专利名称：一种埃菌氏菌属菌种以及采用该菌种生产类胡萝卜素的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产类胡萝卜素的方法，尤其是一种埃菌氏菌属菌种以及采用该菌种生产类胡萝卜素的方法。
背景技术：
类胡萝卜素是生物体内一种重要的化合物，它是一种类异戊二烯的多聚体，或为线型或为环状，由8个异戊二烯单位(四类萜)以头尾相连方式组成。类胡萝卜素是不溶于水的色素，出现于植物和光合细菌，其功能常常只在光合作用中作为辅助色素。作为一种重要的生物化工材料，类胡萝卜素被广泛地应用于食品、医药、日用化工等领域，涵盖大量产品，传统的生产类胡萝卜素的方法均采用植物提取法，其工艺过程是植物体-粉碎-有机溶剂-浓缩-干燥，其缺点是有机溶剂用量大，受季节因素影响，产量不稳定。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种埃菌氏菌属菌种。
本发明的另一个目的就是要提供一种该埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法。
本发明的目的是这样实现的一种埃菌氏菌属菌种，其形态特征该菌在牛肉膏蛋白胨平板上生长，菌落光滑、湿润、圆形、边缘整齐，无特殊气味，且能聚集玫瑰红色的色素，在营养肉汤中生长呈均匀混浊，有菌膜形成，整管为红色，查氏培养基平板上长出光滑、湿润的乳白色菌落，无特殊气味。
其生理生化特征草兰氏染色为阴性短小杆菌，细胞单生，不运动，不形成芽孢，没有鞭毛，不运动，兼性厌氧。
该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM203057。
(一)、该菌种的分离步骤在N30°41.602’，E111°18.499’附近表层5-6cm深处的土壤，其具体非限制性的分离步骤为①制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，并倒平板；②取N30°41.602’，E111°18.499’附近表层5-6cm深处的土壤10g，制备成土壤稀释液，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀释度的土壤溶液；③将上述不同浓度的土壤悬液采用平板涂布法涂布在牛肉膏蛋白胨平板的培养基表面；④将涂布好的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中恒温培养24小时；
⑤将培养后长出的产红色素的单个菌落，菌落特征该菌在牛肉膏蛋白胨平板上生长，菌落光滑、湿润、圆形、边缘整齐，无特殊气味，且能聚集玫瑰红色的色素，在营养肉汤中生长呈均匀混浊，有菌膜形成，整管为红色，查氏培养基平板上长出光滑、湿润的乳白色菌落，无特殊气味，挑出少许，进行镜检；⑥确定单个菌落为纯种后，利用平板划线分离法进行纯种分离，得到积聚红色素的菌种；⑦对所得菌种进行筛选，得该菌株。
(二)、培养该埃菌氏菌属菌种采用的培养基①分离固体斜面分离培养基将10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g氯化钠、2g琼脂加入100ml的蒸馏水中，将PH值调节为7.2-7.4，在121℃的温度条件下灭菌20分钟。
②纯化固体纯化培养基将10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g氯化钠、2g琼脂加入100ml的蒸馏水中，将PH值调节为7.2-7.4，在121℃的温度条件下灭菌20分钟。
③增殖液体增殖培养基将10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g氯化钠、2g琼脂加入100ml的蒸馏水中，将PH值调节为7.2-7.4，在121℃的温度条件下灭菌20分钟。
④扩大发酵培养基将1％的碳源、5％的氮源，加入5000ml的发酵罐中，调PH值为7.2-7.4，在121℃温度下灭菌20分钟。
其中碳源是指玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、葡萄糖、蔗糖中的一种或多种。
氮源是指米糠、麸皮、硫酸铵、尿素、玉米浆中的一种或多种。
营养成份是指玉米浆、麦芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白中的一种或多种。
(三)、该埃菌氏菌属菌种的培养条件①培养温度15℃-45℃，最适温度为28℃-30℃；②培养方式好氧培养；③培养时间48-72小时；④PH值范围PH4-8，最适PH为5.5-6.0。
(四)、该埃菌氏菌属菌种的形态特征该菌在牛肉膏蛋白胨平板上生长，菌落光滑、湿润、圆形、边缘整齐，无特殊气味，且能聚集玫瑰红色的色素，在营养肉汤中生长呈均匀混浊，有菌膜形成，整管为红色，查氏培养基平板上长出光滑、湿润的乳白色菌落，无特殊气味。
(五)、该埃菌氏菌属菌种的生理生化特征革兰氏染色为阴性短小杆菌，细胞单生，不运动，不形成芽孢，没有鞭毛，兼性厌氧。
根据上述特征，并经细菌学鉴定，从《伯杰系统细菌学手册》(Brrgey’s Manual ofSystematic Bacteriology)中查知为埃菌氏菌属的菌种。
