物的12％SDS-PAGE分析图。各泳道是M，标准分子量蛋白；1，诱导表达后的pGEX4T-1-Sj50；2，诱导表达前的pGEX4T-1-Sj50；3，诱导表达后的pGEX4T-1-Sj16；4，诱导表达前的pGEX4T-1-Sj16；5，诱导后的PGEX4T-1。
图5是GST-Sj50融合蛋白和GST-Sj16融合蛋白，经凝血酶(凝血酶)切后12％SDS-PAGE分析。各泳道是M，标准分子量蛋白；1，GST-Sj50融合蛋白；2，酶切不完全GST-Sj50融合蛋白；3，酶切后的GST-Sj50融合蛋白；4，GST-Sj16融合蛋白；5，酶切不完全GST-Sj16融合蛋白；3，酶切后的GST-Sj16融合蛋白。
图6显示了日本血吸虫感染兔血清中抗Sj50和抗Sj16抗体检测结果。
图7显示了日本血吸虫感染兔血清中抗Sj50抗体检测结果。治疗组兔于感染后10周接受吡喹酮治疗。
图8显示了日本血吸虫感染兔血清中抗Sj16抗体检测结果。治疗组兔于感染后10周接受吡喹酮治疗。
图9显示了正常人及急慢性日本血吸虫病人血清中抗Sj50抗体和抗Sj16抗体检测结果。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，不仅首次分离出了日本血吸虫免疫素蛋白Sj50和钙结合蛋白Sj16，还重组表达了日本血吸虫免疫素蛋白Sj50和钙结合蛋白Sj16并将其用于血吸虫抗体的检测。在此基础上完成了本发明。
本发明人根据血吸虫免疫素编码基因序列，设计了一对寡核甘酸引物，以日本血吸虫成虫cDNA为模板，体外扩增了日本血吸虫免疫素(Sj50)编码基因，重组入质粒PGEX-4T-1后，在大肠杆菌内表达并纯化获一50kDa的蛋白质Sj50。以Sj50作为诊断抗原用于血吸虫抗体的ELISA检测，在动物实验中检测特异性和敏感性分别为94.12％和76.67％，并且感染兔血清中抗Sj50抗体水平可反映兔感染和治疗状况。用于血吸虫病人血清中的抗体检测时，sj50检测的特异性为98.3％，急性病人和慢性病人检测的敏感性分别为95.2％和63.2％，并可用于区分急慢性感染。
此外，本发明人还分离和重组表达了钙结合蛋白Sj16，并将其用于日本血吸虫病的诊断，在感染动物血清与人血清检测中都获得了较为理想的结果。
如本文使用，术语“本发明蛋白”或“本发明多肽”指日本血吸虫免疫素蛋白Sj50和钙结合蛋白Sj16。
本发明除了包括SEQ ID NO2和4所示的日本血吸虫特异性抗原蛋白之外，还包括具有与所述的抗原蛋白有相同的抗日本血吸虫的免疫原性、SEQ ID NO.2或4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能或免疫原性。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的免疫原性。该术语还包括SEQ ID NO2和4蛋白的活性片段和活性衍生物。
此外，在本发明中，还包括了SEQ ID NO2或4的免疫蛋白的保守性变异多肽”，即与SEQ ID NO2或4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
以Sj16为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。对于sj16而言，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区(1-435位)序列有差别的核酸序列。
以Sj50为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。对于sj50而言，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO4的蛋白质，但与SEQ ID NO3所示的编码区(12-1286位)序列有差别的核酸序列。
本发明的日本血吸虫特异性抗原蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明蛋白。一般来说有以下步骤(1).用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对日本血吸虫sj16和sj50蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明还提供了检测样品中是否存在抗日本血吸虫抗体的方法。用重组抗原检测抗体时，如果重组抗原中含有载体蛋白，载体蛋白可能会抑制抗原表位，也可能引起交叉反应。本发明中所用的原核表达质粒为pGEX4T-1(购自Pharmacia公司)，该质粒在SD序列下游是GST基因，而克隆的外源基因则与GST基因相连。当进行基因表达时，表达产物为GST和目的基因产物的融合体。高效表达的产物经Glutathione Sepharose 4B纯化，凝血酶切后可去除GST获所需的蛋白。本发明所用的Sj50与Sj16即为去除了GST载体的纯化蛋白，用于血吸虫抗体检测可提高检测的敏感性与特异性。
通过基因工程方法制备抗原，所获抗原纯度高，可以大量生产。不仅可以解决大量诊断抗原的来源，而且利于检测方法的标准化。本发明为日本血吸虫病的诊断提供了二种诊断抗原Sj50和Sj16，特别是Sj50因其有区分急慢性感染的可能，在日本血吸虫病的诊断具有很广阔的前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例材料质粒PGEX4T-1(购自Pharmacia公司)。
