干式化学、侧向流动重建流的层析酶驱动测定的制作方法

专利名称：干式化学、侧向流动重建流的层析酶驱动测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及用侧向流动层析进行快速、干式化学、酶驱动的化学测定。
背景技术：
在人体生物化学中，人体酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PD”)扮演了关键功能。它是氧化戊糖途径的一部分，其中其功能是通过提供还原等价物使自由基对细胞的氧化攻击减至最低限度-即G6PD将葡萄糖-6-磷酸转化为6-磷酸葡萄糖酸，因此释放一个质子将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸即(NAPD)还原为NAPDH。NAPDH开始一系列下游反应最终还原自由基氧化剂并在正常人体生物化学中使很多自由基氧化剂失效。
G6PD存在于所有人体细胞中，但是在红细胞中浓度较高，红细胞的基本功能之一是作为氧运载体，并因此尤其容易受到氧化攻击。由正常活性期间，抗击和防止不需要的氧化效应使用其不到1％的容量反映了G6PD系统的效率非常高。然而，当强氧化剂，如抗疟药物中奎宁类成员必须引入人体时，就大幅增加了迅速生产还原剂的需要。
已知编码G6PD的基因的一些突变会降低酶在个体生物化学中的效率，对基因组的一对突变均进行加工，使其G6PD的表达量维持在与具有正常该基因的人中相同的水平，而且大大降低其G6PD的特异活性。在这些个体中，给予强氧化剂，如抗疟药物中奎宁类成员可能引起严重的临床并发症，如溶血性贫血，因为它们低特异活性的G6PD不能生产足够的还原剂以防止对其红细胞的迅速有害氧化作用。因此，在疟疾感染常见的地区或甚至在流行时期，需要一种能够容易地将具有低G6PD特异活性的人与G6PD活性正常的人区分开来的迅速有效的测试，使医务人员能够保证(1)奎宁类抗疟药物处方只能开给具有正常或较好G6PD特异活性的人，(2)用其他类型的抗疟药物治疗低于正常G6PD特异活性的人。
迄今为止，在任何方面中涉及酶活性的测定大多数通常在“湿式化学”形式下进行，其要求经训练的测定人员准备和进行测定。用于这种测定的试剂必须或者由于组分新鲜制备，或者由市售的干制剂重建。湿试剂较干组分和干制剂不稳定，而且它们必须在更严格、仔细监控的储存条件下储存，包括需要特殊处理技巧以避免污染。那些测定也需要仪器，如分光光度计、荧光光度计或其他能够读出该测定终点结果的仪器装置。在流行情况下，这些测定在医生办公室、医院和疗养机构内并不实用，也不适合家中或野外使用。
进行干式化学格式测定的自动化临床化学分析系统已在工业上使用，它能够测定样品中一种物质的存在、缺乏、浓度或特异活性。用于本申请的目的，这种物质是指“分析物”，它本身可以是一种酶(如在后面详述的G6PD测定中)或一种引起特异酶活性必需的物质。自动化临床化学分析系统的实例是强生VitrosTM和罗氏CobasTM系统。按照设计进行时，这些及相似自动化系统并不需要准备技术条件，和与用人力进行干式化学测定工作有关的储存期限问题。因为程控机器人进行操作性任务，避免了对强化训练人员的需求。但是，该系统需要机上读数仪器，而这种仪器必定太大、太复杂，且通常其基础设施要求太麻烦，不能实际用于医生办公室或家中和在很多医院、诊所及类似场所。很明显，对于野外使用来说它们有太多的技术要求。
同样，有极少数基于非仪器的干式化学测定可用，例如，用于酒精的OrasureQEDTM测定，基于该领域中使用酒精脱氢酶测定唾液中酒精含量。这和其他这一类型的已知测定迄今都被局限于可在不含物质的样品上进行测定，这样品可模糊、抑制或以一些其他方式内在地干扰并使依赖于酶反应或内含物的测定不精确。
在包含视觉模糊的物质的样品上操作的酶测定和使用抗体捕获区域以选择酶分析物的一个实例显示于美国专利5,506,114。该系统需要洗涤步骤以去除视觉模糊的物质并且进行起来足够麻烦，不适合野外使用或在医生办公室、家中、大多数诊所和很多医院及类似场所中使用。
发明简述在最广泛的方面，本发明在于识别用侧向流动层析方便地进行迅速、干式化学、酶驱动测定，其中预沉积的干底物如下文定义的那样，被液体样品的侧向流动层析重建，且夹带底物通过侧向流动装置的至少一个区域，在层析装置的终点或“读出”区，样品-底物混合物的向前流动前缘产生显色反应。产生的颜色是代表相应湿式化学临床测定的终点颜色，该颜色获得于向前流动停止的装置区域，即离进样点最远的区域。根据进行的特异性测定，包括该装置中去除样品中干扰物质的层析区域和/或在进入终点反应区域之前处理预富集分析物的区域都在本发明范围之内。在一些测定中，迄今至少一种物质被认为干扰终点观察，即血红蛋白不需要去除，因为其在终点区域模糊的颜色沉着刚好与前面的区域相等。在这种情况下的结果是，通过对终点区域产生的颜色与邻近、紧接前面的区域直接比较容易地观察终点区域。
