专利名称：细菌微量快速同步检测方法
技术领域：
本发明涉及一种微量快速同步检测细菌特别是病原菌的方法。
背景技术：
病原菌严重危害人们的身体健康和工农业生产。若要控制其所引起的病害，就应及时地诊断以采取相应的预防措施。近年来，PCR(聚合酶链反应)技术已应用于病原菌的检测。这些检测技术可分为两大类，分别为特异性引物PCR和非特异性引物PCR。前者依目的菌不同而有不同的引物序列，而不同引物序列又可能需要不同的扩增条件，若待检菌不明，则难以达到快速特异检测的目的(Peng X X，Zhang J Y，Wang S Y，et al，Immuno-capture PCRfor Detection of Aeromonas hydrophila.J.Microbiol.Methods.2002；49(3)335-338)后者一般根据细菌16S rRNA(核糖体核糖核酸)基因的保守性合成通用引物，所扩增的产物往往需要配合RFLP(限制性片段多态性分析)、SSCP(单链构象多态性)或序列分析才能进行确定，如所扩增产物来自2种以上病原菌，则很难直接得到结果。基于上述情况，我们设计利用抗体特异性识别待检菌，再采用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增(UPPCR)，建立了通用引物免疫捕捉法PCR技术，可以达到快速特异地检测混合物中病原菌的目的(CN02101983.5，厦门大学，用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法)。由于病原菌的种类较多，有些病原菌还有较多的亚型和血清型。采用抗体捕捉法UPPCR进行检测，则需要较多的材料。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种利用UPPCR-DGGE(通用引物PCR扩增-变性梯度凝胶电泳)微量快速同步检测多种细菌的方法。其技术方案是首先利用16S rRNA基因通用引物进行扩增，得到待检样本中所有细菌的该基因片段，然后进行DGGE分析以确定该细菌。
本发明的具体步骤如下1)制备模板2)PCR扩增(UPPCR)扩增引物为细菌核糖体核糖核酸基因通用引物；3)变性梯度凝胶电泳(DGGE)取扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，与标准对照比较，确定混合细菌的种类。
制备模板可采用直接热变性法或抗体捕捉后热变性法，所说的直接热变性法的步骤为取混合细菌培养物，加热至裂解，离心取上清液。所说的抗体捕捉后热变性法的步骤为取混合培养细菌液加入包被了针对2种以上的特异性抗体，加热至裂解，取上清液。然后进行UPPCR。
本发明采用UPPCR技术扩增细菌的16S rRNA基因片段，从而获得培养基中所有细菌相应基因片段序列的信息，再采用DGGE鉴定这些混合细菌的扩增产物，以确定检测的细菌。从而建立了一种采用UPPCR和DGGE相结合的微量快速同步鉴定混合细菌的检测技术。本发明的基本原理是细菌的16S rRNA基因具有高度的保守性，通用引物可扩增几乎所有细菌，因此可以获得待检标本中的所有细菌的信息。再依据DGGE分离的敏感性将混合细菌产物逐一分开，最后将其与标准图谱对照，则可以鉴定细菌，从而达到微量、快速、同步检测混合细菌尤其是病原菌的目的。
图1为直接法获取病原菌模板的UPPCR产物图谱及产物的DGGE分析结果。在图1中，A.UPPCR结果。M，分子量标准；1，荧光假单胞菌；2，鳗弧菌；3，河弧菌；4，嗜水气单胞菌；5，雷氏普罗威登斯菌；6，温和气单胞菌；7，6种菌混合。B.DGGE结果；1，荧光假单胞菌；2，鳗弧菌；3，河弧菌；4，嗜水气单胞菌；5，雷氏普罗威登斯菌；6，温和气单胞菌，7，6种菌混合。
图2为抗体法获取病原菌模板的UPPCR产物图谱及产物的DGGE分析结果。在图2中，A.UPPCR结果。M，分子量标准；1，志贺氏痢疾杆菌血清1型；2，鲍氏痢疾杆菌血清1型；3，福氏痢疾杆菌1a型；4，福氏痢疾杆菌3a型；5，4种菌混合。B.DGGE结果。1，志贺氏痢疾杆菌血清1型；2，鲍氏痢疾杆菌血清1型；3，福氏痢疾杆菌1a型；4，福氏痢疾杆菌3a型；5，4种菌混合。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1使用直接热变性法制备模板，将细菌接种于LB培养基，28℃摇床培养12～18h，作为种子菌，而后以1∶50(菌液∶培养基)比例接种于上述同种培养基，28～37℃摇床培养12～13h；取菌液0.5ml于无菌1.5ml离心管中，3,500转/分离心20min，弃上清；沉淀用蒸馏水洗一遍，加入无菌双蒸水0.8ml，混匀，于100℃水浴中煮10min；将水浴后的离心管置0℃冰浴中冷却，再用12,000rpm离心10min，吸取15～30μl(25μl PCR反应体系取15μl，50μl PCR反应体系取30μl)上清液作为PCR反应模板。