Taq DNA聚合酶(申友公司)、Pfu DNA多聚酶(BBST公司)、dNTP Mix(Sangon公司)、10×Pfu buffer(BBST公司)限制性内切酶EcoR I和Xho I、EcoR I buffer、BSAT4 DNA连接酶(Promega)、2×连接缓冲液(Promega)、10×连接缓冲液(Promega)100bp DNA Ladder(Gene RulerTM)GST-5’引物、GST-3’引物(申友公司)QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN)Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System(V10GENE)辣根过氧物酶标记的羊抗兔IgG结合物、辣根过氧物酶标记的羊抗人IgG结合物(Sigma)。
96孔酶标板(Nunc公司)实施例1
制备各种血清1.1 日本血吸虫感染兔血清建立日本血吸虫感染动物模型。新西兰白色种兔30只，分笼饲养，分别经腹壁接种日本血吸虫尾蚴100条。感染后10周，随机抽取10只兔子以吡喹酮200mg/kg胃饲进行药物治疗。隔周自兔耳静脉取血1-2ml，12小时内分离血清，-20℃冻存。
1.2 正常人及血吸虫病人唾液及血清病人血清标本来自中国预防医学科学院寄生虫病研究所，中国血吸虫病参考血清库，其中急性病人血清62份，慢性病人血清57份。正常人血清及唾液标本取自第二医科大学在校学生，共计57份。
实施例2Sj50基因与Sj16基因的获得2.1 引物的设计和合成根据Sj50基因与Sj16基因序列，经Primerexpress软件分析设计引物，由上海申友生物生物工程公司合成二对引物。
Sj50-F为5’CCGGAATTCATGTCGGAGACGCCAAAGC3’(SEQ ID NO5)，引入EcoR I酶切位点GAATTC；Sj50-R为5’CCGCTCGAGCAGAATTAAGCTCTCACAGGGCA3’(SEQ ID NO6)；引入Xho I酶切位点CTCGAG；引物Sj16-F为5’CCGGAATTCCTTCATCTCAGAATAATGTCGGA3’(SEQ ID NO7)，引入EcoR I酶切位点GAATTC；Sj16-R为5’CCGCTCGAGCATACGTTTGACGTACATAAGCT’3’(SEQ ID NO8)，引入Xho I酶切位点CTCGAG。
引物贮存浓度50mM、工作浓度为10mM。
2.2.Sj50基因、Sj16基因的PCR扩增以用常规方法制备的日本血吸虫成虫及虫卵cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系共计50μl，其中模板1.5μl、5’引物2μl、3’引物2μl、dNTP 2.5μl、10×Pfu缓冲液5μl、Pfu DNA多聚酶0.5μl、去离子水36.5μl。反应条件为预变性95℃ 5min；变性94℃ 1min；退火56℃ 1min；复性72℃ 2min；循环30次，最后一个循环复性再延长8min后，样后存于4℃。PCR产物用QIAquickPCR Purification kit回收纯化。
结果1％琼脂糖凝胶电泳显示有Sj50基因PCR扩增产物有一条条带大小约1.1Kb与预计相同。Sj16基因PCR扩增产物有一条清晰的条带大小约440bp与理论扩增大小相符(图1)。
对PCR产物进行测序，结果表明，Sj16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，ORF位于1-435位，编码一个全长为145aa的蛋白(SEQ ID NO2)。Sj50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3，其ORF位于12-1286位，编码一个全长为425aa的蛋白(SEQ ID NO4)。
MSDENRWIAV FNSLDKDGNK LLTRDEIEQC LKSLGVSESF AEKIIKETDL 50NKDGKISLDE YLKALRKIPP RDKCSSVERW KEVFQSIDKD NSGKVSAKEL 100DEFLKSTGND INKSCLENWM ATNDKNKDGE LDYAEFLAYV RQTYE 145(SEQ ID NO2)MSETPKQSEE EYLKDFIDLS PSGDRGILKK VVREGYSDIK PCDGDTVIVH 50YVGTNFGGEK HGEVFDSSRA RNEKFEFTIG KGSVIKAWDI GVATMRLGEV 100CELIASPEYA YMDGKSLKFE VELFETMGSD VSRNKDGSIR KSIIKKGRDI 150HNPVAGAEAT IVFRNLLNLT EETEVTYCVG DPPSNVPDEL DQSVRHMNTG 200EVSRIVVYKD GHSLTSGDSD KDRIVYELTL KSFEKTKHLS GITSFPERIA 250YANTLKEKAN NFLKDSKFDS AIELYKRLDD ELQYVVANGP TRQRNCLGFT 300VAVQLNLALV YLKLCKPRQC IEFCKKVLDN FSDNEKALFR IGQAHLLRKD 350HEEAVVYFKG LYPKILTMHL LYNRFKSVRK RLEEPKDIER KKFRHIFERC 400KDTGIKLDAQ NHEDGVVVND EKSAL425(SEQ ID NO4)2.3 表达载体的构建回收纯化的Sj50基因、Sj16基因和质粒pGEX4T-1分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I进行酶切。10μl模板加EcoR I 1μl、Xho I 1μl、EcoR I buffer1.5μl、BSA 0.5μl和去离子水1μl，共计15μl于1.5ml Eppendorf管中37℃水浴过夜。
