专利名称：一种细胞培养试剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说涉及一种培养试剂及其用途，更具体地说涉及一种细胞培养试剂及其用途。
背景技术：
干细胞是一种未分化细胞，有两个基本特性，一是具有自我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞。根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类。第一类是全能干细胞(totipotent stem cell)，即受精卵在受精后的第1小时内，能分裂为功能一致的全能细胞，将其中的任一细胞置于女性子宫内均可发育为胎儿；第二类是胚胎干细胞(Embryonic stemcell)，它具有广泛的分化潜能，能生成除胎盘外的机体所有的组织细胞；第三类是成体干细胞(adult stem cells)，是一种具有终生自我复制(identical copies)或自我更新(self-renewal)能力的未分化细胞，它分布于不同的组织，并可演变成为各种类型的组织细胞。
干细胞的培养分离方法可分为三种①有明确定位的干细胞，往往具有独特的生长方式，可以直接取其用于研究，或取其聚集区在培养试剂(也称培养基或培养液)中进行体外培养后进行分离和纯化。例如，骨髓中存在造血干细胞和骨髓间质干细胞两种干细胞，在骨髓的体外培养中，造血干细胞和骨髓呈悬浮集落生长，而骨髓间质干细胞则贴壁生长，这两种干细胞就很容易进行区分，而且也很容易通过更换培养试剂把两者分开。②有分子标记的干细胞。如外周血干细胞具有表面特异抗原，一般利用带有标记的抗体与之结合，然后用流式细胞仪(FACS)、磁珠分选仪(MACS)等分选设备进行分选，然后在培养试剂中进行体外培养，再用于治疗血液病或作进一步研究。③未发现有特异分子标记的干细胞，可利用条件培养试剂筛选。例如，神经干细胞需要在低血清、成纤维生长因子(FGF)及转换生长因子β(TGFβ)等多种因子存在的培养试剂中进行培养时才能生长，而大部分细胞对血清是依赖的，长期的培养结果使大部分的其他细胞死亡，而神经干细胞则得到了纯化和扩增。
有关干细胞培养所用的试剂，目前主要有来自于美国Stem cell公司的MesencultTM培养试剂(间质干细胞培养的专用试剂，间质干细胞即Mesenchymal stem cells，简称MSC)、美国GIBICO公司的高糖DMEM(即H-DMEM)培养试剂、低糖DMEM(即L-DMEM)培养试剂、α-MEM培养试剂、F12培养试剂和RPMI 1640培养试剂等。文献报道，骨髓MSC多用L-DMEM培养试剂培养，脐血MSC使用MesencultTM培养试剂或α-MEM培养试剂培养，成人外周血单核细胞(Monocytes)来源的多潜能干细胞(Pluripotent stem cells，简称PSC)使用的培养试剂是RPMI 1640培养试剂。这些培养试剂的基础培养试剂的主要成分包括氨基酸(amino acid)类、维生素或脂类、无机盐类、核酸类、葡萄糖类以及其他成分等，在此基础上再加上血浆、血清或细胞因子，得到该试剂的完全培养试剂。
成体干细胞是人体自身的PSC，是具有相同或相似的细胞表型、多系分化能力的亚全能干细胞群体，存留在多种组织中并能够分离出来，而且在适合的微环境(nich)下能分化产生具有特定形态和功能的细胞(特化细胞)，实现跨系统分化，即能够分化成多种组织细胞，例如，骨髓MSC、外周血单核细胞来源的PSC等。所谓微环境是指存在于干细胞所处的细胞基质中，对干细胞命运(是增殖还是分化)起调控作用的各种信号分子(生长因子及其受体、激素及介导分子)的总称(Watt FM，Hogana-Brigid LM.A bipotential precursor populationfor pancreas and liver within the embryonic endoderm.Science，2000，128871～811)。例如，骨髓MSC具有向骨细胞、软骨细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肺基质等组织细胞转化的能力(Goodell MA，Jackson KA，Majika SM，et al.Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.Ann NY Acad Sci，2001，938208，和Almeida-Porada G，Zanjani ED，Adult stem cell plasticity and methods of detection.Rev ClinExp Hematol，2001，526)，肌组织卫星细胞能在特定的环境下造血，神经干细胞能分化为肝、血液和骨骼肌等多种组织。但是，成体干细胞在分化为特化细胞之前常产生一种或几种祖细胞，然后由祖细胞再分化产生特化细胞。