采用上述埃菌氏菌属菌种可发酵生产类胡萝卜素，其工艺过程为在8％(重量比)的淀粉质或糖的培养基中，加入0.5％(重量比)的氮源及0.01％(重量比)的营养物质，用121℃的温度进行20分钟灭菌，冷却至常温，加入0.1％(重量比)的高温α-淀粉酶，液化1小时，冷却至常温，再加0.1％(重量比)的糖化酶糖化，同时接入5％(重量比)埃菌氏菌属菌种，用碱性物质调节发酵液，使发酵液的PH值为5.5-6.0，然后在15℃-45℃的温度条件下通气培养，培养时间为48-72小时，最后取发酵液上漂浮的物质经检测过滤、萃取、结晶、即获得固体状的类胡萝卜素。
淀粉质物质是指玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、土豆粉、木薯粉中的一种或多种。
糖是指葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖中的一种或多种。
氮源是指米糠、麸皮、麦芽、麦根、硫酸铵、尿素或玉米浆中的一种或多种。
营养物质是指玉米浆、麦芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白其中的一种或多种。
碱性物质是指氢氧化钠、液氮、碳酸钙、氢氧化钾、氧化钙其中的一种或多种。
本发明由于采用上述方案，直接利用玉米、红薯、大米等淀粉质农产品粗原料发酵生产类胡萝卜素，生产成本低廉，生产工艺简单，产率为每升1.06克。
具体实施例方式
实施例1本发明所述的埃菌氏菌属菌种的具体提纯方法在N30°41.602’，E111°18.499’附近表层5-6cm深处的土壤，其具体非限制性的分离步骤为①制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，并倒平板；②取N30°41.602’，E111°18.499’附近表层5-6cm深处的土壤10g，制备成土壤稀释液，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀释度的土壤溶液；③将上述不同浓度的土壤悬液采用平板涂布法涂布在牛肉膏蛋白胨平板的培养基表面；④将涂布好的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中恒温培养24小时；⑤将培养后长出的产红色素的单个菌落，菌落特征菌落光滑、湿润、圆形、边缘整齐，无特殊气味，且能聚集玫瑰红色的色素。挑出少许，进行镜检；⑥确定单个菌落为纯种后，利用平板划线分离法进行纯种分离，得到积聚红色素的菌种；⑦对所得菌种进行筛选，得该菌株，该菌株的保藏号为CCTCC NOM203057。
实施例2采用该埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法将8％(重量比)的玉米粉、0.5％(重量比)的米糠、0.02％(重量比)磷酸氢二钾、0.01％(重量比)的氯化钠加入100ml的蒸馏水中混合，在121℃温度条件下进行20分钟灭菌，冷却至常温，加入0.1％(重量比)的高温α-淀粉酶，液化1小时，冷却至常温，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌属菌种，用碱性物质调节发酵液，使发酵液PH值为5.5，然后在28℃-30℃的温度条件下通气培养，培养时间为48小时，最后取发酵液上漂浮的物质经检测、过滤、萃取、结晶，获得5.4％(重量比)固体状的类胡萝卜素，纯度为97％。本产品呈红色。
实施例3采用该埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法将8％(重量比)的玉米淀粉、0.5％(重量比)的麸皮、0.02％(重量比)磷酸氢二钾、0.01％(重量比)的氯化钠加入100ml的蒸馏水中混合，在121℃温度条件下进行20分钟灭菌，冷却至常温，加入0.1％(重量比)的高温α-淀粉酶，液化1小时，冷却至常温，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌属菌种，用碱性物质调节发酵液，使发酵液PH值为5.5，然后在28℃-30℃的温度条件下通气培养，培养时间为48小时，最后取发酵液上漂浮的物质经检测、过滤、萃取、结晶，获得5.4％(重量比)固体状的类胡萝卜素，纯度为97％。本产品呈红色。
实施例4采用该埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法将8％(重量比)的薯干粉、0.5％(重量比)的麦芽、0.02％(重量比)磷酸氢二钾、0.01％(重量比)的氯化钠加入100ml的蒸馏水中混合，在121℃温度条件下进行20分钟灭菌，冷却至常温，加入0.1％(重量比)的高温α-淀粉酶，液化1小时，冷却至常温，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌属菌种，用碱性物质调节发酵液，使发酵液PH值为5.5，然后在28℃-30℃的温度条件下通气培养，培养时间为48小时，最后取发酵液上漂浮的物质经检测、过滤、萃取、结晶，获得5.4％(重量比)固体状的类胡萝卜素，纯度为97％。本产品呈红色。