酶切后的Sj50基因、Sj16基因和质粒pGEX4T-1，用QIAquick PCRPurification kit回收纯化。纯化的目的基因片段和载体酶切片段，测定OD值，计算片段和载体片段浓度，目的片段和载体片段按3∶1摩尔比进行连接。连接体系中含T4 DNA连接酶1μl、10×连接缓冲液1μl、去离子水、pGEX4T-1(80ng)、Sj50基因(60ng)或Sj16基因(20ng)，共计10μl于1.5ml Eppendorf管中12℃-14℃连接过夜，构建成Sj50基因、Sj16基因表核表达重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16。
结果经限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后的Sj50基因、Sj16基因分别和质粒pGEX4T-1连接，构建成重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16，转化入大肠杆菌DH5α内扩增。以扩增细菌为模板，GST-5’、GST-3’为引物进行PCR扩增所获条带与目标条带大小一致(见图2)。
2.3 表达载体的鉴定通过电转将重组质粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。1μl连接产物转化50μl感受态细胞，电压2KV，电容25μF，电阻300Ω，转化时间5.43mS。转化后的菌体加入1ml LB培养液，37℃，250rpm振荡培养1hr后，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37℃培养过夜。
随机挑取上述平板上的菌落进行PCR鉴定。反应体系共计10μl，内含模板3μl、GST-5’引物0.25μl、GST-3’引物0.25μl、dNTP 0.4μl、10×Pfu buffer1μl、Tag DNA聚合酶0.1μl、去离子水5μl。反应条件为预变性94℃ 3min；变性94℃ 1min；退火56℃ 1min；复性72℃ 1.5min；循环30次，最后一个循环复性再延长8min后，样后存于4℃。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测。
随机挑取Sj50和Sj16阳性克隆分别加入含100μg/ml氨苄青霉素的2XYT液体培养基5ml，37℃ 300rpm扩增培养过夜。用Mini-MTM Plasmid DNAExtraction System抽提并纯化质粒。对所抽质粒进行EcoR I和Xho I酶切鉴定。
结果用Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System从大肠杆菌中抽提并纯化质粒。对所抽质粒进行EcoR I和Xho I酶切鉴定。结果显示有各有二条明显的条带(质粒与目的基因，见图3)。
实施例3Sj16和Sj50重组基因在大肠杆菌中的表达通过钙转法将以上抽提的pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16重组质粒转化入大肠杆菌BL21。内含50μl BL21钙转感受肽细胞的1.5ml Eppendorf管中加入重组质粒2μl，冰浴30min后，37℃热休克5min，立即冰浴2min。每管加入预温至37℃的LB培液，37℃ 300rpm培养1hr后，取100μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37℃培养过夜。
随机挑取Sj16和Sj50阳性克隆接种于3ml含100μg/ml苄青霉素的2XYT液体培养基，37℃摇至OD600＝0.6。取2ml加入IPTG至终浓度1mM，1ml不加诱导物作为对照，28℃ 250rpm，培养4hour。4℃ 4000g离心10min沉淀菌体。诱导管每管加入100μl PBS，对照管每管加入50μl PBS。每管取出15μl菌体加入3μl 6×SDS-PAGE样品缓冲液2μl作SDS-PAGE电泳，浓缩胶4％，分离胶12％。电泳条件浓缩胶80V，分离胶100V。电泳结束胶于考氏亮蓝R250染液中固定、染色，在乙醇-冰醋酸液中脱色。
结果pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16转化的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后，较诱导前各出现一分子量约为80kDa和40kDa的条带，即为Sj50基因产物与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合体、Sj16基因产物与GST的融合体(图4)。