脐血中的细胞成分一部分来源于新生儿机体，一部分来源于胎盘组织，其早期细胞含量远远高于成人外周血，因此理论上除已报道的CD34+造血干细胞和MSC外，应该还存在其它的成体干细胞，只是用目前所报道的细胞培养试剂及方法不易培养。如果改变目前所使用的试剂，在脐血中发现、分离出新的成体干细胞将变为可能。
此外，成体干细胞如骨髓MSC和外周血单核细胞来源的PSC在自身的移植过程中不存在排斥反应的问题，但骨髓的抽取势必造成组织损伤和病人的痛苦，而且其含量非常低，105～106个细胞中含有1个骨髓MSC；提取外周血单个核细胞(主要包括单核细胞、淋巴细胞和少量的其它细胞等)来源的PSC时，用血量较大，一般在500ml左右，对于多数患者显然是不可行的；更重要的是，不管是骨髓MSC，还是外周血单核细胞来源的PSC，分离纯化时间均较长(21～24天)，对于急需PSC治疗的患者，如果使用自身的骨髓或外周血，更是无法实现。因此，尽管成体干细胞移植是目前治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的有效方法之一，但其在临床治疗与研究方面的应用根本无法满足要求。所以寻找新的细胞培养试剂，用于发现、分离与体外大量扩增高纯度的成体干细胞，就显得非常重要。
但是，迄今为止，尚未见新的细胞培养试剂方面的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的细胞培养试剂，目的之二是公开其用途。
本发明的技术构思如下1.细胞作为有机体的最小组成单位，在其生长和增殖过程中需要必须的营养成分如氨基酸、维生素、无机盐以及某些细胞因子等，不同的细胞对某些营养成分的需求也不尽相同。目前常用的细胞培养试剂(如L-DMEM培养试剂、α-MEM培养试剂或RPMI 1640培养试剂等)的营养成分能够满足绝大多数细胞生长的需要，但对于某些细胞来讲，其中某些营养成分有可能不足甚至缺乏。如果调整(增加或补加)细胞培养试剂的某些基础营养成分，就有可能发现和培养出新的细胞。
2.常规的细胞培养是采用等渗的培养试剂，在原代细胞培养过程中往往几种细胞同时增长，不易获得较纯的目的细胞。研究表明，渗透压的改变可导致细胞容积的改变，激活细胞膜上的离子通道(Robert W，Wei G，Scott H.Blocking swelling-activated chloridecurrent inhibits mouse liver cell proliferation.J Physio 2001，532661和Shen MR，Droogmans G，Eggmont J，et al.Differential expression of volume-regulated anion channel during cell cycleprogression of human cervical cancer cells.J Physio.2000，529385)，这些改变与细胞增殖的调控密切相关。对造血干细胞的研究发现，渗透压对集落形成细胞有影响，当渗透压低于正常的17％或高于正常的23％时对集落的形成明显的影响，并提示低渗透压对造血细胞体外培养更有害(张孝兵等，影响脐血造血细胞体外培养与检测的因素，华东理工大学学报1999，2532)。因此，如果改变培养试剂的渗透压，就有可能实现对一些细胞增殖，而抑制另外一些细胞的生长或促进其凋亡，从而达到筛选细胞的目的。
本发明通过调整现有培养试剂的组分和含量，配制新的培养试剂，对以上构思进行了逐一实验验证。一是添加某些缺少的营养成分，如某些氨基酸、维生素或核苷酸等；二是在所培养细胞必需营养成分的基础上，再适当增加其含量；三是通过提高某些成分的含量，来提高培养试剂的渗透压，例如增加无机盐等的含量，可高出正常值的60％。下文所述的实验数据和结果均证实本发明的构思是正确的。为便于叙述，将该细胞培养试剂暂定名Potentculture培养试剂。
这里所述的Potentculture培养试剂是指Potentculture基础培养试剂，也就是说还可以加入血浆或血清类组分，配制成Potentculture完全培养试剂。
1000ml的Potentculture培养试剂主要包括1000～2000mg氨基酸类、8000～18000mg无机盐类、10～90mg维生素及脂类、30～100mg核酸类、800～1500mg葡萄糖类和100～200mg其它成分，各组分分别优选1400～1800mg、10000～15000mg、30～60mg、40～70mg、1000～1400mg和120～170mg，分别特别优选1682.9mg、12479.9mg、54.7mg、48mg、1200mg和147.1mg。
与1000ml的Potentculture培养试剂配套使用的血浆或血清类组分是指200～600ml的血浆，或200～600ml血浆和血清的混合物，优选使用400ml的血浆，或300ml血浆和100ml血清的混合物。
