专利名称：一种华根霉生产新型纤溶酶及其方法
技术领域：
本发明属于生物制药生产技术领域，特别涉及一种华根霉生产新型纤溶酶及其方法。
背景技术：
心脑血管疾病，如急性心肌梗塞和脑血栓等，是引起人类死亡的三大疾病之一，其发病率有增无减。血栓的主要成分是血纤维蛋白，溶栓疗法是通过药物溶解血栓中的主要基质血纤维蛋白，或激活血液中无活性的血浆纤溶酶原，形成有活性的纤溶酶来催化血纤维蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。溶栓疗法被誉为20世纪心脑血管学方面的十大发现之一，受到各国的高度重视。开发高效的溶栓药物在临床上具有重要意义。
目前正式批准且在临床上最常使用的溶栓剂为尿激酶(UK)、链激酶(SK)、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、重组组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scu-PA)。其中UK和SK是纤维蛋白非特异溶栓药，它们虽然具有一定的溶栓效果，但无纤维蛋白的特异性，使用中可能会造成血纤溶酶过量激活，导致纤维蛋白原过量降解，引发全身出血，同时SK还具有很强的免疫原性，重复使用易引起变态反应。其余四种是纤维蛋白特异性溶栓药，rt-PA延长了t-PA在血液中的半衰期，不伴有全身性的出血倾向，是目前公认的最有效的纤维蛋白特异性溶栓剂。但它也只能使55％病人冠脉堵塞再通、溶栓时间较长、用量大、价格昂贵APSAC引起的出血不良反应少，但因含有SK，故具有抗原性，可致过敏反应；scu-PA有较强的溶栓作用，不具抗原性，也无过敏反应，但可致出血并发症。
由此可见，急需更加高效、安全、副作用小和相对便宜的溶栓药物。
发明内容
本发明的目的在于采用先进的微生物培养技术将华根霉在特定条件下培养，产生一种新的性能优良的纤溶酶，并利用现代分离技术将该纤溶酶分离提纯，并验证其酶学性质。
方法为以微生物TK317(经南开大学生命科学院鉴定为华根霉)为菌种，经液体发酵方法培养后产生纤溶酶；将液体发酵液进行膜过滤除去菌体和固形物，收集滤过液，再采用物理和生物化学方法对含纤溶酶的上清液进行脱色、盐析，并用现代层析方法合理组合，对产生的纤溶酶进行提纯，使酶纯度达到色谱纯。
具体包括下列步骤1.以华根霉为菌种，经斜面、种子、发酵生产新型纤溶酶。
2.培养基斜面保存使用葡萄糖豆汁培养基，斜面菌种在28～30℃培养5d；发酵培养基采用含豆粕(膨化大豆、大豆、豆渣)、麸皮、胰蛋白胨和无机盐的培养基，培养时间为60～72h。
3.培养方法斜面菌种→一级液体种子→液体发酵培养；需要说明的是华根霉的培养可以采用多种条件，具体选择下述一种条件(1)液体培养含4％～6％麸皮水、5％～8％豆粕、0.1～0.25％氯化铵、0.2～0.3％硝酸钠和1％～2、5％胰蛋白胨，pH4.3～6.0接种量10％～20％，28～30℃，振荡培养60～72h。
(2)液体培养含5％～6％麸皮水和3％～4％豆粕水解液，磷酸氢二铵0.2％～0.4％，硝酸钠0.4％～0.5％，pH5.0～6.5。接种量10％～20％，28～30℃振荡培养60～72h。
4.酶液的澄清；使用适宜孔径的膜微滤去除菌体和固形物。
5.纤溶酶的粗提纯；经30-70％硫酸铵分级盐析，再超滤除去盐及小分子，大分子，得到较纯的酶液6.含纤溶酶液体可以采用多种阴离子交换树脂进行脱色，具体选择下述一种条件(1)D296强阴离子交换树脂用强碱再生，收集未吸附部分。
(2)D301弱阴离子交换树脂用强碱再生，收集未吸附部分。
脱色过程中始终要控制pH值在7.0-8.0。
