专利名称：一种红藻和蓝藻完整藻胆体的稳定化技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
藻胆蛋白是一类光合作用捕光色素～蛋白质复合物，主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中。在光合作用中起捕获和传递光能的作用，具有强烈的荧光。在蓝藻和红藻中，由2-3种藻胆蛋白组成超分子结构藻胆体，形成高效的能量传递序列。在80年代中期，美国研究藻类光合作用的学者提出将藻胆蛋白作为荧光标记物，用于诊断试剂。同常用的荧光标记物相比，藻胆蛋白具有下列优点生产过程安全、无毒，光能吸收强，荧光产率高，超过90％，背景光干扰和假阳性率低，在pH4-11的范围内稳定，可以作双色、三色和四色标记。所以，这类试剂的应用范围不断扩大。由于其独特的优点，藻胆蛋白和藻胆蛋白标记的诊断试剂在90年代初进入国际市场。但是，由于价格昂贵，尚未应用到普及型的临床诊断试剂。我国全部进口，也仅限于用细胞流式仪进行的诊断。
藻胆蛋白做为荧光探针，有其独特的优势，但单个的藻胆蛋白分子，由于其分子较小、分子中含有的色素基团较少，因此，产生荧光的亮度不够，使得在高分辨率的检测中灵敏度不高。美国的莫斯曼(J.P.Morseman)提出，应用固定化的完整藻胆体做为荧光探针，可用于多种生物医学检测。由于藻胆体中含有更多的色素基团，因此，其亮度较高，并且，激发波长为藻红蛋白(PE)或藻蓝蛋白(PC)的吸收波长，而荧光发射来自APC，因此，激发波长和发射波长相距更远，避免相互干扰。但是藻胆体是由藻胆蛋白在连接蛋白的作用下，在疏水、电荷等非共价键作用下自组装形成的超分子复合体，藻胆体只有在较高离子强度的缓冲系统中保持稳定，在较低离子强度下，极易解离，即使在较高的离子强度下，完整藻胆体也很难长时间保存，从而严重限制了藻胆体做为荧光探针在生物医学检测中的应用。因此，完整藻胆体的稳定化，对于藻胆体的保存和做为荧光探针用于生物医学检测，显得尤为重要。
发明内容本发明针对藻胆体做为荧光探针做为荧光标记物用于生物医学检测中需要解决的关键技术问题，提供一种完整藻胆体的稳定化技术，从而为完整藻胆体用做荧光探针奠定基础。
本发明的蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，方法如下1、原料的破碎以新鲜的蓝藻或红藻为原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，采用超声波破碎细胞。
上述蓝藻选自钝顶螺旋藻或鱼腥藻；上述红藻选自单细胞红藻紫球藻、大型红藻多管藻或三叉仙菜。
2、藻胆体解离在上述破碎的藻体中加入去污剂吐温X-100(TritonX-100)，使藻胆体从类囊体膜上解离下来。离心，去除去污剂、叶绿素和破碎的细胞，得藻胆体的粗提物。
3、完整藻胆体的提取以蔗糖密度梯度高速离心的方法提取制备上述蓝藻或红藻的完整藻胆体。
4、完整藻胆体的稳定性保护采用下列方法之一(1)采用葡聚糖，对藻胆体非共价交联，准确称量相对分子质量为20000的葡聚糖，加入到上述步骤3完整藻胆体溶液中，溶解，使终浓度达9～10％(W/V)。
(2)采用甲醛交联技术，对藻胆体分子内进行共价交联，取上述步骤3完整藻胆体溶液，用0.75mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.98)调整蛋白浓度至0.25～0.30mg/mL，然后，取该藻胆体溶液1.8mL，边振荡边缓慢滴加用0.75mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液配制的3～5％(W/V)甲醛浓溶液0.2mL，直至甲醛浓度为0.3～0.5％(W/V)，20℃保温12-13h。
上述步骤1原料的破碎具体为新鲜藻体0.75～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.8～7.0)中，超声波破碎，破碎功率为12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，间隔2～3min。
上述步骤2藻胆体解离具体为在破碎的藻体溶液中加入体积百分比浓度1.9～2.1％去污剂吐温X-100，室温下，缓慢搅拌1小时～1.5小时，13000rpm～15000rpm离心1～2次，去除表层的去污剂吐温X-100、叶绿素和底部的细胞碎片，收集出离心管中部的溶液，即为藻胆体粗提液。