这里所述的氨基酸(amino acid)类包括必需氨基酸(essential amino acid)和非必需氨基酸(nonessential amino acid)，必需氨基酸是包括异亮氨酸(L-isoleucine)、亮氨酸(L-leucine)、赖氨酸(L-lysine·HCL)、蛋氨酸(L-methionine)、苯丙氨酸(L-phenylalanine)、色氨酸(L-tryptophan)、苏氨酸(L-threonine)或缬氨酸(L-valine)等；非必需氨基酸是包括丙氨酸(L-alanine)、精氨酸(L-arginine)、天冬酰胺(L-asparagine)、天冬氨酸(L-aspartic acid)、半胱氨酸(L-cysteine·HCL·H2O)、胱氨酸(L-cysteine)、谷氨酸(L-glutamic acid)、甘氨酸(glycine)、谷氨酰胺(L-glutamic)、组氨酸(L-histidine)、脯氨酸(L-proline)、丝氨酸(L-serine)或酪氨酸(L-tyrosine)等。
这里所述的无机盐类是包括CaCl2、Fe(NO3)3·9H2O、KCl、MgSO4·7H2O、NaCl、NaHCO3或NaH2PO4·2H2O等。
这里所述的维生素和脂类是包括抗坏血酸(L-ascorbic acid)、生物素(biotin)、偏多酸钙(D-Ca pantothenate)、氧化胆碱(choline chloride)、叶酸(folic acid)、肌醇(I-inositol)、菸酰胺(nicotinamide)、吡哆醛(pyridoxal-HCL)、核黄素(riboflavin)、硫氨酸(thiamine HCL)或维生素B12(vitamin B12)等。
这里所述的核酸类是包括腺苷(adenosine)、胞嘧啶核苷(cytidine)、脱氧腺苷(deoxyadenosine)、脱氧胞嘧啶核苷(deoxycytidine)、脱氧鸟嘌呤核苷(dexyguanosine)、鸟苷(guanosine)、胸腺嘧啶(thymidine)或尿嘧啶(uridine)等。
这里所述的葡萄糖类是包括葡萄糖(glucose)等。
这里所述的其它成分是包括硫辛酸(lipoic acid)、酚红(sodium phenol red)或丙酮酸盐(pyruvate)等。
这里所述的血浆或血清类组分是血浆或血浆和血清的混合物。这里所述的血浆是包括多个健康成人的混合血浆或多份脐血血浆的混合物等中的一种；优选三个以上健康人的混合血浆，或三份以上脐血血浆的混合物；进一步优选三个乙肝、丙肝、爱滋病病毒阴性的健康人的混合血浆，或三份脐血血浆的混合物。这里所述的血清是包括马血清、牛血清或人血清中的一种，优选新生马血清或胎牛血清。
Potentculture培养试剂对现有细胞培养试剂进行改进①与目前常用的单一细胞培养试剂相比较，添加了更丰富的营养成分，并且部分营养成分的含量也更高，有营养成分互补或叠加的作用，有利于目的细胞的生长；②作为一种筛选细胞的培养试剂，Potentculture培养试剂的渗透压要比等渗培养试剂高出40％～80％，有利于筛选目的细胞；③Potentculture完全培养试剂含有高浓度的血浆或血清成分如脐血浆，使细胞所处的培养环境更接近细胞自然生长环境，有利于目的细胞的快速扩增；④在大多数情况下，使用Potentculture完全培养试剂不需要额外添加细胞因子，因此使用Potentculture完全培养试剂培养细胞的成本低廉，与目前专用的干细胞培养试剂相比，便宜2～5倍。
本发明Potentculture培养试剂既能够用于现有细胞的一般培养，也能够专门用于目的细胞的筛选培养，特别是能够用于干细胞的一般培养和筛选培养；如果选择合适的细胞培养方法，还能够用于分离与体外大量扩增高纯度的成体干细胞，或者用于发现、分离新的成体干细胞。
具体实施例方式
本发明公开一种新的细胞培养试剂及其用途，以满足人们疾病治疗、科学研究、药物开发等方面的需要。
下面通过实施例来具体说明本发明的内容，所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1、Potentculture培养试剂配方之一1000ml的Potentculture培养试剂的具体组成和含量如下①氨基酸类1682.9mg以下所述的氨基酸产品未标记来源的，均来自美国Gibico公司。
A.8种必需氨基酸 592.4mg包括94.4mg的L-异亮氨酸(货号22405013，纯度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(货号12424016，纯度＞99％)、131.6mg的L-赖氨酸(货号12407011，纯度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美国Sigma公司，货号9625，纯度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(货号12409017，纯度＞99％)、15.7mg的L-色氨酸(货号12432019，纯度＞99％)、85.7mg的L-苏氨酸(货号12410015，纯度＞99％)和84.3mg的L-缬氨酸(货号12413019，纯度＞99％)。