实施例4GST-Sj50和GST-Sj16融合蛋白的大规模制备和纯化4.1 融合蛋白的大规模制备分别选取可表达融合蛋白GST-Sj50和GST-Sj16的细菌克隆接种于5ml含100μg/ml苄青霉素的2XYT液体培养基，37℃培养过夜。第2天分别将其接种到500ml含100μg/ml苄青霉素的2XYT液体培养基。37℃摇至OD600＝0.6后，每瓶加入IPTG至浓度为1mM，继续培养4hr，4℃ 8,000rpm离心10min收获细菌存于-20℃。
在收获的二种细菌沉淀中，分别加入20ml预冷的PBS、240μl 1M DTT、和480μl PMSF，超声裂解细菌(每次20sec，共计2min)。加入20％ TritonX-100至终浓度为1％，冰浴30min使溶合蛋白完全溶解。4℃以 13,000rpm离心30min，收集上清液。
在27ml的上清中加入1ml 50％ Glutathione Sepharose 4B凝胶浆，4℃颠倒混匀结合1hr。3000rpm，4℃离心10min去上清。在沉淀中加入5ml PBS，4℃离心10min去上清，收集沉淀，共重复3次。将收集的沉淀转移至凝胶柱中，待柱床稳定后，用大量的PBS洗脱未结合的杂蛋白。在1ml床体积胶中加入还原型谷胱苷肽溶液(10mM Glutathione，50mM Tris-HCl，pH 8.0)1ml，室温下颠倒混均10min，收集洗脱液即为纯化的融合蛋白。用PBS透析融蛋白，测定OD260、OD280值，计算蛋白浓度。
4.2 Sj16和Sj50蛋白的纯化按40μg蛋白加入0.2μl凝血酶的比例，分别在纯化的GST-Sj50和GST-Sj16融合蛋白中加入凝血酶，室温颠倒混均2hr。在凝血酶酶切后的蛋白液中加入1ml 50％Glutathione Sepharose 4B凝胶浆，4℃颠倒混匀结合1hr。3000rpm，4℃离心10min，收集上清液，即为纯化的Sj16和Sj50蛋白。测定OD260、OD280值，计算蛋白浓度。
结果表达的融合蛋白经亲和层析(glutathione sepharose 4B)后获得了较为纯的融合蛋白，再使凝血酶(thrombin)从表达的融合蛋白中切下了GST分子(26kDa)，分别获得了分子量约为40kDa与16kDa纯化的Sj50和Sj16分子(图5)。
实施例5酶联免疫吸附试验方法以0.5μg/ml 100μl Sj16和Sj50蛋白包被96孔酶标板，室温过液。稀释的0.3％ Tween-20-PBS(1∶10)洗涤后用0.3％ Tween-20-PBS每孔120μl 37℃封闭1hour。洗涤3次后加入1∶100稀释的人或兔血清样本100μl，37℃孵育1小时。洗涤后加入1∶2000稀释的羊抗人IgG过氧化物酶结合物或羊抗兔过氧化物酶结合物100μl每孔，37℃孵育1小时。洗涤后，每孔加入100μl底物OPD室温显色15分钟后，加2mol/L H2SO4终止反应。在自动酶标仪上以492nm波段读取OD值。判断标准每一受检标本的OD值等于或大于阴性对照OD值均值加2个标准差(x+2SD)定为阳性阈值。
5.1 血吸虫感染病兔血清中的特异性抗体的检测以纯化的Sj50和Sj16为诊断抗原，共有17只兔子感染前与感染后9-11周兔血清中的抗Sj50抗体和抗Sj16抗体被检测。
图6显示了血清中两抗体检测的结果。两者在感染前都有1只兔子呈阳性反应，检测的特异性为94.12％。在感染后9-11周，兔血清中的抗Sj50抗体和抗Sj16抗体较感染前都有显著升高(P＜0.05)，其中13只兔子体内抗Sj50抗体阳性，阳性率76.47％，15只兔子体内抗Sj16抗体阳性，阳性率88.23％(表1)。
表1 日本血吸虫感染兔血清中抗Sj50和抗Sj16抗体检测结果诊断 OD值(x±SD)阳性界值 阳性数P值样本数抗原感染前 感染后9-11周 (x+2*SD) 感染前 感染后9-11周 (配对t检验)Sj50 0.593±0.164 1.289±0.4680.921 17 1 13 9.163E-06Sj16 0.606±0.197 1.501±0.5241.000 17 1 15 6.855E-06图7显示了治疗组与未治疗组兔血清中抗Sj50抗体动态变化。治疗组兔血清中抗Sj50抗体水平在治疗后11周与治疗前相比显著性下降(p＝0.00080＜0.05)，与感染前抗体水平相比无显著性差异(p＝0.84466＞0.05)。同一时期，非治疗组兔体内的抗体仍维持在高水平与感染后11周无显著性差别(p＝0.70445＞0.05)。治疗组与非治疗组组间相比，在感染前与感染后9-11周两组兔血清中抗Sj50抗体水平都无显著性差异(感染前p＝0.15183＞0.05，感染后p＝0.32546＞0.05)而治疗后11周，治疗组兔体内抗体水平远低于同一时期未治疗组(p＝0.00089＜0.05)(表2)。
表2日本血吸虫感染兔血清中抗Sj50抗体的动态变化OD值组别样本数 感染周数 P值(t检验)(x±SD)感染前0.653±0.111 0.70445(未治疗组感染后21周与11周比较)未治疗组 8感染后11周1.415±0.552 0.00344(未治疗组感染后21周与感染前比较)感染后21周1.456±0.486 0.00080(治疗组感染后21周与9周比较)感染前0.539±0.190 0.84466(治疗组感染后21周与感染前比较)感染后9周 1.177±0.377 0.15183(感染前治疗组与未治疗组比较)治疗组9感染后21周 0.32546(感染后9-11周治疗组与未治疗组比较)0.547±0.150(治疗后11周)0.00089(感染后21周治疗组与未治疗组比较)图8显示了治疗组与未治疗组兔血清中抗Sj16抗体动态变化。与抗Sj50抗体相同，治疗组兔血清中抗Sj 16抗体水平在治疗后11周显著性下降(p＝0.00171＜0.05)，与感染前抗体水平相比无显著性差异(p＝0.104242＞0.05)。同一时期，非治疗组兔体内的抗体仍维持在高水平与感染后11周无显著性差别(p＝0.865405＞0.05)。治疗组与非治疗组组间相比，在感染前与感染后9-11周两组兔血清中抗Sj16抗体水平者无显著性差异(感染前p＝0.56034＞0.05，感染后p＝0.58679＞0.05)，而治疗后11周，治疗组兔体内抗体水平远低于同一时期未治疗组(p＝0.00834＜0.05)(表3)。
