专利名称：一种同时快速检测多种微生物的方法
技术领域：
本发明属于生物与医学领域，可以用于(但不限于)医学、兽医学和植物保护等基础或应用方面。
2.背景技术检测微生物具有重要的基础与应用价值。例如，检测医学病原微生物，如艾滋病毒，能够诊断艾滋病，或评价艾滋病人治疗的效果；检测兽医病原微生物，如禽流感病毒，能够诊断禽流感疫情；检测农作物的病原微生物，如水稻矮缩病毒，可以研究水稻矮缩病的防控措施。
微生物的检测有多种技术。本发明所用的技术，追根溯源，是用PCR技术。PCR技术中文叫做聚合酶链式反应，它是通过特异的引物来检测各种微生物特有的核酸序列，并通过检测微生物特有的核酸序列来达到检测微生物的目的。
现有的检测微生物的PCR技术绝大多数是一次操作只检测一种微生物，只有少数能同时检测多种微生物[1]。这些少数同时检测多种微生物的PCR技术是在同一个PCR反应管中加上多对引物，每对引物对应不同的微生物，从而达到同时检测多种微生物的目的，这种方法叫做Multiplex PCR技术[2，3，4，]。MultiplexPCR技术可以通过跑核酸电泳来检测，也可以通过荧光信号来检测[3，4]。它是和本发明最为接近的技术，但是和本发明又有许多不同。
Multiplex PCR技术至少有2个不足之处1)用此方法同时检测的微生物的种类越多，它的反应体系内部的引物种类就越多，引物之间相互干扰性就越强，因而它能同时检测的微生物的种类非常有限，一般不超过4种；2)如果通过荧光信号来阅读检测结果，上述干扰性更为突出。
本发明是以同时检测鸡禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉支气管炎病毒、鸡败血霉形体、鸡嗜血杆菌等鸡6种病原微生物为例，具体说明本发明具体实施过程。以前从未有过同时检测这6种病原微生物的实验室方法的报道，也从未有过用本发明所用的方法检测鸡病原微生物的报道。
参考文献[1]<作者>Dieffenbach CW，Dveksler GS.<书名>PCR PrimerA Laboratory Manual.<出版社>Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995年.<作者>Helps C，Reeves N，Egan K，Howard P，Harbour D.<期刊名>Detection ofChlamydophila felis and feline herpesvirus by multiplex real-time PCR analysis.Journal of Clinical Microbiology，2003年第41卷第6期第2734-2736页[3]<作者>Beuret C.<题名>Simultaneous detection of enteric viruses by multiplexreal-time RT-PCR.<期刊名>Journal of Virological Methods，2004年第115卷第1期第1-8页.<作者>Stram Y，Kuznetzova L，Guini M，等.<题名>Detection and quantitation ofAkabane and Aino viruses by multiplex real-time reverse-transcriptase PCR.<期刊名>Journal of Virology Methods，2004年第116卷第2期第147-154页.