上述去污剂的加入量本发明不作特别限定，按本领域现有技术，以能使藻胆体从类囊体膜上解离为宜。
上述步骤3提取藻胆体的蔗糖密度梯度离心的方法可采用现有技术，本发明提供如下具体方法取步骤2制备的藻胆体粗提液3～4mL，叠加到蔗糖密度梯度离心管的上层，从底层到上层蔗糖的摩尔浓度及体积2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L-15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm离心3～4h，取1mol·L-1层的蓝色液，对1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液透析过夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液稀释，至藻胆蛋白浓度的为0.25～0.30mg/mL，测定完整藻胆体的荧光光谱。(如图1所示)上述步骤4完整藻胆体稳定性测定1、将用葡聚糖稳定性保护方法(1)所得藻胆体溶液的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾的离子强度降为0.6mol/L，20℃保存，保存30天。作为对照的是在磷酸氢二钠—磷酸二氢钾的离子强度降为1.0mol/L保存的未加葡聚糖的藻胆体(未经稳定性保护的藻胆体在0.75～1.0molL的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液中，能够保持完整，而0.6mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液中，容易解离，无法保持完整)。测定藻胆体的荧光光谱，藻胆体依然保持完整(如图2和图3所示)。
2、甲醛交联技术稳定性保护方法(2)所得藻胆体溶液，用去离子水稀释至低离子浓度0.1mol/L，20℃温育30天，测量其荧光光谱，结果表明在0.1mol/L低离子强度下保存30天，稳定化的藻胆体依然保持完整。(如图4所示)本发明以红藻和蓝藻为材料，应用超声波破碎细胞、去污剂TritonX-100从类囊体膜上解离藻胆体、常规离心去除TritonX-100、叶绿素和细胞碎片、应用蔗糖密度梯度超速离心制备完整藻胆体，然后应用葡聚糖非共价键包被和甲醛共价交联两种方法之一，对藻胆体的稳定性进行保护，室温保存30天，藻胆体依然保持完整，没有解离。从而为将藻胆体应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础，具有很好的应用前景。
图1是实施例1蔗糖密度梯度离心法提取的钝顶螺旋藻藻胆体的室温荧光光谱。曲线a是钝顶螺旋藻藻胆体的室温荧光发射光谱，其发射峰位于680nm处。曲线b是藻胆体的激发光谱，680nm的荧光激发峰有两处，其中622nm处为最大激发峰，650nm处为一肩峰。
图2是实施例1加入葡聚糖后藻胆体V值随保存时间的变化。
图3是实施例1加葡聚糖(a)及未加葡聚糖对照(b)藻胆体保存30天的室温荧光发射光谱。
图4是实施例2稳定化的钝顶螺旋藻藻胆体的室温荧光光谱，其中，a荧光激发光谱，Em＝665nm；b荧光发射光谱，Ex＝580nm。
具体实施方式
实施例1、蓝藻完整藻胆体的稳定化技术，方法如下1、原料的破碎新鲜钝顶螺旋藻0.8g，溶于16mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.9)中，采用超声波破碎细胞，破碎功率为12～15W，破碎5次，每次1.5min，间隔2min。
2、藻胆体解离在上述破碎的藻体中加入体积百分比浓度2.0％去污剂吐温X-100，室温下，缓慢搅拌1小时～1.5小时，使藻胆体从类囊体膜上解离下来，13000rpm～15000rpm离心1～2次，去除表层的去污剂吐温X-100、叶绿素和底部的细胞碎片，收集出离心管中部的溶液，即为藻胆体粗提液。
