专利名称：体外构建同种生物心脏组织工程瓣膜的一种方法
技术领域：
本发明涉及一种体外构建同种生物心脏组织工程瓣膜的方法。
心脏组织工程瓣就是由无细胞的可吸收或降解的多聚体材料，或者是去除细胞的同种或异种生物瓣作为三维支架，种植自体细胞。先种植成纤维细胞，再种植单层内皮细胞(endothelial cells，ECs)包裹瓣叶，最后制造出的一种具有细胞活性的新型生物瓣植入体内，从而恢复或改进患者瓣膜的功能。目前国际上及国内均单纯的采用大隐静脉、脐带动静脉、颈外动静脉，以及冠状动静脉等血管作为提取种植细胞——内皮细胞和成纤维细胞的来源；此外国外也有报道用骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作为种植细胞种植于生物瓣支架上。但未见有利用成人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外定向诱导分化为内皮细胞作为种植细胞的报道。
将来源于MSCs诱导分化的内皮细胞作为种植细胞，种植于脱去了表面内皮细胞的同种生物心脏瓣膜支架上，以体外构建同种生物心脏组织工程瓣膜，检索文献目前国内外尚未见报道。
背景技术：
目前，大多数学者常采用大隐静脉、脐带动静脉、颈外动静脉，以及冠状动静脉等血管作为提取种植细胞的来源，其应用存在一些不足，如牺牲供体血管的完整性，增加了外科医生的操作和患者的创伤；有些血管来源仅能在动物实验中进行；此外，来源于成人血管的内皮细胞在体外很快进入增殖期，但4～6周后其增殖活性逐渐下降，特有的功能逐渐丢失，难以达到临床需要。因此，种植细胞的研究工作在一定程度上是目前TEHV体外构建的一个限速过程。
应用人类骨髓间充质(MSCs)干细胞作为心脏组织工程瓣构建的种植细胞来源有几个优点(1)用一个简单的骨髓穿刺针，容易收集，可避免损伤血管的完整性；(2)具有潜在的分化为多种细胞系能力；(3)具有独特的免疫特性，允许同物种异体基因的持续存在。正如Stock所指出的，MSCs定向分化的内皮细胞可能成为TEHV种植细胞的另一个来源。
此外，心脏组织工程瓣支架，国内外学者大多选择多聚体支架材料，如聚乙二醇酸(PGA)、多聚乳酸(PLA)、聚羟基丁酸(PH4B)等；或异种生物瓣，如猪主动脉瓣等。目前应用人工合成的多聚体材料作为支架存在不足，如多聚体弹性与生物降解性之间的矛盾，以及缺乏最佳的机械性能；而异种生物瓣作为支架也存在不足(1)猪瓣与人瓣膜之间存在瓣口直径、参数、瓣尖大小和形状的差别；(2)由于细胞外基质存在异种免疫反应，基质弹性蛋白降解，植入异种带瓣管道可能产生动脉瘤；(3)可能传染与供体动物相关的动物源性疾病，还需要进一步调查。而应用同种生物瓣作为支架就可以避免上述缺点。
因此，将来源于MSCs诱导分化的内皮细胞与同种生物瓣支架两者相结合，就显示其巨大的优越性，具有广阔的临床运用前景。
发明内容
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的方法，以及种植于脱去内皮细胞的同种生物瓣支架上，以构建同种生物心脏组织工程瓣膜。
本发明的目的是提供一种体外构建心脏组织工程瓣膜的方法，为下一步建立动物移植实验模型，并最终应用于临床换瓣手术，尤其是在小儿先天性心脏病组织工程研究中的运用提供了良好的前景。
本发明利用经液氮保存的同种主动脉带瓣管道作为生物瓣支架，用0.1％SDS脱去瓣膜表面的内皮细胞，并且用纤维连接蛋白(Fn，80μg/ml)预覆盖瓣膜支架；来源于成人骨髓间充质干细胞经体外定向诱导分化的内皮细胞作为种植细胞，高密度(＞1.2×105/cm2)地种植于瓣膜支架上；种植细胞与生物瓣支架复合体静态培养20天。分别在静态培养的第7、14和20天进行硝酸银染色和扫描电镜观察、摄片，以确定其再内皮化程度。实验结果显示同种生物瓣支架表面的内皮细胞完全脱去，而细胞外基质的主要成份弹力纤维和胶原纤维保存良好；骨髓间充质干细胞体外诱导分化的内皮细胞与生物瓣支架复合体静态培养第7、14、20天，其再内皮化程度分别为73％、85％和92％。实验结果证明我们体外构建的同种生物心脏组织工程瓣基本上实现了再内皮化的预期目标，为今后的动物实验和临床应用打下了坚实的基础。