3.发明内容为克服现有的PCR技术不能同时检测很多种微生物，以及难以用通过荧光信号来阅读检测结果的两个不足，本发明的发明人设计并通过试验确认了一种新的PCR技术。这项PCR技术被本发明人命名为“同组PCR”技术。它针对本发明的技术问题的解决方案是设计一组PCR反应，这一组PCR各个PCR反应发生在不同的管子中，因而不相互干扰；所要检测的各种微生物分别对应着这一组PCR反应中某一个或几个PCR反应，这一组PCR反应共用同一台PCR仪器和同一个反应程序，从而达到同时检测多种微生物的效果；各个PCR反应所扩增的产物在50bp-1000bp之间，使得既能够通过核酸电泳来阅读检测结果，也能够通过荧光信号来阅读检测结果。
现在许多PCR仪器都有96个反应孔，如果一种微生物平均对应着两个PCR反应，每个PCR反应只需要占用PCR仪器上一个反应孔，那么在一个有96孔的PCR仪上按照上述“同组PCR技术”最多可以检测48种微生物。
由于这一组共用同一台PCR仪器和同一个反应程序，所以在引物设计时受到一定的限制。例如，如果采用普通的PCR仪器，则理论上这一组PCR反应中各个PCR反应所用的引物Tm值应当大致相同，而且扩增产物的大小也大致相同，使得各个PCR反应可以共用同一个检测程序，甚至反应体系内除引物外其余成分都可一致；如果采用梯度PCR仪器，则这一组PCR反应中各个PCR反应所用的引物Tm值可以有一定的差异，但是各个PCR反应需要放在合适的位置上，使得各个PCR反应可以采用同一个反应程序。
本发明的“同组PCR”技术有以下几种形式(并不局限于以下几种)。
1)普通的同组PCR技术，特征是检测的核酸模板是DNA或由RNA转化而来的cDNA，它是各种形式的“同组PCR”技术的核心和基础。
2)同组RT-PCR技术，特征是检测的核酸模板是RNA，它在PCR反应前进行反转录(英文缩写为“RT”)，将RNA转化为DNA，再进行PCR反应。
3)荧光同组PCR技术，它的特征是用荧光信号检测PCR反应的结果，可以进一步细分为检测DNA的普通的荧光同组PCR技术和检测RNA的荧光同组RT-PCR技术。
4)同组梯度PCR技术，它的特征是用梯度PCR仪器来操作，这一组PCR反应中各个PCR反应所用的程序不同，但是在某些环节中各个PCR反应的温度可以不同(即可以有一定的梯度)，此技术可以实际上放宽了同组PCR技术对引物的设计要求，但是每个PCR反应应当放在某一个确定的位置上。同组梯度PCR技术可以进一步细分为检测DNA的普通的同组梯度PCR技术和检测RNA的同组梯度RT-PCR技术。
由于各种微生物，无论是基因组为DNA的微生物，还是基因组为RNA的微生物，其基因流动过程中都存在RNA这个阶段，因此理论上我们可以提取样品中的总RNA，通过上述同组RT-PCR技术达到检测各种微生物的目的。
同组RT-PCR技术中RT和PCR两个步骤可以分开来操作，也可以并成一个步骤。如果分开来操作，利用随机引物进行RT可以制备同组PCR反应中各个反应都能共用的cDNA模板。
与已有的并且最为接近的技术方案，即Multiplex PCR反应相比，同组PCR技术有益效果是1)它能同时检测很多种微生物，种类达到几十种以上；2)各种微生物的检测发生在不同的一个体系之内，相互没有干扰；3)可以通过荧光信号来阅读检测结果，并且通过荧光信号来阅读检测结果各个微生物检测体系仍然不相互干扰。
4.具体实施方式
下面以同时检测鸡禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉支气管炎病毒、鸡败血霉形体、鸡嗜血杆菌为例具体说明本发明。
第一步，引物设计。
设计并合成出12对引物(可以在上海生物工程有限公司合成)，分别对应着上述鸡6种病原微生物的基因组(每种微生物对应2对引物)，这些引物的序列以前别人没有报道过，它们的序列如下1)禽流感病毒第一对引物(编号为A1)INFS1(引物名称，下同)AAGCCGAGATCGCGCAGAGAC(引物序列，下同)INFR1CCTTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC2)禽流感病毒第二对引物(编号为A2)INFS2GCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTINFR2CTCATAGACTCAGGCACTCCTTCCGT3)新城疫病毒第一对引物(编号为A3)NDVS1AACCACTCAGGCAAGGTGCTCTCANDVR1GCAAGGGCAACATGGTTCCTCA4)新城疫第二对引物(编号为A4)NDVS2TCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCAC
NDVR2ACTCATCTGCTGTCTCATACGCAGTCA5)鸡传染性支气管炎病毒第一对引物(编号为A5)IBVS1ATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGGIBVR1GGTGGCTTTGGTCCTCCTAGTTTGAT6)鸡传染性支气管炎病毒第二对引物(编号为A6)IBVS2TAGTGTGGGTTGCTGCTAAGGGTGCIBVR2TCCCAACGGAAATTACCATCAGGTC7)鸡传染性喉支气管炎病毒第一对引物(编号为A7)ILTVS1TGTCTTATTCCTCGTAGATAGGCACCCAILTVR1CCGCTTAGATATTGTGCAACAGGGA8)鸡传染性喉支气管炎病毒第二对引物(编号为A8)ILTVS2GGATTTGGATATTTGCGAACAGGCILTVR2TGTACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCAT9)鸡败血霉形体第一对引物(编号为A9)mycopR1TGTGTTAACTGCAGCACCGAAGTATTCmycopS1ACTGTAAACGATGGATGTTAAGTGTCGGA10)鸡败血霉形体第二对引物(编号为A10)mycopS2CGCGTGAACGATGAAGGTCTTTTTAGmycopR2AATGGTACAGTCAAATTAATAGCTTTCCACTCTA11)鸡嗜血杆菌第一对引物(编号为A11)HaemS1AAACCAACTAAAAGAGCAGCCCCTAATHaemR1CCATTGATATTCAACACGTAATGCAAGT12)鸡嗜血杆菌第二对引物(编号为A12)
HaemS2CGAAGCAGCCAACTTAAAATTATCACAACHaemR2GAAACTAAGTAGTTAGCCACAGTGTCAGCAC第二步，组装检测试剂。
1)引物稀释将每对引物等摩尔混合，并用纯水将每个引物稀释成12.5μmol/L，冷冻储存；2)组装反应混合液(编号为“Mix 1”，所需试剂可以购自西安华美生物工程公司)反应混合液中除了纯水之外，还含有0.8mmol/L dNTP、3mmol/L MgCl2、(1/10)反应体积的10x PCR缓冲液，1单位/25μL的Taq DNA聚合酶，(1/25)反应体积的25×SYBR Green I。
第三步，反转录。
1)用Trizol(美国Invitrigen公司生产)提取检测样品总RNA；2)用随机引物进行反转录，所需试剂可以购自西安华美生物工程公司，具体的体系含有dNTP，0.8mmol/L；MgCl2，3mmol/L；5x RT缓冲液，1/5反应总体积；随机引物(N)6，2μmol/L；AMV逆转录酶，1U/25μL；RNasin，20U/μL，提取的RNA占反转录总体积(1/5)，反转录总体积25μL。然后，42摄氏度，反应1个小时。
第四步，荧光同组PCR反应。
1)取12μL上述第三步中反转录的产物(余下部分作为备份冻存起来)，加入到300μL的上述第二步中组装的反应混合液Mix 1，混匀，分装到12个荧光PCR反应管中，每个管24μL，然后依次加入上述第二步稀释的12对引物，每管加1μL引物，进行荧光PCR反应。
2)荧光PCR反应条件为94摄氏度3分钟，1个循环；94摄氏度30秒-60摄氏度30秒-72摄氏度1分钟，4个循环；92摄氏度30秒-66摄氏度1分钟，72摄氏度30秒，36个循环，在72摄氏度时收集荧光信号；95摄氏度2分钟，再72摄氏度1分钟，再从72摄氏度开始测定PCR产物的Tm值，每隔0.5摄氏度收集1次荧光信号。
第五步，结果分析。
1)在检测未知样品前，先用这6种病原微生物的标准阳性样品按照上述过程各检测10次，计算各个荧光PCR特异性产物的Tm值和非特异性产物的Tm值。