B.非必需氨基酸 1090.5mg包括15mg的L-丙氨酸(货号21002019，纯度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(货号12401014，纯度＞99％)、30mg的L-天冬酰胺(货号12416012，纯度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(货号12417010，纯度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(货号11033016，纯度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(货号12402012，纯度＞99％)、45mg的L-谷氨酸(货号11048014，纯度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(货号12421012，纯度＞99％)、525.6mg的L-谷氨酰胺(货号21051024，纯度＞99％)、50.4mg的L-组氨酸(货号12422010，纯度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(货号21096029，纯度＞99％)、40.2mg的L-丝氨酸(货号22430011，纯度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(货号12412011，纯度＞99％)。
②无机盐类 12479.9mg包括240mg的CaCl2(中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％)、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O(中国大港亿中化工厂，分析纯，纯度＞98％)、480mg的KCl(中国天津市四通化工厂，分析纯，纯度≥99.5％)、240mg的MgSO4·7H2O(中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％)、7920mg的NaCl(中国天津市四通化工厂，分析纯，纯度≥99.5％)、3420mg的NaHCO3(中国河南焦作化工三厂，分析纯，纯度≥99％)和179.8mg的NaH2PO4·2H2O(中国上海化学试剂总厂所属上海试剂二厂，优级纯，纯度≥99.9％)。
③维生素和脂类 54.7mg以下所述的维生素和脂类产品未标记来源的，均来自美国Sigma公司。
30mg的抗坏血酸(货号7631，纯度＞99％)、0.06mg的D-生物素(货号4501，纯度＞99％)、0.8mg的维生素B12(美国Gibico公司，货号13100011，纯度＞99％)、3mg的吡哆醛(货号9755，纯度＞99％)、0.3mg的核黄素(货号4500，纯度＞99％)、3mg偏多酸钙(货号2625)、3mg氧化胆碱(货号7527，纯度＞98％)、3mg叶酸(货号8758，纯度98％)、5.5mg肌醇(货号7508，纯度99％)、3mg菸酰胺(货号0636，纯度95％)、3mg硫氨酸(货号3902，纯度97％)。
④核酸类 48mg以下所述的核酸类产品未标记来源的，均来自美国Sigma公司。
包括6mg的腺苷(货号9251，纯度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(货号4654，纯度≥99％)、6mg的脱氧腺苷(货号8668，纯度99％～100％)、6mg的脱氧胞嘧啶核苷(货号0776，纯度95％～98％)、6mg的脱氧鸟嘌呤核苷(货号0991，纯度99％～100％)、6mg的鸟苷(货号6264，纯度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美国Gibico公司，货号16495038，纯度＞99％)和6mg的尿嘧啶(货号3750，纯度＞99％)。
⑤葡萄糖 1200mg来源中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％。
⑥其它成分 147.1mg包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美国Sigma公司，货号1395，纯度99％)、15mg的酚红(美国Gibico公司，货号11160025，纯度＞99％)和132mg的丙酮酸盐(美国Sigma公司，货号5194)。
Potentculture培养试剂还可以添加血浆或血清类组分400ml，即400ml由三份脐血混合成的血浆，配成Potentculture完全培养试剂。
将本发明所配置的Potentculture培养试剂与其他的细胞培养试剂进行比较，能够发现在组分和含量方面均有明显差异(表1)，组分更加全面，并调整了组分的含量，使其渗透压明显高于其他的细胞培养试剂的渗透压(表2)，从而达到了所期望的筛选细胞的目的。