表3日本血吸虫感染兔血清中抗Sj16抗体的动态变化OD值组别 样本数 感染周数 P值(t检验)(x±SD)感染前 0.576±0.108 0.86541(未治疗组感染后21周与11周比较)未治8 感染后11周 1.423±0.612 0.00277(未治疗组感染后21周与感染前比较)疗组感染后21周 1.443±0.532 0.00171(治疗组感染后21周与9周比较)感染前 0.633±0.263 0.10424(治疗组感染后21周与感染前比较)感染后9周 1.570±0.457 0.56034(感染前治疗组与未治疗组比较)治疗组 9感染后21周 0.58679(感染后9-11周治疗组与未治疗组比较)0.766±0.215(治疗后11周) 0.00834(感染后21周治疗组与未治疗组比较)5.2 急慢性血吸虫病人血清中特异性抗体的检测将Sj50与Sj16抗原用于血吸虫病人血清中抗体的检测，结果见图9和表4。
表4正常人及急慢性日本血吸虫病人血清中抗Sj50抗体和抗Sj16抗体检测结果阳性阈值 阳性数诊断组别 OD值(x±SD) 样本数 P值(团体t检验)(x+2*SD) (阳性率％)抗原正常人 0.2826±0.0815 581 (1.7％)7.20E-26正常—急血)Sj50 急性血吸虫病人0.7614±0.22440.44576259 (95.2％) 5.42E-14(正常—慢血)慢性血吸虫病人0.5571±0.2078 5736 (63.2％) 1.04E-06(急血—慢血)正常人0.2824±0.078 581 (1.7％)7.28E-17(正常—急血)Sj16 急性血吸虫病人0.6421±0.24910.43896253 (85.5％) 2.94E-15(正常—慢血)慢性血吸虫病人0.5806±0.2104 5740 (70.2％) 0.14701(急血—慢血)58份正常人血清标本中两诊断抗原各有1份标本呈阳性反应，假阳性率1.7％。对于62名急性血吸虫病人血清的检测结果显示，在59名患者体内查见抗Sj50抗体，阳性率为95.2％高于抗Sj16抗体检测的阳性率85.5％(53/62)。慢性血吸虫病人血清中抗Sj50抗体与抗Sj16抗体的检测率都低于急性血吸虫病人，其中抗Sj50抗体的检测的敏感性为63.2％(36/57)，抗Sj16抗体检测的敏感性为70.2％(40/57)。对检测结果进行统计学分析后，本发明人发现以Sj50为诊断抗原，急性与慢性血吸虫病人抗体检测结果间有显著性差异(P＝1.04E-06＜0.05)，而Sj16抗原则无法区分急性与慢性感染(P＝0.14701＞0.05)。
讨论在本发明中，本发明人分离出了日本血吸虫免疫素蛋白Sj50和钙结合蛋白Sj16，还重组表达了日本血吸虫免疫素蛋白Sj50和钙结合蛋白Sj16并将其用于血吸虫抗体的检测。对于日本血吸虫病的诊断，在感染动物血清与人血清检测中都获得了较为理想的结果。
为了寻找新的日本血吸虫病诊断抗原，本发明人对日本血吸虫大陆株成虫cDNA文库进行了大规模ESTs(表达序列标签)的测序。在分析表达序列标签的过程中获得了若干个与Smp50具有较高同源性的ESTs，本发明人将这些ESTs进行电子拼接，得到了日本血吸虫Sjp50基因的全长编码序列。与GenBank中的nt和nr库进行同源比较，发现与一个来自日本血吸虫菲律宾株的免疫素基因序列(Schistosoma japonicum immunophilin-like mRNA sequence，AF175126)核苷酸一致性高达94％，但未见相关文献报导；而与Sm的免疫素基因序列核苷酸一致性84％，氨基酸一致性为71％。
由于Sjp50和Smp50在核苷酸水平氨基酸水平上的一致性达到了71％，本发明人认为他们很可能也具有相似的功能。Smp50的研究显示P50属FK506结合蛋白(免疫素)超家族，与热休克结合免疫素P59等结构相似，具有PPIase活性，可帮助血吸虫体内的蛋白组装和蛋白折叠，而且能够与热休克蛋白90相互作用，一起构成类固醇激素受体复合物的成分。已知宿主的激素对血吸虫的生长发育有调节作用，但到目前为止，人们尚未直接证据表明血吸虫体内有类固醇激素受体存在。而Sjp50和Smp50的存在可能对验证类固醇受体提供一些支持。以前的研究显示，P50可以被曼氏血吸虫可溶性抽提物以及表皮抽提物所识别，说明Smp50可能存在于表皮，且抗P50的抗血清不能识别Hela细胞和大肠杆菌的抽提物，说明来源于不同物种的FKBP虽然在一般结构上有许多相似性，但在全部结构以及序列上的差异足以产生不同的抗体反应。这些实验结果提示，Sjp50可作为潜在的诊断和疫苗靶点进行进一步的研究。
本实验中本发明人重组了Sj16，并将其用于日本血吸虫病的诊断，在感染动物血清与人血清检测中都获得了较为理想的结果。