通常，在本发明侧向层析、酶驱动测定中，可移动的、预沉积的干底物置于层析条带上样品接受垫和样品流路中下一个垫的接合处附近和恰在之外。然而，它也可置于样品流路的其他地方以满足对样品或者底物中一种或多种组分的具体需要，只要它实质上置于流路中终点或“读出”区域之前，该区域样品流动停止，任何多余液体均流出至吸收垫或其他可提供的水槽装置。
重要的是，在紧密封闭的区域内沉积干底物以利于它被样品的向前流动完全吸收。干底物在流路中的位置也应该考虑到在液体样品内以溶解或分散形式重建底物需要在样品到达样品流动终止的点的时间完成。
也发现酶驱动侧向流动测定可与已知固相分离方法结合，至少在一些情况下，当完成时，能显著提高所需终点的检测敏感性。
所述方法学形式包括通过偶联、包衣、浸渍或任何其他已知方法将靶酶配体结合至微粒固相支持材料-如滤纸盘或其他常见固相支持材料，如，但不限于硝酸纤维素、尼龙、聚乙烯等，或超顺磁性颗粒和类似物。然后，将该配体结合颗粒与已知包含靶酶的液体样品混合并孵育让靶酶结合至配体所需要的时间。然后将包含结合酶-配体反应产物的颗粒通过已知分离技术，包括过滤、沉积、离心从液体样品中分离和在超顺磁性颗粒情况下遭受足够强度的梯度磁场的影响。
收集包含结合酶-配体反应产物的颗粒，从起始样品分离后，悬浮于一定体积的已知缓冲液，该缓冲液在已知适合酶-配体反应产物的缓冲液中选择，该缓冲悬液被用作酶驱动测试中的样品，此测试是为测定酶浓度或酶的一些其他参数而建立的。该方法在β-内酰胺酶浓缩和检测方法中具有特殊价值，其中所有在细菌培养中或在人体液体样品，如鼻洗液、尿样中存在的β-内酰胺酶被通过配体结合颗粒免疫分离预浓缩，然后转移到酶驱动测试的吸收体积。
为了运输、储存和使用的方便，本发明的各层析条带最好保存在构建的合适装置内，这样条带被侧向定位。本领域中很多这种装置是公知的，构建任何装置，这样在其内定位的层析条带上由侧向流动进行的测定性能可适当地利用。
这种进行酶驱动测定的形式具有许多优点，见下文详述。
可容易地在野外、家中、医生办公室或缺乏训练的实验室人员和设备的任何地点由任何人操作成功地使用的特定G6PD测定在下面具体描述，并描述了针对总血浆胆固醇、β-内酰胺酶活性和过氧化物酶活性测定的附图。
附图简要说明

图1A表示本发明中进行G6PD测定准备的层析条带图1B显示已上样且样品到达终点区域前的相同条带图1C显示当测定完成时出现的条带图2A是显示从使用本发明的G6PD测试获得的数据表图2B是从向前流动终止在条带末端至终点区域中显示淡紫蓝色所消逝的秒时间对样品的G6PD活性水平作图，图2A表中显示了测定的酶活性水平。
图3A是显示在本发明的测试中获得的全血浆胆固醇数据表图3B是从向前流动终止在条带末端至“读出”或终点区域中显示蓝紫色所消逝的秒时间对毫克/分升总血浆胆固醇的曲线图。
图4A是显示如实施例2描述的，在总血浆胆固醇测试中获得的全血数据表。
图4B是出现蓝紫色的读秒时间对毫克/分升胆固醇的曲线图。
图5A是用本发明条带，用市售的β-内酰胺酶标准物测量β-内酰胺酶活性获得的数据表。
图5B是出现蓝紫色的秒时间对每毫升标准物活性单位的曲线图。
图6A是从已知产生β-内酰胺的大肠杆菌培养基中测定的β-内酰胺活性获得的数据表。
图6B是来自图6A，显示出现蓝紫色的秒时间对以每毫升CFU(菌落形成单位)测定的β-内酰胺活性的数据图。
图7是如实施例4，(在以下)描述的，从测量过氧化物酶获得的数据表。
发明详述为了在最大范围内描述本发明的目的，无论术语出现在本申请文本的任何地方，均应用以下四个定义
(1)“样品”是指待测定的任何液体生物或环境基质或其液体提取物或液体浓缩物。
(2)“分析物”是指测定的靶物质，可能存在或不存在于样品中。分析物本身可以是酶或引起特定酶活性所需的物质，例如底物、共底物或辅助因子。
(3)“底物”是指引起特定酶反应所需组分的组合，所述组分不存在于样本中或存在量不足，此时分析物不是酶，或起始酶反应驱动了所需最终测定必需的附加级联反应。该底物可包含辅助因子的任意组合，如前面句子中定义的底物、共底物、染料或比色组分，或酶本身。
(4)术语“干式化学”是指一种测定形式，其中对样品的给定测定所需组分维持干形式，直到被测定本身的性能重建，而不是在测定程序之前重建或从测定程序中分离。