表1、Potentculture培养试剂与其他部分细胞培养试剂在组分和含量方面的比较
表2、Potentculture培养试剂与其他部分细胞培养试剂在渗透压方面的比较吸光度实际测定值(单位A)渗透势毫渗压组 别第1次 第2次 第3次 均值(单位Pma) (单位mosmol/L)Potentculture培养试剂 0.489 0.483 0.482 0.484 1.205 480L-DMEM培养试剂0.302 0.307 0.305 0.305 0.757 300A-MEM培养试剂 0.303 0.308 0.302 0.304 0.750 298RPMI 1640培养试剂 0.301 0.300 0.301 0.301 0.747 296MesencultTM培养试剂 0.302 0.305 0.306 0.305 0.750 299实施例2、Potentculture培养试剂配方之二1000ml的Potentculture培养试剂的具体组成和含量如下①氨基酸类 1682.9mg以下所述的氨基酸产品未标记来源的，均来自美国Gibico公司。
A.7种必需氨基酸576.7mg
包括94.4mg的L-异亮氨酸(货号22405013，纯度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(货号12424016，纯度＞99％)、131.6mg的L-赖氨酸(货号12407011，纯度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美国Sigma公司，货号9625，纯度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(货号12409017，纯度＞99％)、85.7mg的L-苏氨酸(货号12410015，纯度＞99％)和84.3mg的L-缬氨酸(货号12413019，纯度＞99％)。
B.非必需氨基酸 1090.5mg包括15mg的L-丙氨酸(货号21002019，纯度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(货号12401014，纯度＞99％)、30mg的L-天冬酰胺(货号12416012，纯度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(货号12417010，纯度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(货号11033016，纯度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(货号12402012，纯度＞99％)、45mg的L-谷氨酸(货号11048014，纯度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(货号12421012，纯度＞99％)、525.6mg的L-谷氨酰胺(货号21051024，纯度＞99％)、50.4mg的L-组氨酸(货号12422010，纯度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(货号21096029，纯度＞99％)、40.2mg的L-丝氨酸(货号22430011，纯度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(货号12412011，纯度＞99％)。
②无机盐类 12479.9mg包括240mg的CaCl2(中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％)、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O(中国大港亿中化工厂，分析纯，纯度＞98％)、480mg的KCl(中国天津市四通化工厂，分析纯，纯度≥99.5％)、240mg的MgSO4·7H2O(中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％)、7920mg的NaCl(中国天津市四通化工厂，分析纯，纯度≥99.5％)、3420mg的NaHCO3(中国河南焦作化工三厂，分析纯，纯度≥99％)和179.8mg的NaH2PO4·2H2O(中国上海化学试剂总厂所属上海试剂二厂，优级纯，纯度≥99.9％)。
③维生素和脂类 54.7mg以下所述的维生素和脂类产品未标记来源的，均来自美国Sigma公司。
30mg的抗坏血酸(货号7631，纯度＞99％)、0.06mg的D-生物素(货号4501，纯度＞99％)、0.8mg的维生素B12(美国Gibico公司，货号13100011，纯度＞99％)、3mg的吡哆醛(货号9755，纯度＞99％)、0.3mg的核黄素(货号4500，纯度＞99％)、3mg偏多酸钙(货号2625)、3mg氧化胆碱(货号7527，纯度＞98％)、3mg叶酸(货号8758，纯度98％)、5.5mg肌醇(货号7508，纯度99％)、3mg菸酰胺(货号0636，纯度95％)、3mg硫氨酸(货号3902，纯度97％)。