7.纤溶酶的精提纯脱色后的含纤溶酶的液体，采用超滤的方法脱盐，除去多余的小分子和大分子。离子交换色谱或凝胶过滤色谱方法对酶进行精提纯。
纤溶酶的精提纯采用下述方法，得到色谱纯的纤溶酶。
(1)选择截留分子量分别为20kDa和40kDa的超滤膜，柱压0.1Mpa。
(2)SP-sepharose HP离子交换层析技术上样后用0～1M中性盐溶液梯度洗脱。
(3)Sephacryl S-100凝胶过滤色谱，收集有活性成分的部分。
新型纤溶酶组成通过测定，新型纤溶酶的N-末端12个氨基酸残基的序列为NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly分子量为30500Da，等电点8.5±0.2。
所用的微生物菌种——华根霉TK317是从我国南方小酒药中分离的，菌种遗传性能稳定，而且其代谢产生的纤溶酶安全性好，无毒性。
华根霉生产新型纤溶酶的性质该纤溶酶具有优良的性能，其适宜作用pH范围为7.0～9.0，与人体生理pH吻合好；分子量小，用药剂量小；有直接溶解血栓和激活人纤溶酶原的双重作用，溶栓效果好；同时降解血栓中的主要成分纤维蛋白的α、β和γ链，这一特点与人纤溶酶非常相似；最适作用温度45℃，人体体温37℃为适宜作用温度，52℃下0.5h酶活力保持60％，热稳定性好，易于贮存；底物专一性好，只分解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAa(纳豆激酶的最适生色底物)，分解的米氏常数Km为0.23mM；不作用于凝血酶、尿激酶和胰蛋白酶的特异性生色底物；低浓度的Cu’2+、Co2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、、Mg2+、、Mn2+、Na+、Zn2+不影响血栓溶酶的活性。
具体实施例方式
实施例11、菌种华根霉TK3172、培养基和培养方法斜面保存使用葡萄糖豆汁培养基，斜面菌种在28～30℃培养5d；液体发酵采用的培养基含5％麸皮水、6％豆粕、0.1％氯化铵、0.2％硝酸钠和1％～2.5％胰蛋白胨，pH4.5，接种量10％～20％，28～30℃震荡培养60～72h。
3、酶的粗提纯得到的纤溶酶发酵液，微滤除去菌体和固形物；用D301阴离子交换树脂对含纤溶酶的液体进行脱色；用30％～70％饱和度的硫酸铵进行分步盐析，收集沉淀。
4、酶的精提纯顺次超滤去盐和部分杂质蛋白；用配基为磺酸丙基的填料进行离子交换层析，样品用0～1M盐梯度洗脱；最后冷冻干燥得到纤溶酶产品。
实施例2培养基和培养方法斜面保存使用葡萄糖豆汁培养基，斜面菌种在28～30℃培养5d；液体发酵培养基含5.6％麸皮水和5.3％豆粕水解液(预先用0.1N的HCl水解)，1％～2.5％胰蛋白胨，接种量10％～20％，28～30℃震荡培养60～72h。含纤溶酶液的脱色用D296阴离子交换树脂，用65％的乙醇沉淀纤溶酶。其它步骤同实施例1。
实施例3培养基和培养方法步骤同实施例1。纯化后的纯酶测定蛋白质N-末端氨基酸残基序列，得到如下结果NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly测定其分子量为30.5kDa；等电点为8.5。低浓度的Cu’2+、Co2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、、Mg2+、、Mn2+、Na+、Zn2+不影响血栓溶酶的活性。
实施例4培养基和培养方法步骤同实施例1。取微滤后得到的菌体，用无菌水洗涤2-4次。迅速于液氮中冷冻。使用Trizol法提取菌体总RNA，使用宝生物(大连)公司的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)试剂盒进行RT-PCR，得到单一目的基因条带，与质粒PUC19连接，转化大肠杆菌JM109，得到有纤溶活性的转化子，送检测序。