Sj16与曼氏血吸虫的SME16基因具有较高的同源性。SME16被认为是虫卵阶段特异的钙结合蛋白，但其在虫卵中的功能尚不清楚。1992年Moser在体外重组表达了曼氏血吸虫虫卵中的一种钙结合蛋白Sm16(SME16)，该蛋白可为免疫兔血清识别，被认为是一种具潜力的诊断抗原。其后Rao的研究发现Sm16具有抗感染的作用，是一种兔疫调节蛋白在血吸虫的免疫逃避中起着重要作用，重组表达的Sm16具有强烈的免疫活性可为多克隆的免疫兔血清所识别。值得注意的是，钙结合蛋白是一类重要的参与调节细胞活动的蛋白家族，该类蛋白与靶蛋白结合后可使后者发生构象改变，从而激发一系列生物学反应，如肌肉收缩、神经递质释放、酶激活和细胞生长等[Silva AC，Reinach FC.Calcium binding inducesconformational changes in muscle regulatory proteins.Trends BiochemSci 1991；16(2)53-7]。鉴于SME16在虫卵中的高表达和钙结合蛋白的重要生理功能，有理由认为，SME16在调节虫卵细胞活动过程中必然发挥着重要而独特的作用。有意思的是SME16与童虫、成虫特异的钙结合蛋白sm20[AvercroftJC，Huggins MC，Dunne DW，et al.Characterisation of Sm20，a 20-kilodaltoncalcium-binding protein of Schistosoma manoni.Mol Biochem Parasitol1990；38(2)211-9]以及尾蚴特异的8-KDa钙结合蛋白[Am D，Grossman Z，Markovics A，et al.Rapid changes in the expression of a gene encoding a calciumbinding protein in Schistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol1989；34(2)167-75]除了具有相似的钙结合位点外，相互之间并不具有明显的同源性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110> 国家人类基因组南方研究中心中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所上海第二医科大学基础医学院<120> 日本血吸虫的特异性抗原及用途<130> 027623<160> 8<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 438<212> DNA<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)<220>
<221> CDS<222> (1)..(435)<223>
<400> 1atg tcg gat gaa aac cga tgg att gca gtt ttt aat tca cta gat aaa 48Met Ser Asp Glu Asn Arg Trp Ile Ala Val Phe Asn Ser Leu Asp Lys1 5 10 15gat gga aat aag tta tta aca cgt gat gaa att gag caa tgc ttg aaa 96Asp Gly Asn Lys Leu Leu Thr Arg Asp Glu Ile Glu Gln Cys Leu Lys20 25 30agt ctt ggc gtt tct gaa agt ttt gcc gaa aag ata atc aag gaa act144Ser Leu Gly Val Ser Glu Ser Phe Ala Glu Lys Ile Ile Lys Glu Thr35 40 45gac ttg aat aaa gat gga aaa atc tct ttg gat gaa tac ctg aaa gca192Asp Leu Asn Lys Asp Gly Lys Ile Ser Leu Asp Glu Tyr Leu Lys Ala50 55 60cta aga aaa atc cct cca cgt gac aaa tgt tca agt gtt gaa cgt tgg240Leu Arg Lys Ile Pro Pro Arg Asp Lys Cys Ser Ser Val Glu Arg Trp65 70 75 80aaa gaa gta ttt caa tcc ata gat aaa gat aat tca ggc aaa gtt tct288Lys Glu Val Phe Gln Ser Ile Asp Lys Asp Asn Ser Gly Lys Val Ser85 90 95
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Glu145<210> 3<211> 1413<212> DNA<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)<220>
<221> CDS<222> (12)..(1286)<223>