④核酸类 48mg以下所述的核酸类产品未标记来源的，均来自美国Sigma公司。
包括6mg的腺苷(货号9251，纯度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(货号4654，纯度≥99％)、6mg的脱氧腺苷(货号8668，纯度99％～100％)、6mg的脱氧胞嘧啶核苷(货号0776，纯度95％～98％)、6mg的脱氧鸟嘌呤核苷(货号0991，纯度99％～100％)、6mg的鸟苷(货号6264，纯度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美国Gibico公司，货号16495038，纯度＞99％)和6mg的尿嘧啶(货号3750，纯度＞99％)。
⑤葡萄糖 1200mg来源中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％。
⑥其它 147.1mg包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美国Sigma公司，货号1395，纯度99％)、15mg的酚红(美国Gibico公司，货号11160025，纯度＞99％)和132mg的丙酮酸盐(美国Sigma公司，货号5194)。
Potentculture培养试剂还可以添加血浆或血清类组分400ml，即300ml血浆(三个乙肝、丙肝、爱滋病病毒阴性的健康成人的混合血浆)、50ml胎牛血清(杭州四季青公司)和50ml新生马血清(美国GIBICO公司)，配成Potentculture完全培养试剂。
表3、Potentculture培养试剂与其他部分细胞培养试剂在组分和含量方面的比较
实施例3、使用Potentculture培养试剂筛选培养新的目的细胞使用本发明Potentculture完全培养试剂(见实施例2)培养细胞，能够进行筛选培养目的细胞，现把使用Potentculture完全培养试剂筛选培养目的细胞的具体方法叙述如下其他主要试剂的来源新生马血清、无钙镁Hank’s液均购自美国GIBCO公司，胎牛血清来源于杭州四季青公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。
①脐血单个核细胞的分离无菌条件下采集正常人新鲜脐血50～100ml(妇产科健康产妇)，肝素(50U/ml)抗凝；脐血收集后2h内进行处理新鲜脐血2500r·min-1离心15min，取白膜层(白细胞层)；再用含有2％胎牛血清的无钙镁Hank’s液按1∶3进行稀释，叠加在Ficoll-paque上层，3000r·min-1离心15min，取单个核细胞层，用含有2％胎牛血清的无钙镁Hank’s液洗涤备用。
②目的细胞的纯化及扩增培养将单个核细胞配成适当浓度的细胞溶液，并接种到Potentculture完全培养试剂中，接种浓度1×106～1×108个细胞/cm2；置于37℃、5％CO2、80％相对湿度的培养箱中培养5～7天，首先贴壁的为成熟的单核细胞，其形态主要为圆形或不规则形，弃去该贴壁的细胞；将未贴壁的悬浮细胞移种到24孔塑料培养板中，更换Potentculture完全培养试剂继续培养2～3天，所得的贴壁细胞中的成纤维样细胞即是所要筛选的目的细胞。该细胞经以后的进一步验证，被证明是一种新的成体干细胞。
从以上内容可以看出，使用Potentculture培养试剂培养细胞具有以下优点①本培养试剂具有筛选作用对贴壁的条梭状细胞具有促进作用，而对其他贴壁细胞具有明显的抑制作用，并促进其凋亡，能够得到非常均一的条梭状细胞，有可能得到新的成体干细胞。
②分离成功率高每份脐血均能够分离出PSC。而国外报道，大约只有25％的脐血中能够分离出MSC。
实施例4、使用Potentculture培养试剂筛选培养和大量扩增新的目的细胞使用本发明Potentculture完全培养试剂(见实施例1)培养细胞，能够进行筛选培养目的细胞，现把使用Potentculture完全培养试剂筛选培养目的细胞的具体方法叙述如下其他主要试剂的来源新生马血清、无钙镁Hank’s液均购自美国GIBCO公司，胎牛血清来源于杭州四季青公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。
①脐血单个核细胞的分离无菌条件下采集正常人新鲜脐血50～100ml(妇产科健康产妇)，肝素(50U/ml)抗凝；脐血收集后2h内进行处理新鲜脐血2500r·min-1离心15min，取白膜层(白细胞层)；再用含有2％胎牛血清的无钙镁Hank’s液按1∶3进行稀释，叠加在Ficoll-paque上层，3000r·min-1离心15min，取单个核细胞层，用含有2％胎牛血清的无钙镁Hank’s液洗涤备用。