通过侧向流动层析在酶驱动测定中所必需的重建底物组分相比不利用这种层析的方法具有许多优点。至少可以列出下述几条在通常手工进行的酶驱动测定中，需要连续稀释样品以控制迅速酶动力学；在本发明的侧向流动测定中，不需要样品稀释，因为只有非常少的样品上样于进行测定的层析条带。
样品本身重建底物，因此排除了对分离重建缓冲液和步骤的需要。
底物的这种层析重建比在通常实验室进行的比较测定中提供的增加了样品可用的底物浓度。
使用的层析介质是本领域中任何公知且很好鉴定的。在合乎需要的具体测定中，通过在条带上保留一个条带区以浓缩分析物，通过去除存在的某些液体或通过保留并适当预处理一个条带区，以致样品中存在含抑制或干扰所需酶反应的物质在此区域被完全或部分固定，或阻碍其流动性。利用这些容易了解它们的已知特性。
同样，因为终点颜色形成被限制在一个单一的终点区域，所以即使没有如分光光度计这样的仪器，其读数和评价也比颜色扩散至较大液体体积时要容易得多。
另外，样品在其液体前缘吸收干燥底物的作用导致在紧靠近终点区域留下一个实质上的底物自由区域。当样品向前移动时，在液体前缘形成了血红蛋白的任何剩余颜色和所需的终点颜色之间的明显区别。这消除了在某种情况下的任何需要从去除样品中的任何物质(如血红蛋白的红色)，这些物质在用液体样品进行手工化学测定时已知产生视觉模糊的颜色。
更进一步，从样品引入到鉴定层析侧向流动测试的终点反应的相对速度在酶驱动测试中提供了很大优点。当通过经典手工分析方法进行时，这些测试经常需要样品和底物之间接触的消化时间，依次30-45分钟甚至更长。值得注意的是，这些时间并不包括在这些经典手工方法中进行稀释、浓缩步骤或物质去除步骤及类似操作所需的时间。相反，侧向流动测定，由样品引入到条带开始至终止于终点结果的评价通常可在5-20分钟范围内进行。
为测量红细胞中的分析物，如实施例1中的G6PD分析物，在分析物可被测定之前必须用表面活性剂或其他裂解剂溶解(撕开)红细胞。另一这种通常在红细胞内发现的分析物是丙酮酸激酶，本发明可容易设计以干式化学形式的测定。
还有分析物通常存在于血清或血浆而不是红细胞的许多例子，它们是酶驱动的且可有益地转化为本发明的“干式化学”形式。其中这种测试例如葡萄糖、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐激酶(CK)等。
本发明在分析物存在于其他生物液体的情况下也是有用的，如测量唾液中的酒精或测量尿中的药物，如对乙酰氨基酚或水杨酸盐。
总的来说，本发明被认为在下述情况下具有特殊用途(A)样品中分析物的典型浓度非常低，如在测量肾功能的肌酐和尿酸测试中；与经典手工方法相比，在液体前缘样品和底物的紧密混合将提高测试的灵敏度。
(B)进行提供定性的“是”或“非”结果的筛选测试以确定一种疾病的发作或严重程度，例如用ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天冬氨酸氨基转移酶)对肝脏损伤进行筛选，尤其是对服用药物能引起肝脏损伤的病人和对婴儿进行如苯丙酮尿(PKU)的测试或用于检测半乳糖血症的半乳糖测试以筛选遗传疾病等，和(C)在测量另一部分之前需要除去样品的某部分的测试，如测量HDL(高密度脂质)-胆固醇，在测量总HDL-胆固醇之前，需通过沉积或其他方法去除其中的LDL(低密度脂质)和VLDL(极低密度脂质)。
从前述内容，显而易见本发明的定性和定量形式均适用。除上述之外，其他可广泛应用的环境是那些其中酶标抗体已在湿式化学方法中使用的环境，以检测未知样品中疑似抗原的存在，然后通过用合适的显色剂反应酶-标记抗体-抗原反应产物。这些测试已经传统地在湿式化学形式中定性和定量进行。将它们适合于根据本发明进行的方法将产生快速、易操作和如上文中注明的其他酶驱动反应的所有好处。
特别注意将本发明应用到全血化学测试的日期。
例如，葡萄糖可由还原试验测定，经常用于测定糖尿病人的血样。为进行根据本发明的测定，用由葡萄糖脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(“NAD”)、硝基四氮唑蓝和黄递酶组成的预沉积干组分制备免疫层析条带。葡萄糖还原为其氢化物，该氢化物在黄递酶存在的情况下还原硝基四氮唑蓝在“读出”区域提供淡紫蓝色。
在葡萄糖的氧化测定中，在底物区沉积的干组分是葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚、或苯酚衍生物。葡萄糖和葡萄糖氧化酶在氧气存在的情况下生成过氧化氢，过氧化氢又与氨基比林和苯酚(或苯酚衍生物)反应在“读出”区域生成一种清晰的颜色。