按顺序吸加2.5μl 10×缓冲液，0.5μl dNTP(核苷酸混合物，各10mM)，0.7μlMgCl2(25mM)，0.16μl引物混合液(引物15’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG，其中在5’端加了40个核苷酸的GC clamp，为的是稳定DGGE的分辨能力；引物25′-GCCCGGGAACGTATTCACCG)，0.2μl Taq酶(5u·μl-1)，及15μl模板，于各PCR管中，最后以无菌双蒸水补足至体积为25μl，各试剂充分混匀并稍加离心后收集于管底；将加样后的小离心管置于PCR扩增仪中，扩增程序为94℃ 10min，然后94℃ 1min，68℃min，72℃ 3min，此后每个循环退火温度降0.5℃，直至58℃，再以退火温度为58℃重复20个PCR循环，最后72℃ 10min；扩增后取PCR产物5μl，与适量加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖水溶液)混合，点样于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的2％琼脂糖凝胶中，80V电泳30min，随后观察结果。
DGGE将7L1×TAE(三羟甲基氨基甲烷乙酸电泳)缓冲液(三羟甲基氨基甲烷48.4g，冰醋酸11.42ml，0.5M乙二胺四乙酸二钠20ml pH8.0，加蒸馏水至200ml为50X缓冲液，高压灭菌，室温保存)倒入电泳槽中，把温度控制器架在电泳槽上，连好电线，将温度控制器上的开关、泵及加热器依次打开；将温度控制器设定到预定温度为56℃，温度变化率为200℃/h，以进行电泳液的预热；用干净的玻璃板、垫片组装一套16cm×16cm平行梯度凝胶夹层，并将其锁定在灌胶架上，使之保持水平；用两个配套的注射器分别与软管相连，在注射器上标“LO”与“HI”，分别用“LO”注射器和“HI”注射器吸入0％变性胶和70％变性胶(在70％变性胶中加入320μl变性梯度形成的指示液)；设定梯度混合器(cam wheel)的体积为14.5mL，将连有Y形管及16号针头的一对注射器分别固定在梯度混合器的两边；转动齿轮，将胶液灌到夹层中，插上干净的梳子，待凝；凝后，拔去梳子，取下夹层；两块夹层分别固定于电泳槽中，在上槽中倒入350ml 1×TAE缓冲液，按正确方向放上温度控制仪，再打开电源开关、泵及加热器，使系统达到设定的56℃；用5μl PCR扩增样品与等量2×凝胶加样染色液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖水溶液)混合，加样在清洗过的加样孔中(为提高敏感性可以通过浓缩处理提高PCR产物的浓度)；调电压为20V 20min，然后100电泳10～12h，同时打开温度控制器，使系统维持在56℃；电泳完成后，关闭电源及加热系统，取下夹层，取出胶块；将胶放入装有250ml 1×TAE缓冲液及25μl 0mg/ml溴化乙啶的染色盘中，染色5～10min；染色以后，将胶移到装有250ml 1×TAE缓冲液的盘中，脱色5～20min；将染色后的胶放在多色凝胶成像系统中扫描，保存结果。
实施例2与实施例1类似，其不同在于采用抗体捕捉后热变性法制备模板，将能与多种细菌反应的抗体(如型、群特异性抗体)用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至96孔酶联反应板各孔(1～10μg/ml)，每孔50μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入50μl 10％小牛血清，36～38℃封闭1hr，甩干；每孔加入细菌液体培养液20～40μl(25μl PCR反应体系加20μl，50μl PCR反应体系加40μl)，于36～38℃温育1～2h，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min。每孔加入20～40μl(与所加细菌溶液体积一致)无菌双蒸水，沸水浴加热8～10min，吸取15～30μl(25μl PCR反应体系取15μl，50μL PCR反应体系取30μl)裂解液作为PCR反应模板。