②目的细胞的纯化及扩增培养将单个核细胞配成适当浓度的细胞溶液，并接种到Potentculture完全培养试剂中，接种浓度1×106～1×108个细胞/cm2；置于37℃、5％CO2、80％相对湿度的培养箱中培养5～7天，首先贴壁的为成熟的单核细胞，其形态主要为圆形或不规则形，弃去该贴壁的细胞；将未贴壁的悬浮细胞移种到24孔塑料培养板中，更换Potentculture完全培养试剂继续培养2～3天，所得的贴壁细胞中的成纤维样细胞即是所要筛选的目的细胞；再将该培养过程中的未贴壁细胞移种到另一培养器皿，留下的PSC3445继续培养。如此反复4～7次，可获得更大量的、高纯度的目的细胞。
③待目的细胞占培养面积的70％～80％左右时，用含有0.1g％EDTA的0.125％胰酶消化，按1∶2传代，这样能够得到更高纯度的目的细胞。该细胞经以后的进一步验证，被证明是一种新的成体干细胞。
从以上内容可以看出，使用Potentculture培养试剂培养细胞具有以下优点①本培养试剂具有筛选作用对贴壁的条梭状细胞具有促进作用，而对其他贴壁细胞具有明显的抑制作用，并促进其凋亡，能够得到非常均一的条梭状细胞。而我们对报道的其他方法进行重复，从实验结果看，所得到的细胞至少在两种以上，并非常有可能得到新的成体干细胞。
②分离成功率高每份脐血均能够分离出PSC。而国外报道，大约只有25％的脐血中能够分离出MSC。
③细胞的得率高利用该试剂得到PSC的量是常规方法分离得到PSC的量的8～12倍。
④得到高纯度PSC的时间短使用该试剂和本方法能够得到高纯度的PSC，而且时间短，一般在15天左右，报道的时间为21～24天，比目前报道的时间缩短了4～8天，对于治疗急性病更有利。
权利要求
1.一种细胞培养试剂，其特征在于，该细胞培养试剂的组分和配比是1000ml的该细胞培养试剂包括1000～2000mg氨基酸类、8000～18000mg无机盐类、10～90mg维生素及脂类、30～100mg核酸类、800～1500mg葡萄糖类和100～200mg其它成分。
2.根据权利要求1所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述各组分的配比是1000ml的该细胞培养试剂包括1400～1800mg氨基酸类、10000～15000mg无机盐类、30～60mg维生素及脂类、40～70mg核酸类、1000～1400mg葡萄糖类和120～170mg其它成分。
3.根据权利要求2所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述各组分的配比是1000ml的该细胞培养试剂包括1682.9mg氨基酸类、12479.9mg无机盐类、54.7mg维生素及脂类、48mg核酸类、1200mg葡萄糖类和147.1mg其它成分。
4.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的氨基酸类包括必需氨基酸和非必需氨基酸。
5.根据权利要求4所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的必需氨基酸是包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸或缬氨酸中的一种。
6.根据权利要求4所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的非必需氨基酸是包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸中的一种。
7.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的无机盐类是包括CaCl2、Fe(NO3)3·9H2O、KCl、MgSO4·7H2O、NaCl、NaHCO3或NaH2PO4·2H2O中的一种。
8.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的维生素和脂类是包括抗坏血酸、生物素、偏多酸钙、氧化胆碱、叶酸、肌醇、菸酰胺、吡哆醛、核黄素、硫氨酸或维生素B12中的一种。
9.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的核酸类是包括腺苷、胞嘧啶核苷、脱氧腺苷、脱氧胞嘧啶核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、鸟苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶中的一种。
10.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的葡萄糖类是葡萄糖。
11.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的其它成分是包括硫辛酸、酚红或丙酮酸盐中的一种。