下面用实施例对本发明进行进一步详细说明。
四
附图1MSCs细胞表面标志的流式细胞仪检测结果CD166 99.9％，CD105 100％，CD29 100％，CD13 100％，CD34 0.08％，HLA-DR 0.60％，CD45 0.15％。
附图2.0.1％SDS脱细胞后主动脉瓣的表面(SEM，×500)附图3.MSCs诱导的ECs种植于脱ECs的同种主动脉支架上静态培养20天时的扫描电镜照片(SEM×500)附图4.同种瓣支架种植内皮细胞静态培养第20天，再内皮化程度92％(0.5％硝酸银染色，立体显微镜，×57)
五具体实施例方式
实施例1成人骨髓间充质干细胞的体外分离、纯化和扩增及鉴定一方法1.无菌条件下采集非血液系统疾病的人骨髓(取自军事医学科学院附属医院全军造血干细胞移植中心健康成人献髓员，年龄25～40岁)。
2.骨髓以含10％胎牛血清(FBS，Stem Cell公司，美国)的低糖DMEM(DMEM-LG，GIBCO公司，美国)培养液对半稀释后，以Percoll细胞分离液(比重1.073g/ml，Pharmacia，美国)梯度离心(900g×30min)，取中间界面层的单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)层面，制成MNCs悬液。
3.细胞经PBS洗涤两遍后计数，按2×105cells/cm2(T-75培养瓶)的密度接种于含10％FBS的LG-DMEM培养液中，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的孵箱(model5400，NAPCO公司，美国)内培养。
4.培养72h后更换培养基，以去除悬浮细胞；继续培养，每3～4d天换液。
5.贴壁层细胞达到90％以上融合后，经0.125％胰蛋白酶消化按6×103cells/cm2的密度接种于传代培养瓶(T-75)中进行扩增培养。
6.原代培养当出现典型成纤维细胞样形态和细胞密度融合达到80％～90％时，进行细胞摄像。
7.MSCs细胞培养扩增到第二代时，用胰蛋白酶消化收获细胞，分别取2×105个细胞与鼠抗人CD13、CD29、CD34、CD45、CD105和HLA-DR抗体室温中反应30min，用PBS洗涤两次去除未反应的抗体后与FITC标记的二抗避光反应15min。
8.取2×105个细胞与CD166直标抗体室温避光孵育20min，1％BSA-PBS清洗2遍，加入500μl PBS重悬，并设IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC5为对照。
9.应用流式细胞仪(COULTER Epics XL-AD 2517，BECKMAN COULTER公司，美国)检测至少10,000个细胞，用Cofit软件分析结果。
注以上操作均严格按照无菌操作规程二.结果经上述方法可从5.0×105个原代MSCs在体外扩增15代后，获得8.0×1012个MSCs，扩增了约1.6×107倍。流式细胞仪检测MSCs的表面抗原特性。CD34、CD45和HLA-DR表达呈现阴性；而CD105、CD13、CD29和CD166表达呈现阳性，均在98％以上。经过2代以上的传代后(细胞大约分裂14次)，体外扩增的MSC在形态和细胞表型上达到了95％以上的均一(见说明书附图1)。
实施例2.MSCs向内皮细胞的定向诱导分化及鉴定一.方法1.选择第3～10代的MSCs作为实验材料。