实施例5采用该埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法将8％(重量比)的土豆粉、0.5％(重量比)的麦根、0.02％(重量比)磷酸氢二钾、0.01％(重量比)的氯化钠加入100ml的蒸馏水中混合，在121℃温度条件下进行20分钟灭菌，冷却至常温，加入0.1％(重量比)的高温α-淀粉酶，液化1小时，冷却至常温，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌属菌种，用碱性物质调节发酵液，使发酵液PH值为5.5，然后在28℃-30℃的温度条件下通气培养，培养时间为48小时，最后取发酵液上漂浮的物质经检测、过滤、萃取、结晶，获得5.4％(重量比)固体状的类胡萝卜素，纯度为97％。本产品呈红色。
本发明生产出来的类胡萝卜素采用的检测方法为利用色质联用仪测定类胡萝卜素的结构及含量其进样方式为直接进样。
①色谱条件为色谱柱为硅铜柱长15m，内径0.25mm，载气流量2ml/分；柱温130℃→240℃→250℃；气化温度250℃；进样量2.0ul；分流比30∶1。
②质谱条件离子源EI；离子源温度250℃，离子电压70ev；EI发射电流200uA；倍增器电压210KV；分辩率12.5；扫描方式为全扫描，扫描时间23’19，反应气氮气，进样器加热240℃，利用其结构确定类胡萝卜素含量。
权利要求
1.一种埃菌氏菌属菌种，其特征在于(1)形态特征该菌在牛肉膏蛋白胨平板上生长，菌落光滑、湿润、圆形、边缘整齐，无特殊气味，且能聚集玫瑰红色的色素，在营养肉汤中生长呈均匀混浊，有菌膜形成，整管为红色，查氏培养基平板上长出光滑、湿润的乳白色菌落，无特殊气味，(2)生理生化特征草兰氏染色为阴性短小杆菌，细胞单生，不运动，不形成芽孢，没有鞭毛，不运动，兼性厌氧。
2.根据权利要求1所述的一种埃菌氏菌属菌种，其特征在于该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM203057。
3.一种用埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法，其特征在于在8％(重量比)的淀粉质或糖的培养基中，加入0.5％(重量比)的氮源及0.01％(重量比)的营养物质，0.02％(重量比)磷酸氢二钾、0.01％(重量比)的氯化钠用121℃的温度进行20分钟灭菌，冷却至常温，加入0.1％(重量比)的高温α-淀粉酶，液化1小时，冷却至常温，再加0.1％(重量比)的糖化酶糖化，同时接入5％(重量比)埃菌氏菌属菌种，用碱性物质调节发酵液，使发酵液的PH值为5.5-6.0，然后在15℃-45℃的温度条件下通气培养，培养时间为48-72小时，最后取发酵液上漂浮的物质经检测过滤、萃取、结晶、即获得固体状的类胡萝卜素。
4.根据权利要求3所述的一种用埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法，其特征在于淀粉质物质是指玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、土豆粉、木薯粉中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的一种用埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法，其特征在于糖是指葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的一种用埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法，其特征在于氮源是指米糠、麸皮、麦芽、麦根、硫酸铵、尿素或玉米浆中的一种或多种。
7.根据权利要求3所述的一种用埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法，其特征在于营养物质是指玉米浆、麦芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白其中的一种或多种。
8.根据权利要求3所述的一种用埃菌氏菌属菌种生产类胡萝卜素的方法，其特征在于碱性物质是指氢氧化钠、液氮、碳酸钙、氢氧化钾、氧化钙其中的一种或多种。
全文摘要
本发明公开了一种埃菌氏菌属菌种以及采用该菌种生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤将淀粉质原料用蒸馏水调浆，灭菌，加入淀粉酶液化后，在发酵液中加入糖化酶糖化，同时接入埃菌氏菌属菌种，采用边糖化边发酵技术，发酵生产类胡萝卜素。该菌种的保藏号为CCTCC NOM203057。本发明的优点可直接利用玉米、红薯、大米等淀粉质原料发酵生产类胡萝卜素，生产成本低廉、工艺简单。
文档编号C12N1/20GK1546648SQ200310111580
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月15日 优先权日2003年12月15日
发明者刘世玲, 邵伟 申请人:宜昌市微生物研究所