<400> 3acgcagttga c atg tcg gag acg cca aag cag tct gaa gag gaa tat cta50Met Ser Glu Thr Pro Lys Gln Ser Glu Glu Glu Tyr Leu1 5 10aaa gat ttc ata gac tta agc cca tct ggt gat cgt ggt att ctc aag 98Lys Asp Phe Ile Asp Leu Ser Pro Ser Gly Asp Arg Gly Ile Leu Lys15 20 25aaa gta gta cga gaa ggc tac tcg gac atc aaa cca tgc gat ggt gac146Lys Val Val Arg Glu Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Pro Cys Asp Gly Asp30 35 40 45acg gtc ata gta cat tat gtc ggt act aac ttc ggt ggt gaa aag cat194Thr Val Ile Val His Tyr Val Gly Thr Asn Phe Gly Gly Glu Lys His50 55 60ggt gaa gta ttc gac tca agc aga gcc cga aat gaa aag ttt gaa ttt242Gly Glu Val Phe Asp Ser Ser Arg Ala Arg Asn Glu Lys Phe Glu Phe65 70 75aca att ggg aaa ggt agt gta att aaa gct tgg gat atc ggt gtt gca290Thr Ile Gly Lys Gly Ser Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ala80 85 90act atg agg ttg gga gaa gtt tgt gaa ttg atc gcg tcg cct gaa tat338Thr Met Arg Leu Gly Glu Val Cys Glu Leu Ile Ala Ser Pro Glu Tyr95 100 105gcg tac atg gat ggg aaa tct ctt aag ttt gag gtg gag ctt ttt gaa386Ala Tyr Met Asp Gly Lys Ser Leu Lys Phe Glu Val Glu Leu Phe Glu110 115 120 125act atg ggc tct gat gtc agc aga aac aaa gat ggg agt att cgc aag434Thr Met Gly Ser Asp Val Ser Arg Asn Lys Asp Gly Ser Ile Arg Lys130 135140tca att att aaa aag gga aga gat atc cac aat cct gta gct ggg gct482Ser Ile Ile Lys Lys Gly Arg Asp Ile His Asn Pro Val Ala Gly Ala145 150 155gaa gcc act att gtt ttc cgc aat ctt ttg aac ttg acg gag gaa aca530Glu Ala Thr Ile Val Phe Arg Asn Leu Leu Asn Leu Thr Glu Glu Thr160 165 170gaa gtc aca tat tgt gtt ggc gac cct cca tca aac gta ccg gat gag578
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<210> 4<211> 425<212> PRT<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)<400> 4Met Ser Glu Thr Pro Lys Gln Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Lys Asp Phe1 5 10 15Ile Asp Leu Ser Pro Ser Gly Asp Arg Gly Ile Leu Lys Lys Val Val20 25 30Arg Glu Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Pro Cys Asp Gly Asp Thr Val Ile35 40 45Val His Tyr Val Gly Thr Asn Phe Gly Gly Glu Lys His Gly Glu Val50 55 60Phe Asp Ser Ser Arg Ala Arg Asn Glu Lys Phe Glu Phe Thr Ile Gly65 70 75 80Lys Gly Ser Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ala Thr Met Arg85 90 95Leu Gly Glu Val Cys Glu Leu Ile Ala Ser Pro Glu Tyr Ala Tyr Met100 105 110Asp Gly Lys Ser Leu Lys Phe Glu Val Glu Leu Phe Glu Thr Met Gly115 120 