2.其诱导培养体系的组成为DMEM-HG，20％FBS(天津市川页生化制品有限公司，批号030509)、VEGF(10ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英国)、bFGF(5ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英国)、L-谷氨酰胺(2mmol/L)、青霉素液(100U/ml)、链霉素液(100μg/ml)。
3.每2～3d更换培养液，当贴壁层细胞达到90％以上融合后，经0.125％胰蛋白酶消化传代；按6×103cells/cm2的密度接种于25cm2培养瓶中。重复上述细胞传代的操作即可实现细胞的有效扩增。
4.当光镜下诱导的细胞长成单层，呈“鹅卵石”(cobblestone)样时制备细胞悬液，分别用5％戊二醛和1％四氧化锇固定，制成电镜标本行透射电镜(TEM，JEM-1010，日本)观察。
5.VIII因子(vWF)和Tie-2相关抗原的免疫组化检测(ABC法)选择MSCs经诱导分化培养体系14～21天的细胞，消化后用离心涂片机涂片于载玻片上，丙酮固定细胞。采用ABC法进行检测，并设阴性对照组；滴加1∶100的兔抗人VIII因子抗体(一抗)和1∶200的鼠抗人单克隆抗体。Nikon倒置相差显微镜(Olympus，日本)下观察，拍照。细胞浆内出现棕褐色颗粒为阳性反应。
二.结果MSCs在加入诱导分化培养体系大约14～21d后，形态多不固定，贴壁的细胞表现为较大，呈扁平、大多角形、长梭形、园形、椭原形或板状，细胞有丰富的胞浆和不规则突起。长成单层的胞，呈典型的“鹅卵石”样，为内皮细胞形态学特征。TEM下胞浆内可见Weible-palade小体(简称W-P小体)，是ECs特有的颗粒。VIII(vWF)因子和Tie-2相关抗原的免疫组化结果显示细胞呈多角型或圆型，胞浆内布满细密的棕褐色颗粒，细胞核内未见着色，呈一片阴性对照区，证明培养的是内皮细胞。
实施例3.脱内皮细胞的同种生物瓣支架制备一.方法1.液氮保存的同种带瓣管道复苏，用D--Hank’s混合液充分漂洗。该混合液中含有抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；链霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)；HEPES液(10mmol/L，pH 7.6)。
2.漂洗后的同种带瓣管道贮存于新鲜配制的PBS液中。PBS液中含有EDTA(0.1％，w/v)；抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；链霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)。
3.细胞溶解。用低渗Tris缓冲液溶解瓣膜的细胞，室温下孵育18～24h。低渗Tris缓冲液的组成Tris缓冲液(10mmol/L)；EDTA(0.1％，w/v)；抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；链霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)。
4.采用细胞洗涤剂来脱细胞，即将SDS加入低渗Tris缓冲液中，室温下孵育24h。0.1％SDS(w/v)用于脱瓣膜的细胞和脱主动脉壁的细胞。
5.用等渗Tris缓冲液充分冲洗。等渗Tris缓冲液的组成Tris缓冲液(50mmol/L，pH 8.0)；NaCl(0.15M)；EDTA(0.1％，v/v)；抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；链霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)。
6.形态学观察及半定量判断6.1 H-E染色用10％(v/v)中性福尔马林液作固定、脱水、石蜡包埋，用于观察大体结构。
