专利名称：利用角朊细胞干细胞和牙间充质进行牙齿再生的技术的制作方法
技术领域：
本发明属于器官再生技术，具体说，本发明涉及一种利用角朊细胞干细胞和牙间充质进行牙齿再生的技术。
背景技术：
近年来，器官工程学与组织工程学是生物技术领域中发展很快的一门新兴学科。它的发展将使在常规医学技术下无法进行的人体遗传缺陷、组织的修复和器官再生等医学实践成为现实。就器官的组织结构和发育分化过程而言，牙齿是相对比较简单的一种器官。牙齿的发育与其它器官相比有着与众不同的特点，表现在牙齿是人体唯一能在成体中再次发育的器官。从器官发育的角度出发，牙齿的再生要比身体中其它器官的再生更为容易，更有可能实现。
牙齿的发生过程与其它器官的发生相似，也是由牙上皮细胞与其下方的牙间充质之间的相互诱导而发生的。诱导牙齿发生的信号首先出现在上皮，这种信号在上皮中表达是舜时的，随即牙上皮细胞诱导潜能转移到其下方的间充质中，在小鼠胚胎发育过程中，这种转移发生在E12.5天后，将这时的牙间充质与非牙上皮组织重组则能诱导该上皮形成牙齿的结构。目前的研究表明，在体外利用牙上皮与牙间充质进行组织重组或重聚，经培养能形成牙齿。利用牙上皮虽能诱导牙齿的发生，但牙上皮来源有限，极大地限制了牙齿再生技术的应用。2002年，任少强等(任少强等，第三军医大学学报，2002年11期)和李建福等(李建福等，解放军医学杂志，2002年5期)公开了成熟的角朊细胞干细胞的大量培养技术，使利用角朊细胞干细胞替代牙上皮进行牙齿再生为可能。
本发明的目的是利用材料来源极为丰富的角朊细胞干细胞替代牙上皮进行牙齿的再生。
发明内容
本发明要提供一种利用角朊细胞干细胞和牙间充质进行牙齿再生的技术。本发明的技术方案包括如下步骤1、角朊细胞干细胞与牙间充质重组 取E12.5天后的裸鼠胚胎磨牙牙胚，经终浓度为0.8U/ml的中性蛋白酶(Dispase)消化液消化后分离牙上皮与牙间充质，将分离到的牙间充质转移到滤膜上。体外培养的角朊细胞干细胞组织经中性蛋白酶(Dispase)消化后，切成小块，取一组织块覆盖在牙间充质表面构成重组块。
2、重组块的体外培养 将步骤1中重组块置于组织培养皿中，向组织培养皿中加入可淹没组织块三分之一高度的含10-20％胎牛血清的DMEM培养液，并置于37℃ 5％ CO2培养箱中过夜培养。
3、重组块的移植 将步骤2中过夜培养的重组块移植到裸鼠体内的肾囊膜，经培养4-6周后，移植的重组块逐步发育形成牙齿。
裸鼠体内肾囊膜只是提供了适合的环境(如血液供应)让其发育，因此，重组植块移植到牙床中培养，也将能正常发育。
本发明可应用于哺乳类生物牙齿的再生，特别是人类牙齿的再生。例如将重组植块移植到人的牙床内培养，将能进行牙齿再生。
本发明的优点在于利用角朊细胞干细胞进行牙齿再生，角朊细胞干细胞可以从组织中分离培养，也可根据公开的技术手段通过体外大量培养得到，大大扩大了材料的来源，方便推广使用。
具体实施例方式
以下具体实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明范围。
下面给出实施例1.角朊细胞干细胞与牙间充质的重组在无菌条件下，从E13.5天小鼠胚胎头部中分离下颌，并置于含无菌PBS(10mM磷酸缓冲液，2.7mM KCl 0.137M NaCl pH7.4)的培养皿中，取磨牙牙胚。
以终浓度为0.8U/ml的中性蛋白酶(Dispase)消化液于37℃消化牙胚40-60min。吸弃消化液，用含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。用尖镊小心分离牙胚上皮与牙间充质。