根据本发明，经常用于进行血脂质分布的胆固醇测定是通过在底物区域将胆固醇酯化酶、胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林和苯酚衍生物均以干形式沉积进行的。当血样被引入条带、溶解并沿条带流动时，可以在读出区观察到清晰的颜色，该颜色的色密度与样品中胆固醇浓度成正比。这允许通过公知的方法开发颜色标准。所述标准须在读取色密度的仪器并不适用的条件下，如医生办公室、家中、野外等，也能够方便地使用。
根据本发明的用于测量HDL-胆固醇的测试采用了预备好的ICT条带，其中紧接着“溶解”区域后的第一个区域提供了沉积的、固定的沉积试剂，这些试剂捕获并结合样品中低密度(“LDL”)和极低密度(VLDL)脂质，仅允许样品中HDL-胆固醇进入底物区域。底物区域中的组分也是干燥的胆固醇酯化酶、胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林和苯酚衍生物，在读出区生成的颜色的强度与样品中HDL-胆固醇浓度成正比。
为了通过本发明的方法评价肾功能障碍而进行的肌酐测定，在底物区域中预沉积的干组分是肌酐免疫水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚衍生物。
根据本发明，对肝功能障碍的ALT测定可在ICT条带上进行，其中在底物区域中预沉积的干组分是丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚衍生物。
此处描述的用在底物区域中预沉积的、干组分制备的ICT条带由肌酐、三磷酸腺苷、磷酸苯酚丙酮酸、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚衍生物组成，能根据本发明进行充血性心力衰竭的测定。
当怀疑新生儿有苯丙酮尿症(PKU)时，本发明提供了一种方便的“是-非”测定，其中ICT条带装有苯丙氨酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷和黄递酶的干沉积物。当加入血样，在读出区域出现颜色时，则该试验为PKU阳性；如果没有颜色出现，则不存在该疾病。
本发明的方法中，血液中酒精含量测试可以氧化或还原方式进行。还原测试的测试条带可由在底物区域将乙醇脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷、硝基四氮唑蓝和黄递酶沉积为干形式制备；同样目的的氧化测试采用底物区域中预沉积干燥的乙醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚衍生物的ICT条带。在两种情况下，终点或“读出”区域的颜色与血样中的酒精含量成正比。
血液中对醋氨酚(泰诺TM)的测定可根据本发明方便地进行。为此目的，ICT条带将包含预沉积干燥的芳酰基胺化酶(aryacylaminidase)、邻甲酚和一种氧化剂，如亚硫酸氢钠。当加入一个血样时，可以通过与预先确定的颜色标准比较其颜色强度来确定病人是否服用了过量的对醋氨酚。
为了具体说明本发明，设计了一种快速干式化学侧向流动测定。为此目的，选择了检测G6PD缺陷，因为认识到大家对于可靠的、可在野外进行的、无需仪器和缺乏训练的测定室人员的测试的需要。也示例了用于总血清胆固醇，β-乳糖酶活性和过氧化物酶活性的测定。
具体实施例实施例1该测定在一侧向流动条带上进行，如图1A所示，具有一个“溶解”或芯吸垫，样品由此向前流入第二、或底物垫。后者有两个区域。第一个区域是紧密封闭的底物区域，其中是可移动的预沉积的所有在本领域可方便使用的干组分，能使样品中的G6PD将淡黄色染料硝基四氮唑蓝还原为深蓝色的甲。硝基四氮唑蓝至深蓝色的甲的转化率是本领域用来测定G6PD特异活性的几种湿式化学测试之一。底物垫也包含起始为无底物的区域，位于条带上距离上样点的最远端。因为样品吸收底物并向前流动，当包含重建底物的样品占据这里和向前流动停止时，起初无底物区域变成“读出”或终点区域。在终点区域之前，因为样品沿条带移动，它的向前流动动力吸收干燥的底物组分，当它移动到条带末端时，重建吸收的干燥组分在液体前缘聚集，迅速地成为终点或“读出”区域，在那里显色。刚好在读出区域之前的条带区域，通过液体前缘除去干燥底物，然后变成基本上不含底物、但同时被穿过区域的样品中的血红蛋白染上红色。