6.2改良Van Gieson染色用于确定弹性纤维(elastic fiber，EF)。EF被染成深蓝色。
6.3 Masson’s trichrome染色法用来确定胶原纤维(collagen fiber，CF)，CF被染成绿色，。
6.4扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)观察标本用5％戊二醛固定3～12h，然后用30％、50％、70％、90％及100％的乙醇逐级脱水，再用醋酸异戊酯固定置换，CO2临界干燥点干燥，种植片表面喷金后，即可于SEM下观察。
6.5人类同种瓣的形态学结构被半定量1级(好)在H-E染色下观察无形态学改变，弹力纤维(EF)和胶原纤维(CF)基本无紊乱；2级(可接受程度)较小程度的EF和CF结构紊乱；3级(差)胶原纤维和弹力纤维明显的结构紊乱，纤维间的空隙增加。
二.结果光镜和SEM下观察两者的内皮细胞基本被脱去，而中心部位的成纤维细胞有一部分被保留了下来，弹力纤维和胶原纤维在脱细胞前后均无明显改变，其形态学结构半定量为1级(好)(见说明书附图2)。
实施例5.来源于MSCs的ECs种植于同种生物瓣支架上及静态培养一.方法1.选择生长良好的第4～8代ECs细胞制成悬液，调整内皮细胞种植密度为1～2×105cell/cm2。
2.去内皮细胞的同种生物瓣在无菌条件下，剪切成0.8×0.8cm2的大小，置入24孔培养培养板内，其上放置自制的玻璃圈以防止瓣膜漂浮。
3.用纤维连接蛋白(Fn，80μg/ml)预覆盖瓣膜，并置入含有内皮细胞悬液的DMEM-HG培养体系，内含20％FBS、VEGF(10ng/ml)；FGF(10ng/ml)；L-谷氨酰胺(2mmol/ml)；青霉素(100U/ml)；链霉素液(100U/ml)；37℃、5％CO2湿润孵箱中，每隔3～4天换液一次。静态培养天共计20天。
4.组织形态学显微镜观察分别在静态培养的第7天、第14天和第20天结束时进行0.5％硝酸银染色和扫描电镜(SEM)观察、摄片。
4.生物瓣再内皮化程度判断用百分数来(％)来表示瓣膜被内皮细胞覆盖的面积，即表面内皮化程度。
二.结果在静态培养的第7、14、20天同种生物瓣支架内皮化程度分别为73％、85％和92％，基本实现了生物瓣体外再内皮化构建的预期目标，为下一步脉动流培养，以及动物移植实验和临床应用提供了材料基础(见说明书附图3、4)。
权利要求
1.体外构建同种生物心脏组织工程瓣的一种方法。其特征在于生物瓣支架选择经液氮保存的同种主动脉带瓣管道，用0.1％SDS脱去瓣膜表面的内皮细胞，并且用纤维连接蛋白(Fn，80μg/ml)预覆盖瓣膜支架；来源于成人骨髓间充质干细胞经体外定向诱导分化的内皮细胞作为种植细胞，高密度(＞1.2×105/cm2)地种植于瓣膜支架上；种植细胞与生物瓣支架复合体静态培养20天。分别在静态培养的第7、14和20天进行硝酸银染色和扫描电镜观察、摄片，以确定其再内皮化程度。实验结果显示同种生物瓣支架表面的内皮细胞完全脱去，而细胞外基质的主要成份弹力纤维和胶原纤维保存良好；骨髓间充质干细胞体外诱导分化的内皮细胞与生物瓣支架复合体静态培养的第7、14、20天，其再内皮化程度分别为73％、85％和92％。实验结果证明我们体外构建的同种生物心脏组织工程瓣基本上实现了再内皮化的预期目标，是一种心脏瓣膜组织工程学研究的有效方法。
全文摘要
本发明包括利用经液氮保存的同种主动脉带瓣管道作为生物瓣支架，用0.1％SDS脱去瓣膜表面的内皮细胞；来源于成人骨髓间充质干细胞经体外定向诱导分化的内皮细胞作为种植细胞，高密度(＞1.2×10
文档编号C12N5/08GK1629284SQ20031012113
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月16日 优先权日2003年12月16日
发明者刘迎龙, 冯滨, 龚茹, 冯凯, 谢宁, 宋来凤 申请人:刘迎龙, 冯滨