将滤膜(0.22um Millipore滤膜)剪成10×10mm大小，并置于组织培养皿的金属网架上，添加10％胎牛血清的DMEM至稍微漫过网架。用细口长颈吸管将间充质转移到滤膜上，将原来与牙上皮接触的一面向上。
向培养成片状的角朊细胞干细胞中加入3U/ml中性蛋白酶，并于37℃消化10-15min，用10％胎牛血清的DMEM终止消化。将已消化成的角朊细胞干细胞切成3×3mm大小的小块，将其中一小块角朊细胞干细胞转移到间充质上，注意应使角朊细胞干细胞片层尽量展开以覆盖牙间充质。
2.重组块的体外培养向含有重组块的组织培养皿中加入10-20％胎牛血清的DMEM至可淹没组织块三分之一高度为止，组织培养皿的外槽添加适量的PBS。将重组块置于37℃ 5％CO2的培养箱中培养过夜。
3、重组块的移植以2％戊巴比妥钠麻醉BALB/C裸鼠，切开皮肤，暴露肾囊膜，用尖镊挑起并用尖针刺破肾囊膜，以圆头玻棒将肾囊膜从肾实质上分离开。将过夜培养含重组块的滤膜浸入10％胎牛血清的DMEM中，小心的将重组块剥离滤膜。用细口长颈吸管将重组块转移到肾囊膜的缺口中，挑起肾囊膜，用圆头玻棒将重组块推入肾囊膜下。
缝合皮肤切口，饲养裸鼠4-6周后，可见钙化并呈钝头圆锥样的植块。植块经组织切片，HE染色后，可见植块周边骨化组织，中间为含牙本质、牙釉质及牙髓的完整牙齿结构。
权利要求
1.一种牙齿再生方法，其特征在于包括如下步骤A.角朊细胞干细胞与牙间充质的重组取磨牙牙胚，经中性蛋白酶消化后分离牙上皮与间充质，将分离到的间充质转移到滤膜上，体外培养的角朊细胞干细胞组织经中性蛋白酶消化后，切成3×3mm大小的小块，取一组织块覆盖在间充质表面；B.重组块的体外培养将步骤A中重组的组织块置于组织培养皿中，向组织培养皿中加入可淹没组织块三分之一高度的DMEM培养基，并置于37℃5％CO2培养箱中过夜培养；C.重组植块的移植将步骤B中过夜培养的重组植块移植到裸鼠体内，经培养4-6周后，移植块形成牙齿。
2.根据权利要求1所述的牙齿再生方法，其特征在于消化液为终浓度0.8U/ml的中性蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的牙齿再生方法，其特征在于培养组织块的DMEM培养基含10～20％胎牛血清。
全文摘要
本发明属于器官再生技术，具体说，本发明涉及一种利用角朊细胞干细胞和牙间充质进行牙齿再生的技术。其特征是取小鼠胚胎磨牙牙胚，经消化液消化后，分离间充质，将角朊细胞干细胞覆盖在牙间充质表面构成重组块，加入含胎牛血清的DMEM培养液过夜培养。最后将重组块移植到裸鼠体内的肾囊膜，经培养4－6周后，移植的重组块逐步发育形成牙齿。本发明利用角朊细胞干细胞进行牙齿的再生，角朊细胞干细胞可以从组织中分离培养，也可根据公开的技术手段通过体外大量培养得到，大大扩大了材料的来源，因此，材料来源极为丰富，方便推广使用。本发明可应用于哺乳类生物牙齿的再生，特别是人类牙齿的再生。如将重组植块移植到人的牙床内培养，将能进行牙齿再生。
文档编号C12N5/074GK1586428SQ200410071720
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月15日 优先权日2004年7月15日
发明者张彦定, 陈一平, 黄义德 申请人:福建师范大学