实施例3细菌模板制备采用荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，河弧菌(Vibrio fluvialis)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)，温和气单胞菌(Aeromonas sobria)，为本申请人保存菌种。将上述细菌分别和混合接种于LB培养基，共7管，28℃摇床培养12～18h，作为种子菌。而后以1∶50(菌液∶培养基)比例接种于上述同种培养基，28℃摇床培养12～13h；取菌液0.5ml于新的无菌1.5ml小离心管中，3,500转/分离心20min，弃上清；沉淀用蒸馏水洗一遍，加入无菌双蒸水0.8ml，混匀，于100℃水浴中煮10min；将水浴后的小离心管置于0℃冰浴中冷却，再用12,000rpm离心10min，吸取15μL上清液作为PCR反应模板。
UPPCR取无菌的新枪头按顺序吸加2.5μl 10×缓冲液，0.5μl dNTP(各10mM)，0.7μl MgCl2(25mM)，0.16μl引物混合液(引物15′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG+引物25′-GCCCGGGAACGTATTCACCG)，0.2μl Taq酶(5u·μl-1)，及15μl模板，最后以无菌双蒸水补足至终体积为25μl，各试剂充分混匀并稍加离心后收集于管底；将加样后的小离心管置于PCR扩增仪中，设定程序为94℃ 10min，然后94℃ 1min，68℃min，72℃ 3min，此后每个循环退火温度降0.5℃，直至58℃，再以退火温度为58℃重复20个PCR循环，最后72℃ 10min；扩增完成后取下离心管。取PCR产物5μl，与适量加样缓冲液混合，点样于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的2％琼脂糖凝胶中，80V电泳30min，随后观察结果。
DGGE按实施例1的方法进行，每管点1个样。
实施例4细菌模板制备采用志贺氏痢疾杆菌血清1型(S.dysenteriae serotypel)，鲍氏痢疾杆菌血清1型(S.boydii serotype 1)，福氏痢疾杆菌1a型(S.flexneri serotype 1a)，福氏痢疾杆菌3a型(S.flexneri serotype 3a)，均为本申请人保存菌种。将上述4种细菌分别和混合接种于LB培养基，共5管，37℃摇床培养12～18h，作为种子菌。而后以1∶50(菌液∶培养基)比例接种于上述同种培养基，37℃摇床培养12～13h过夜取菌液20μl加入包被了痢疾杆菌抗体(此抗体对所有痢疾杆菌均可以发生特异结合)的酶标板中，于36～38℃温育1h，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min。每孔加入20μl无菌双蒸水，沸水浴加热8～10min，吸取15μl裂解液作为PCR反应模板。
UPPCR同实施例3。
DGGE同实施例3。
权利要求
1.细菌微量快速同步检测方法，其特征在于步骤为1)制备模板；2)PCR扩增扩增引物为细菌核糖体核糖核酸基因通用引物；3)变性梯度凝胶电泳取扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，与标准对照比较，确定混合细菌的种类。
2.如权利要求1所述的细菌微量快速同步检测方法，其特征在于所说的制备模板采用直接热变性法或抗体捕捉后热变性法，所说的直接热变性法的步骤为取混合细菌培养物，加热至裂解，离心取上清液；所说的抗体捕捉后热变性法的步骤为取混合培养细菌液加入包被了针对2种以上的特异性抗体，加热至裂解，取上清液，然后进行UPPCR。
3.如权利要求1所述的细菌微量快速同步检测方法，其特征在于所说的扩增引物为5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG和5′-GCCCGGGAACGTATTCACCG引物。
4.如权利要求2所述的细菌微量快速同步检测方法，其特征在于所说的直接热变性法为将细菌接种于LB培养基，28℃摇床培养12～18h，作为种子菌，而后以1∶50(菌液∶培养基)比例接种于上述同种培养基28℃或37℃摇床培养12～13h；取菌液0.5ml于无菌1.5ml离心管中，3,500转/分离心20min，弃上清；沉淀用蒸馏水洗一遍，加入无菌双蒸水0.8ml，混匀，于100℃水浴中煮10min；将水浴后的离心管置0℃冰浴中冷却，再用12,000rpm离心10min，吸取15～30μl上清液作为PCR反应模板。