125Ser Asp Val Ser Arg Asn Lys Asp Gly Ser Ile Arg Lys Ser Ile Ile130 135 140Lys Lys Gly Arg Asp Ile His Asn Pro Val Ala Gly Ala Glu Ala Thr145 150 155 160Ile Val Phe Arg Asn Leu Leu Asn Leu Thr Glu Glu Thr Glu Val Thr165 170 175Tyr Cys Val Gly Asp Pro Pro Ser Asn Val Pro Asp Glu Leu Asp Gln180 185 190Ser Val Arg His Met Asn Thr Gly Glu Val Ser Arg Ile Val Val Tyr195 200 205Lys Asp Gly His Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Lys Asp Arg Ile210 215 220Val Tyr Glu Leu Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Thr Lys His Leu Ser225 230 235 240Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu Arg Ile Ala Tyr Ala Asn Thr Leu Lys245 250 255Glu Lys Ala Asn Asn Phe Leu Lys Asp Ser Lys Phe Asp Ser Ala Ile260 265 270Glu Leu Tyr Lys Arg Leu Asp Asp Glu Leu Gln Tyr Val Val Ala Asn275 280 285Gly Pro Thr Arg Gln Arg Asn Cys Leu Gly Phe Thr Val Ala Val Gln290 295 300Leu Asn Leu Ala Leu Val Tyr Leu Lys Leu Cys Lys Pro Arg Gln Cys305 310 315 320Ile Glu Phe Cys Lys Lys Val Leu Asp Asn Phe Ser Asp Asn Glu Lys
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<221> misc_feature<222> (1)..(32)<223> 引物<400> 8ccgctcgagc atacgtttga cgtacataag ct 3权利要求
1.一种分离的蛋白，它是日本血吸虫特异性抗原，其特征在于，它选自下组(a)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有针对日本血吸虫的免疫原性的蛋白。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的蛋白。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，它选自下组(a)SEQ ID NO1中1-438位的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO1中第1-435位的核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.一种日本血吸虫免疫原性蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在表达条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
8.一种能与权利要求1所述的蛋白特异性结合的抗体。
9.一种检测样品中是否存在抗日本血吸虫抗体的方法，其特征在于，包括将样品与权利要求9所述的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在抗日本血吸虫抗体。
10.一种检测日本血吸虫抗体的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的蛋白和说明书。
全文摘要
本发明涉及日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的特异性抗原，即日本血吸虫免疫素蛋白Sj50和钙结合蛋白Sj16。本发明不仅分离了日本血吸虫免疫素蛋白Sj50和钙结合蛋白Sj16的基因，还重组表达了这两种蛋白，解决大量诊断抗原的来源。Sj50和sj16能够高敏感性与特异性地检测血吸虫抗体，特别是Sj50具有区分急慢性感染的可能，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/12GK1629189SQ20031010939
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月15日 优先权日2003年12月15日
发明者胡薇, 王兆军, 沈大康, 薛纯良, 冯正, 韩泽广 申请人:国家人类基因组南方研究中心, 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所, 上海第二医科大学基础医学院