2)在检测未知样品时，如果某一个对应A微生物的反应孔出现PCR阳性荧光信号，并且产物的Tm值也与预期的一致，则被测样品含有A微生物的可能性很大；此时如果另外一个也对应A微生物的反应孔也出现PCR阳性荧光信号，并且产物的Tm值也与预期的一致，那么可以认定被测样品含有A微生物；如果代表某一种微生物的两个反应孔都没有出现PCR阳性荧光信号，或者产物的Tm值都与预期的不一致，则说明样品中没有此种微生物。
权利要求
1.用“同组PCR”技术来建立同时检测多种微生物的技术，其特征是1)检测反应实际包含一组PCR反应，这一组PCR反应中各个PCR反应发生在不同的管子中，因而不相互干扰；2)所要检测的各种微生物分别对应着这一组PCR反应中某一个或几个PCR反应；3)各条引物设计恰当，使得这一组PCR反应可以共用同一台PCR仪器和同一个反应程序，甚至反应体系内除引物外其余成分都可一致；4)各个PCR反应所扩增的产物在50bp-1000bp之间，使得既能够通过核酸电泳来阅读检测结果，也能够通过荧光信号来阅读检测结果。
2.根据权利要求1所述的技术，其特征是检测对象为医学病原微生物。
3.根据权利要求1所述的技术，其特征是检测对象为动物病原微生物。
4.根据权利要求1所述的技术，其特征是检测对象为植物病原微生物。
5.根据权利要求1所述的技术，其特征是检测对象为鸡病原微生物。
6.根据权利要求1所述的技术，其特征是1)检测对象为鸡病原微生物；2)所用的引物含有以下12对共24条引物中任意一条或与其中任意一条相差不到3个碱基的引物AAGCCGAGATCGCGCAGAGAC，CCTTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC，GCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGT，CTCATAGACTCAGGCACTCCTTCCGT，AACCACTCAGGCAAGGTGCTCTCA，GCAAGGGCAACATGGTTCCTCA，TCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCAC，ACTCATCTGCTGTCTCATACGCAGTCA，ATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGG，GGTGGCTTTGGTCCTCCTAGTTTGAT，TAGTGTGGGTTGCTGCTAAGGGTGC，TCCCAACGGAAATTACCATCAGGTC，TGTCTTATTCCTCGTAGATAGGCACCCA，CCGCTTAGATATTGTGCAACAGGGA，GGATTTGGATATTTGCGAACAGGC，TGTACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCAT，TGTGTTAACTGCAGCACCGAAGTATTC，ACTGTAAACGATGGATGTTAAGTGTCGGA，CGCGTGAACGATGAAGGTCTTTTTAG，AATGGTACAGTCAAATTAATAGCTTTCCACTCTA，AAACCAACTAAAAGAGCAGCCCCTAAT，CCATTGATATTCAACACGTAATGCAAGT，CGAAGCAGCCAACTTAAAATTATCACAAC，GAAACTAAGTAGTTAGCCACAGTGTCAGCAC。
全文摘要
设计并通过试验确认了一种新的PCR技术。此技术被发明人命名为“同组PCR”技术，它可以用来同时检测多种微生物。“同组PCR”是一组PCR反应，这一组PCR反应中各个PCR反应发生在不同的PCR反应管中，但是各个PCR反应都采用同一台PCR仪器并共用同一个反应程序，甚至反应体系内除引物外其余成分都可一致，从而达到同时检测多种微生物的效果。此“同组PCR”技术可以有普通的“同组PCR”、“同组RT－PCR”、“同组荧光PCR”、“同组荧光RT－PCR”、“同组梯度PCR”、“同组梯度RT－PCR”等多种形式。本发明以同时检测鸡禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉支气管炎病毒、鸡败血霉形体、鸡嗜血杆菌等鸡6种病原微生物为例，具体说明用“同组PCR”技术同时检测多种微生物的过程。
文档编号C12Q1/04GK1657635SQ20041000713
公开日2005年8月24日 申请日期2004年2月19日 优先权日2004年2月19日
发明者陈继明, 王志亮 申请人:农业部动物检疫所