5.如权利要求2所述的细菌微量快速同步检测方法，其特征在于所说的抗体捕捉后热变性法将能与多种细菌反应的抗体用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至96孔酶联反应板各孔1～10μg/ml，每孔50μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液洗板3次，每次3～5min；每孔加入50μl 10％小牛血清，36～38℃封闭1hr，甩干；每孔加入细菌液体培养液20～40μl，于36～38℃温育1h，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min，每孔加入20～40μl无菌双蒸水，沸水浴加热8～10min，吸取15～30μl裂解液作为PCR反应模板。
6.如权利要求1所述的细菌微量快速同步检测方法，其特征在于所说的PCR扩增为按顺序吸加2.5μl 10×缓冲液，0.5μl dNTP，0.7μl MgCl225mM，0.16μl引物混合液，引物15’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGG CGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG，其中在5’端加了40个核苷酸的GC clamp，为的是稳定DGGE的分辨能力；引物25′-GCCCGGGAACGTATTCACCG，0.2μl Taq酶，及15μl模板，于各PCR管中，最后以无菌双蒸水补足至体积为25μl，各试剂充分混匀并稍加离心后收集于管底；将加样后的小离心管置于PCR扩增仪中，扩增程序为94℃ 10min，然后94℃ 1min，68℃min，72℃ 3min，此后每个循环退火温度降0.5℃，直至58℃，再以退火温度为58℃重复20个PCR循环，最后72℃ 10min；扩增后取PCR产物5μl，与加样缓冲液混合，点样于含0.5μg/mL溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶中，80V电泳30min，随后观察结果。
7.如权利要求1所述的细菌微量快速同步检测方法，其特征在于所说的DGGE为将7L1×三羟甲基氨基甲烷乙酸电泳缓冲液倒入电泳槽中，把温度控制器架在电泳槽上，连好电线，将温度控制器上的开关、泵及加热器依次打开；将温度控制器设定到预定温度为56℃，温度变化率为200℃/h，以进行电泳液的预热；用干净的玻璃板、垫片组装一套16cm×16cm平行梯度凝胶夹层，并将其锁定在灌胶架上，使之保持水平；用两个配套的注射器分别与软管相连，在注射器上标“LO”与“HI”，分别用“LO”注射器和“HI”注射器吸入0％变性胶和70％变性胶；设定梯度混合器的体积为14.5mL，将连有Y形管及16号针头的一对注射器分别固定在梯度混合器的两边；转动齿轮，将胶液灌到夹层中，插上干净的梳子，待凝；凝后，拔去梳子，取下夹层；两块夹层分别固定于电泳槽中，在上槽中倒入350ml 1×TAE缓冲液，按正确方向放上温度控制仪，再打开电源开关、泵及加热器，使系统达到设定的56℃；用5μl PCR扩增样品与等量2×凝胶加样染色液混合，加样在清洗过的加样孔中；调电压为20V 20min，然后100电泳10～12h，同时打开温度控制器，使系统维持在56℃；电泳完成后，关闭电源及加热系统，取下夹层，取出胶块；将胶放入装有250ml1×TAE缓冲液及25μl 0mg/ml溴化乙啶的染色盘中，染色5～10min；染色以后，将胶移到装有250ml 1×TAE缓冲液的盘中，脱色5～20min；将染色后的胶放在多色凝胶成像系统中扫描，保存结果。
全文摘要
细菌微量快速同步检测方法，涉及一种微量快速同步检测细菌的方法。步骤为制备模板；PCR扩增扩增引物为细菌核糖体核糖核酸基因通用引物；变性梯度凝胶电泳取扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，确定种类。采用UPPCR技术扩增细菌的16S rRNA基因片段，获得培养基中所有细菌相应基因片段序列的信息，再采用DGGE鉴定混合细菌的扩增产物，以确定检测的细菌。建立采用UPPCR和DGGE相结合的微量快速同步鉴定混合细菌的检测方法。达到微量、快速、同步检测混合细菌尤其是病原菌的目的。
文档编号C12Q1/68GK1699596SQ20041004543
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月19日 优先权日2004年5月19日
发明者彭宣宪, 纪念念, 彭博, 王三英 申请人:厦门大学