本测试的侧向流动层析形式相对于“湿式化学”测试方法具有一个特定的优点，因为选择测定G6PD活性的样品是血液。这是因为，如前所注，血细胞包含各人类个体G6PD的绝大部分。血细胞必须溶解才能使编码G6PD的酶可用于反应。溶解即(撕裂)血细胞释放血红蛋白且赋予样品红色，而它必须被去除或强度至少明显减弱。当该测试是通过湿式化学方法进行时，因为甲的蓝色在已赋予统一红色的弥散液体样品中极困难、几乎不可能用视觉辨别。在所述的弥散液体样品中甲的蓝色当它一出现、当起始红色仅仅加深就可以容易看出；而且，不同的个体试图观察颜色变化一般不同地解释任何给定测试。然而，在这里描述的层析测试中，不需要去除红色，因为样品和层析重建的干组分的反应发生在一个很好定义的流体前端的流动区域，以致于当流动终止在层析条带末端且样品中多余液体，如果有，流入槽，条带的两个邻近区域都是清晰可见的。最靠近条带末端的区域，即终点区域或“读出”区域，是淡紫蓝色的，而相邻区域显示血红蛋白的红色，因此两个是彼此可以清晰分辨的。
在用G6PD测试装置的实际测试中，将人全血样品加入一个包含肝素的管中以防止样品凝结。样品的一部分首先用先前技术的临床“湿式化学”实验室程序测定G6PD活性，通过紫外分光光度分析证实该样品具有116单位/分升的正常人G6PD活性水平。样品的一部分通过加入10％Triton X-100水溶液溶解，血液与溶解溶液的体积比为10∶1。得到的10％Triton X-100、90％全血溶解液在37℃孵育6小时，使蛋白酶降解其起始的G6PD活性。与全血部分使用同样常规的“湿式化学”实验室程序，这个样品被发现没有G6PD活性。
用与第一溶解样品相同的方法制备第二溶解样品。制备新鲜溶解溶液和降解溶解液，目标G6PD活性为104、80、40和20单位/分升。这些样品的实际活性用同样常规的“湿式化学”实验室程序测定。新鲜溶解样品的结果与其确定目标相一致，而降解样品始终没有显示活性。
向一系列个别制备的、侧向装在支持物上的层析G6PD条带的样品接受端上加入45μl新鲜和降解的溶解样品。样品沿侧向放置的条带层析流向其终端。当每个样品达到其所在条带的终端时开始计时，记录终点区域显现出可见的淡紫蓝色所需时间。新鲜裂解样品的活性水平显示在图2A的表中。对每个新鲜裂解样品用显现淡紫蓝色的时间对酶活性水平作图，如图2B。新鲜裂解液的所有浓度水平都具有G6PD活性，最终在条带的终点区域或“读出”区域产生期望的淡紫蓝色。
这些测定必须用预溶解的血样进行，因为没有可用的G6PD缺陷血样，必须测试G6PD水平的范围以证实该测试。在层析条带的引入样品端上溶解血样是本领域已知的程序，实践中与未知G6PD活性的样品一起在这些测试条带上以已知方式进行，因此避免了任何对预测试样品处理的需要。上述的测试被认为是确定时控终点目的所必需的，以使本领域中该测试条带使用者能够容易区别G6PD缺陷血液和G6PD正常血液。
迄今，临床上相关的G6PD缺陷水平已被固定在20单位/分升。本测定设计在环境温度为37℃时进行，这通常出现在疟疾感染流行的温暖气候中，且在开给抗疟药物处方前迫切需要鉴定G6PD缺陷的个体。已知37℃时，G6PD的酶活性是正常室温25℃下的两倍。为进行G6PD层析测试，室温下的目标活性水平切断设置在50单位/分升(37℃时相应为25单位/分升)。通过将测试终点从样品和带走重建底物到达条带的终端的时间设置在70秒，即可容易看出具有正常G6PD水平和G6PD水平是临床缺陷的个体之间的区别。
在世界上疟疾最流行的区域，G6PD缺陷是相当常见的。本测试的进行无需经训练的测定室人员的容易和快速结合起来表明，使用本发明的侧向流动层析G6PD测试在保证感染疟疾的G6PD缺陷个体不再接受会显著地加重他们的健康问题的疟疾药物方面具有实质性价值。
实施例2如前所述，测量液体样品中的胆固醇浓度可通过本发明的酶驱动层析测定进行，方法与测量G6PD相似。通过沉积所有在测量全血胆固醇的湿式化学测定中常规使用的试剂，加上在胆固醇组成浓度比例下产生颜色变化所需的显色组分构建侧向流动测试条带。本测定中使用的苯酚衍生物是TOOS，即3-(N-乙基-3-甲苯胺基)-2-羟丙烷磺酸(Sigma，E-8631)，在全血样品的血红蛋白背景以上可以容易分辨产生的蓝/紫色。在这些测试条带上进行市售的一组血清胆固醇标准品(Sigma，C-0534)测试以确定显色时间是依赖于胆固醇浓度的。在图3A和它的曲线图3B中可观察到清楚的剂量依赖性。
为评价具有全血样的这些测试总胆固醇条带，构建了一组全血样。用兔血模拟极端低胆固醇血症，因为兔子天然的血清胆固醇水平很低，在此情况中为38毫克/分升。为了将该测试平衡在较高水平，离心该血液、取出血清部分并分成等份。每等份中加入等体积的上述血清胆固醇标准品。