12.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的1000ml的该细胞培养试剂包括94.4mg的L-异亮氨酸、94.4mg的L-亮氨酸、131.6mg的L-赖氨酸、26.9mg的蛋氨酸、59.4mg的L-苯丙氨酸、15.7mg的L-色氨酸、85.7mg的L-苏氨酸、84.3mg的L-缬氨酸、15mg的L-丙氨酸、126.2mg的L-精氨酸、30mg的L-天冬酰胺、18mg的L-天冬氨酸、60mg的L-半胱氨酸、43.2mg的L-胱氨酸、45mg的L-谷氨酸、48mg的L-甘氨酸、525.6mg的L-谷氨酰胺、50.4mg的L-组氨酸、24mg的L-脯氨酸、40.2mg的L-丝氨酸、64.9mg的L-酪氨酸、240mg的CaCl2、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O、480mg的KCl、240mg的MgSO4·7H2O、7920mg的NaCl、3420mg的NaHCO3、179.8mg的NaH2PO4·2H2O、30mg的抗坏血酸、0.06mg的D-生物素、0.8mg的维生素B12、3mg的吡哆醛、0.3mg的核黄素、3mg偏多酸钙、3mg氧化胆碱、3mg叶酸、5.5mg肌醇、3mg菸酰胺、3mg硫氨酸、6mg的腺苷、6mg的胞嘧啶核苷、6mg的脱氧腺苷、6mg的脱氧胞嘧啶核苷、6mg的脱氧鸟嘌呤核苷、6mg的鸟苷、6mg的胸腺嘧啶、6mg的尿嘧啶、1200mg葡萄糖、0.12mg的葡萄糖硫辛酸、15mg的酚红和132mg的丙酮酸盐。
13.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的1000ml的该细胞培养试剂还包括200～600ml血浆或血清类组分。
14.根据权利要求13所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的200～600ml血浆或血清类组分是包括200～600ml的血浆，或200～600ml血浆和血清的混合物中的一种。
15.根据权利要求14所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的200～600ml血浆或血清类组分是400ml的血浆，或300ml血浆和100ml血清的混合物中的一种。
16.根据权利要求13所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的血浆或血清类组分是包括血浆或血浆和血清的混合物中的一种，其中血浆是包括多个健康成人的混合血浆或多份脐血血浆的混合物中的一种，血清是包括马血清、牛血清或人血清中的一种。
17.根据权利要求16所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的血浆或血清类组分是包括三个以上健康人的混合血浆，或三份以上脐血血浆的混合物中的一种。
18.根据权利要求17所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的血浆或血清类组分是包括三个乙肝、丙肝、爱滋病病毒阴性的健康人的混合血浆，或三份脐血血浆的混合物中的一种。
19.根据权利要求16所述的细胞培养试剂，其特征在于，所述的血清是包括新生马血清或胎牛血清中的一种。
20.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂作为现有细胞一般培养的细胞培养试剂的应用。
21.根据权利要求20所述的细胞培养试剂作为干细胞一般培养的细胞培养试剂的应用。
22.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂作为专门用于目的细胞筛选培养的细胞培养试剂的应用。
23.根据权利要求22所述的细胞培养试剂作为专门用于干细胞筛选培养的细胞培养试剂的应用。
24.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂作为用于分离与体外大量扩增高纯度成体干细胞的细胞培养试剂的应用。
25.根据权利要求1～3任一项所述的细胞培养试剂作为用于发现、分离新的成体干细胞的细胞培养试剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种细胞培养试剂及其用途。该细胞培养试剂是现有细胞培养试剂组分和含量的多方改进，添加了现有培养试剂缺少的某些营养成分，并在所培养细胞必需营养成分的基础上，再适当增加其含量，还通过提高某些成分的含量，来提高该培养试剂的渗透压，能高达正常值的60％。因此，该培养试剂除了能够用于现有细胞的一般培养外，还能够专门用于目的细胞的筛选培养，特别是能够用于干细胞的一般培养和筛选培养；若选择合适的细胞培养方法，还能够用于分离与体外大量扩增高纯度的成体干细胞，或者用于发现、分离新的成体干细胞。
文档编号C12N5/08GK1560236SQ20041001689
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者赵书平, 沈茜, 于丽华, 张军, 徐玉莲, 李闻捷, 张俊洁 申请人:中国人民解放军第二军医大学