权利要求
1.一种华根霉生产新型纤溶酶，其特征为纤溶酶的N-末端12个氨基酸残基的序列为NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly，分子量为30500Da，等电点8.5±0.2；pH范围为7.0～9.0。
2.一种如权利要求1所述的华根霉生产新型纤溶酶的生产方法，包括下列步骤a对产生菌华根霉TK317进行斜面、种子、发酵三级培养；b从发酵液中分离纯化得到纤溶酶。
3.如权利要求2所述的华根霉生产新型纤溶酶的生产方法，其特征是所述的步骤a)是将华根霉TK317在葡萄糖豆汁斜面培养基上28～30℃培养5天，一级种子培养使用麸皮水和蛋白胨培养基，培养11小时；液体发酵培养基采用麸皮水、豆粕水解物、无机盐类；或采用麸皮、豆粕、胰蛋白胨和无机盐，培养时间60-72小时，得到发酵液。
4.如权利要求3所述的华根霉生产新型纤溶酶的生产方法，其特征是所述的采用华根霉为菌种，液体培养的具体选择条件采用下述的(1)或(2)的一种方法(1)液体培养含4％～6％麸皮水、5％～8％豆粕、0.1～0.25％氯化铵、0.2～0.3％硝酸钠和1％～2.5％胰蛋白胨，pH4.3～6.0接种量10％～20％，28～30℃，振荡培养60～72h。(2)液体培养含5％～6％麸皮水和3％～4％豆粕水解液，磷酸氢二铵0.2％～0.4％，硝酸钠0.4％～0.5％，pH5.0～6.5。接种量10％～20％，28～30℃振荡培养60～72h。
5.如权利要求2所述的华根霉生产新型纤溶酶的生产方法，其特征是所述的步骤b)是将制备的粗酶液采用微滤除去菌体等杂质，经40-70％硫酸铵分级盐析，再超滤除去盐及小分子，大分子，得到较纯的酶液；采用离子交换色谱或凝胶过滤色谱获得电泳纯的酶；再将含纤溶酶液体采用多种阴离子交换树脂进行脱色。
6.如权利要求5所述的华根霉生产新型纤溶酶的生产方法，其特征是所述的采用阴离子交换树脂方法具体选择下述的(1)或(2)的一种方法(1)D296强阴离子交换树脂用强碱再生，收集未吸附部分；(2)D301弱阴离子交换树脂用强碱再生，收集未吸附部分；任何一种方法的脱色过程中始终要控制pH值在7.0-8.0。
7.如权利要求5或6所述的华根霉生产新型纤溶酶的生产方法，其特征是所述的获得电泳纯的酶再进行精提纯，方法如下(1)选择截留分子量分别为20kDa和40kDa的超滤膜，柱压0.1Mpa；(2)SP-sepharose HP离子交换层析技术上样后用0～1M中性盐溶液梯度洗脱；(3)Sephacryl S-100凝胶过滤色谱，收集有活性成分的部分。
全文摘要
本发明涉及从一株华根霉发酵物中提取新型溶血栓药物纤溶酶。该纤溶酶的分子量30.5kDa，等电点8.5，有直接溶解血栓和激活人纤溶酶原的双重作用。生产方法为a对产生菌华根霉TK317进行斜面、种子、发酵三级培养；b从发酵液中分离纯化得到纤溶酶。产品安全无毒、价格低廉。以廉价的农副产品豆粕、膨化大豆和麸皮为主要原料，采用液体发酵方法生产；纯化方法中包括微滤除菌体、离子交换树脂脱色、盐析、超滤除盐和杂质蛋白，离子交换层析纯化。工艺流程短，成本低，工业化生产效率高，具有开发价值。
文档编号C12P21/02GK1587399SQ20041007180
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月3日 优先权日2004年9月3日
发明者路福平, 杜连祥, 蔡兴旺, 张清忠, 刘晓兰, 迟文鹤 申请人:天津科技大学, 天津振和生物工程有限公司