用市售的湿式化学分光光度计测定(Thermo Trace，胆固醇浓度38至328毫克/分升)测定得到的这组调节的全血样。溶解每一调节样品并在上述测试条带上进行测定。在这些全血裂解样品中也观察到清楚的剂量依赖性。该依赖关系可由图4A和相应的数据曲线图4B显而易见。
在图3B和4B中，y＝每0.1升中胆固醇的毫克数、x＝在读出区域中颜色可见的时间秒数。符号R2是数据和所作曲线的相关系数。
实施例3β-内酰胺是一类抗生素，包括青霉素和先锋霉素，该类抗生素含有特征性的β-内酰胺环结构。该结构干扰合成肽葡聚糖所需的酶在分裂中的细菌中产生有缺陷的细胞壁，而且使这些细胞壁容易被渗透压溶解。细菌对这些抗生素产生抗性的一个机制是产生β-内酰胺酶，它可以特异性切割β-内酰胺环，使抗生素无效，恢复细菌成功增殖的能力。
通过沉淀根据先前技术、产生依β-内酰胺酶的浓度比例而变化颜色的湿式化学方法中所需的所有试剂构建的侧向流动酶驱动层析测试条带以检测β-内酰胺酶的存在。如实施例1中，液体样品层析重建沉积在测量β-内酰胺酶活性的层析条带上的干组分，在本实施例中是生色先锋霉素(Oxoid，Sr0112C)。只有当β-内酰胺酶存在于原始样品体积中，才能在条带末端的反应区域观察到颜色形成。
为证实用这些条带目测颜色的时间是依赖于β-内酰胺酶活性，获得市售的纯化β-内酰胺酶标准品(Sigma，P-4524)，重建、稀释至β-内酰胺酶活性范围，并在这些测试条带上进行测试。在图5A和相应的数据曲线图5B可观察到明显的剂量依赖性。
获得已知产生β-内酰胺酶的大肠杆菌细菌样品(ATCC #35218)，并根据附带的说明书培养生长。常规湿式化学分光光度计测定确证了培养细菌中存在β-内酰胺酶活性。然后稀释浓缩的培养液，用混浊度测量计算其细胞浓度，参考本实施例前面所述的在同一测试β-内酰胺酶的条带上进行一系列稀释。这里再一次在这些稀释细菌培养样品中观察到清楚的剂量依赖性。由图6A和相应的曲线图6B可明显看出这种依赖关系。在图5B和6B中，y代表β-内酰胺酶活性的单位数，“Ln”是数值x的自然对数，x代表在终点或读出区域目测颜色的测量时间秒数。在图6B中，符号“E”代表因数10，E后紧随加号和一个数字表示该数是10到正幂-如1.00E+8指1×108。E后紧随减号和一个数字表示该数是10到负幂-因此在图6B中，“R2＝9.955E-01”，“E-01”＝10-1，R2＝.9955。在图5B和6B中，R2是数据和所作曲线的相关系数。
现有检测β-内酰胺酶的方法需要培养待测具有产生抗生素免疫力的细菌以扩大细菌菌落的大小并最终扩大存在的β-内酰胺酶量。然后菌落被培养在浸渍生色先锋霉素的培养皿中。每培养皿中只放入很少量的样品，任何β-内酰胺酶的存在会切割生色先锋霉素以致在培养皿中产生显著的颜色变化。
在致力于提高本方法的准确性、效率及敏感度方面，通过暴露在稀土磁体的磁场分离足够磁矩的超顺磁性颗粒被结合于对β-内酰胺酶特异的抗体。然后将这些颗粒加入大体积的样品中，样品来自对抗生素反应不良的感染病人。在耐药上呼吸道疾病的情况中，例如该样品是鼻洗液。当待测细菌是尿道病原体时，尿样是理想的。样品和颗粒孵育足够长的时间使反应发生。载有酶抗体结合物的磁性颗粒通过稀土磁体的磁场从未反应的颗粒和液体样品中分离。然后，这些颗粒从磁体释放并重悬于小体积的与层析测试β-内酰胺酶条带上的测试试剂相容的缓冲液中。对当前实施浸渍生色先锋霉素的培养皿和通过培养来自病人病原体获得放大的细菌菌落，针对通过所述技术期望实现的效率的初步评价强烈提示将要实现明显改进的敏感性。而且，迅速获得的信息在很多情况下会通过指明需要快速转换到不含β-内酰胺的药物治疗而挽救病人的生命。
实施例4最近的文献，包括新英格兰医学杂志的一篇文章“胸痛患者中髓过氧化物酶的预后价值”(Prognostic Value of Myeloperoxidase in Patients withChest Pains)卷号349 #17，1595-1604突出了髓过氧化物酶作为心脏疾病标志的潜在重要性。作为一个潜在的诊断工具，构建原型酶驱动层析测定以检测血清或全血中的过氧化物酶活性。通过沉积现有湿式化学方法所需的所有试剂构建侧向流动测试条带，以产生与测试样品的过氧化物酶活性成比例的颜色变化。
简单地说，葡萄糖氧化酶(Sigma，G-2133)、4-氨基安替比林(Sigma，4382)和苯酚衍生物TOOS(Sigma，E-8631)在溶液中组合，应用于接受层析条带末端的样品并干燥。类似地，制备葡萄糖(Sigma，G-7528)溶液，应用于体积中同一条带的末端，这样在处理区域和没有混合发生的区域之间保留一空出的间隙，然后干燥。在重建这些干组分时，正如本领域已知的，葡萄糖和葡萄糖氧化酶产生在样品中可被任何过氧化物酶活性利用的过氧化氢，从以前无色酚化合物生成特征性紫色。
在全血的血清部分中存在少量血红蛋白，而在未分离的全血中存在大量的血红蛋白具有固有的假过氧化物酶活性，因此需要包括附加试剂以保证此活性不干扰本测试。亚硝酸钠是一种强氧化剂，它会迅速氧化血红蛋白并消除其假过氧化物酶活性，如美国专利6,200,773所述。将足量的亚硝酸钠(Sigma，S-2252)加入上述测试条带的第一个试剂区，以消除适度溶血的人血清样品中的假过氧化物酶活性。
为了确定这些条带的显色时间是否依赖于测试样品中的氧化物酶活性，获得了市售的辣根过氧化物酶标准品(Sigma，P-8375)并重建。然后，稀释该标准品至在适度溶血人血清中的过氧化物酶活性范围，并在这些测试条带上进行。图7反映了观察到的显色时间中清楚的剂量依赖性。
使用这本文描述的干式化学、侧向流动层析形式，可更容易、更快速和更廉价地进行大多数酶驱动测试。将层析分离技术如离子交换、特异性亲和、尺寸排阻等与干式化学组合，在很多情况下侧向流动测试形式将产生更大的好处。
本领域设计侧向流动层析测试的技术人员会容易理解应用这些技术将现有的技术，如临床湿式化学变成实际上在任何地点由几乎任何人均可实施的低成本的、方便的测试途径。尤其是，用替代的干试剂，具体是本文中提到的那些用在底物区域的试剂可进行各种测试已为大家所知。相似地，能在样品接触底物区域中干组分之前进行附加步骤来制备ICT条带，而并不以任何方式背离本发明的精神。因此本发明仅受所附的权利要求的限制。
权利要求
1.一种适于对选择的分析物进行预选择的酶驱动测定的层析条带，其特征在于，该条带是(a)适于侧向放置在支持装置上，保证沿其长度侧向流动(b)由一种允许侧向层析流动通过其空隙的材料构成，和(c)在粘性底板上包含至少两个顺序地定位的垫，即(1)样品接受垫，用于接受侧向流动且层析通过的液体样品，和(2)底物垫上已在临近与其前面的垫干扰的区域内可移动地沉积迄今用于相同分析物的湿式化学测定中的干组分混合物。
2.如权利要求1所述的层析条带，其特征在于，所述样品接受垫适用于允许向引入的液体血样中加入裂解剂，和允许所述溶解的血样以侧向形式层析流动至第二个所述的垫。
3.如权利要求1所述的层析条带，其特征在于，所述第一个垫的一个区域被预处理以去除、或降低液体样品中的浓度，当液体样品通过垫流动时，已知一种物质干扰、模糊结果，或如果存在于其中会阻碍所述测定的进行。
4.如权利要求1所述的层析条带，其特征在于，所述第一个垫的一个区域通过液体样品流过时去除液体含量的一部分以浓缩液体样品。
5.如权利要求1所述的层析条带，其特征在于，中间垫置于样品接受垫和垫之间，用至少一种物质的不可移动的沉积物处理中间垫，此物质去除或结合至少一种样品组分，否则该组分会干扰或模糊测定结果。
6.如权利要求2所述的层析条带，其特征在于，当用新鲜人血液体样品借助层析侧向向前流动重建时，所述包含干燥组分的底物垫对所述样品进行G6PD酶驱动测定。
7.一种人血中G6PD活性的层析侧向流动测定，包括下述步骤a)在样品接受端装配包含至少两个位于粘性条带上的相邻垫，每个都由允许侧向层析流动通过的材料构成的侧向放置的层析条带，新鲜人血的液体样品，b)将一种裂解剂应用于样品以撕开红细胞，c)允许溶解的血样沿所述条带流动，流入所述第二个垫，其中其向前流动的动力吸收可移动的预沉淀干底物混合物，此混合物包含以前用于G6PD活性湿式化学临床试验的干组分，d)允许溶解的血样在其向前流动前缘包含干底物组分，以使其一起沿所述条带流动至终点，和e)当溶解的血样和干底物组分到达所述条带的终点时，注意在向前流动前缘观察因形成甲而出现的明显淡紫蓝色。
8.如权利要求6所述的测定，其特征在于，步骤(e)中在样品和重建底物到达条带的末端以后测定产生淡紫蓝色所需的时间，根据测量时间和进行测定的环境温度进行测定，根据已知G6PD活性水平的时间-温度关系，由血样来源者是否有正常或低于正常的G6PD活性决定。
9.如权利要求6所述的测定，它在周围温度大约37℃下进行，其中，步骤(e)允许的样品和重建底物到达层析条带终端的进行时间为70秒，如果仍然没有淡紫蓝色形成，这个测定血样的个体被分类为具有G6PD活性缺陷。但如果在70秒限制之前形成所述颜色，这个测定血样的个体被分类为具有正常G6PD活性。
10.一种对预选分析物进行的酶驱动层析侧向流动测定，它是通过下述步骤进行的(a)通过在样品接受端装配包含至少两个位于粘性背垫上相邻关系的垫，一种液体样品，(b)允许所述样品流经第一个垫并进入第二个垫，样品的向前流动动力吸收并携带到所述垫的相反端，一种干组分的混合物用于进行预选分析物的湿式化学测定，和(c)在此干组分通过与液体样品接触被重建，表示出测定终点的颜色在流动前缘位置形成。
11.如权利要求2所述的测量哺乳动物血液中全血清胆固醇的层析侧向流动测定，其特征在于，所述条带有一个底物垫，其上已在临近与其前面的垫干扰的区域内可移动地沉积迄今用于测量全血清胆固醇的湿式化学测定中的干组分混合物和一种染料形成组分。
12.如权利要求1所述的测量细菌培养物中β-内酰胺酶活性的层析侧向流动测定，其特征在于，所述条带有一个底物垫，其上已在临近与其前面的垫干扰的区域内可移动地沉积迄今用于测量β-内酰胺酶活性的湿式化学测定中的干组分混合物和一种染料形成组分。
13.如权利要求2所述的测量人血清或全血中过氧化物酶活性的的层析侧向流动测定，其特征在于，所述条带有一个底物垫，其上已在临近与其前面的垫干扰的区域内可移动地沉积以前用于过氧化物酶活性的湿式化学测定中的干组分混合物，加一种染料形成组分和足量的亚硝酸钠以消除假过氧化物酶活性。
14.一种对选择的分析物进行预选酶驱动测定的方法，该酶在已知其存在的环境中通常以很小的浓度出现，其特征在于，该方法包括下述步骤(a)向已知出现所述酶的环境加入足够基于含水的液体以提供一种所述酶和/或浸渍或结合至所述酶配体的微粒支持材料内能够发生移动的介质，(b)向所述介质中加入比任一可能存在于所述介质中的天然产生的颗粒大的微粒支持材料，该微粒支持材料已结合或浸渍所述酶的配体。(c)使已结合或浸渍所述酶配体的所述颗粒支持材料和所述酶一起孵育足够长的时间以使所述酶与所述结合或浸渍所述颗粒支持材料的配体在传导促进所述酶和所述配体接触的条件下反应，(d)从所述介质中恢复所述颗粒支持材料，其上形成了配体-酶结合物，(e)在适用于进行所述配体-酶结合物中存在的酶驱动测定的层析条带上，将所述在步骤(d)中恢复的其上形成了配体-酶结合物的所述颗粒支持材料分散于测定所需样品大小体积的基于含水的介质，(f)将所述体积的包含其上形成了配体-酶结合物的所述颗粒支持材料的基于含水的介质加入如权利要求1所述的适用于进行所述配体-酶结合物中存在的酶驱动测定的层析条带的样品垫，(g)使测定进行和(h)用预先确定的颜色标准读出结果。
15.如权利要求14所述的方法，其中颗粒支持材料是一种多孔性纸或塑料材料，其特征在于，步骤(d)是通过滤出其上形成了配体-酶结合物的所述颗粒支持材料进行的。
16.如权利要求14所述的方法，其中颗粒支持材料是一种多孔性纸或塑料材料，其特征在于，步骤(d)是通过离心所述介质，分离出包含其上形成了配体-酶结合物的所述颗粒支持材料的层并吸掉或滤掉所述层中存在的所有液体进行的。
17.如权利要求14所述的方法，其中颗粒支持材料是一种多孔性纸或塑料材料，其特征在于，步骤(d)是通过自然沉降静止并分层含有其上形成了配体-酶结合物的所述颗粒支持材料的所述介质，然后分离出包含其上形成了配体-酶结合物的所述颗粒支持材料的层并通过抽吸或过滤去除其中存在的任何液体进行的。
18.如权利要求14所述的方法，其中颗粒支持材料是一种超顺磁性颗粒，其特征在于，步骤(d)是通过将所述介质暴露在足够强度的磁场作用中，吸住其上形成了配体-酶结合物的颗粒进行的，然后通过倾注或抽吸去除介质，从磁体释放分离的颗粒并立即用于步骤(e)。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述磁体是稀土磁体。
全文摘要
描述了用于进行快速酶驱动测定的一种侧向流动层析测定形式。将引起特定酶反应必需的组分组合，这些组分在指定样品中不存在或存在不足以完成所需反应，与发生所需反应时产生所需颜色的组分一起预沉积为干形式的底物。条带装有流体中置于底物沉积之前的一个样品垫，向其施加液体样品。样品自样品垫流入底物区，立即重建干燥组分，同时也与其紧密混合并在液体前缘与其反应。液体前缘迅速移入最后的“读出区”，在那里与预定的颜色标准对照读出产生的颜色用于所需的反应。将按需要预处理样品的垫(如用于溶解全血中红细胞的溶解垫)置于流路中样品垫之前的合适位置。本发明的测定形式较类似的干式化学测定更快、更容易进行。公开了用于葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(“G－6PD”)、全血浆胆固醇、β－内酰胺酶活性和过氧化物酶活性的特异性测定。
文档编号C12Q1/32GK1756834SQ200480006045
公开日2006年4月5日 申请日期2004年2月24日 优先权日2003年2月24日
发明者R·皮亚西奥, N·特纳 申请人:比南股份有限公司