3、完整藻胆体的提取以蔗糖密度梯度高速离心的方法提取完整藻胆体。取步骤2制备的藻胆体粗提液3mL，小心叠加到蔗糖密度梯度离心管的上层，从底层到上层蔗糖的摩尔浓度及体积2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L-15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm离心3～4h，取1mol·L-1层的蓝色液，对1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液透析过夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液稀释，至藻胆蛋白浓度的为0.25～0.30mg/mL。
测定完整藻胆体的荧光光谱，如图1所示，曲线a是钝顶螺旋藻藻胆体的室温荧光发射光谱，其发射峰位于680nm处，该峰值是AP-B的荧光发射峰，没有C-藻篮蛋白(C-PC)(648nm)及异藻篮蛋白(APC)(660nm)的荧光发射峰，说明在纯化的藻胆体的内，C-PC和APC吸收的光能均能高效地传递给能量的末端受体AP-B，因而证明所得的藻胆体是完整的。曲线b是藻胆体的激发光谱，680nm的荧光激发峰有两处，其中622nm处为最大激发峰，来自于C-PC，这说明藻胆体680nm荧光发射峰的能量主要来源于C-PC，而650nm处为一肩峰，来自于异藻篮蛋白(APC)，进一步说明藻胆体是完整的。
4、完整藻胆体的稳定性保护采用葡聚糖，对藻胆体非共价交联，准确称量相对分子质量为20000的葡聚糖，加入到上述步骤3完整藻胆体溶液中，溶解，使终浓度达9～10％(W/V)，将该溶液的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾的离子强度降为0.6mol/L，20℃保存，保存30天。
作为对照的是在磷酸氢二钠—磷酸二氢钾的离子强度降为1.0mol/L保存的未加葡聚糖的藻胆体，测定藻胆体的荧光光谱，藻胆体依然保持完整，如图2和图3所示。
图2中V＝F676nm/F650nm，反映藻胆体的解离程度，V值越大，藻胆体越完整，V值越小，藻胆体的解离程度越大。葡聚糖的加入，使得钝顶螺旋藻藻胆体(0.6mg/mL)的V值增加，说明葡聚糖使藻胆体结合得更为紧密。
图3表明在30天的考查期(于1mol/L缓冲液中，pH7，20℃保存)内，与对照藻胆体相比，加入葡聚糖的藻胆体的V值始终大于对照组相应的V值，而且保存过程中V值的降低量较小。保存30天后，加入葡聚糖的藻胆体的荧光发射峰位置变化不大，由676nm蓝移至671nm，且在650nm左右未出现肩峰，而对照藻胆体已出现明显的650nm左右的肩峰，荧光发射主峰亦蓝移至668nm。外观上看，保存30天后，加葡聚糖的藻胆体形成蓝色沉淀沉降在试管底部，上清液澄清，而对照组藻胆体蓝色溶液已出现较多的白色絮状沉淀，说明已有少量藻胆蛋白变性。这些结果说明葡聚糖对藻胆体的稳定性有明显的保护作用。
实施例2、如实施例1所述，所不同的是步骤4完整藻胆体的稳定性保护采用甲醛交联技术，对藻胆体分子内进行共价交联，取上述步骤3完整藻胆体溶液，用0.75mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.98)调整蛋白浓度至0.28mg/mL，然后，取该藻胆体溶液1.8mL，边振荡边缓慢滴加用0.75mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液配制的4％(W/V)甲醛浓溶液0.2mL，直至甲醛浓度为0.4％(W/V)，20℃保温12h。所得藻胆体溶液，用去离子水稀释至低离子浓度0.1mol/L，20℃温育30天，测量其荧光光谱，结果表明在0.1mol/L低离子强度下保存30天，稳定化的藻胆体依然保持完整。如图4所示。
图4是稳定化的钝顶螺旋藻藻胆体的室温荧光光谱，其中，a荧光激发光谱，Em＝665nm；b荧光发射光谱，Ex＝580nm。其荧光发射峰在665nm，为异藻蓝蛋白(APC)的荧光发射峰，未出现650nm C-藻蓝蛋白的荧光发射峰，说明能量可高效地自C-藻蓝蛋白传递到异藻蓝蛋白；稳定化藻胆体的最大荧光激发峰在626nm，较对照藻胆体的(622nm)有所微移，稳定化藻胆体在650nm左右也有一激发肩峰。这些结果说明钝顶螺旋藻藻胆体的稳定化处理并没有改变藻胆体原有的能量传递特性。
实施例3、红藻完整藻胆体的稳定化技术，方法如下如实施例1所述，所不同的是步骤1的原料是单细胞红藻紫球藻0.9g，溶于18mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.8)中，超声波破碎细胞，破碎功率为12～15W，破碎6次，每次2min，间隔3min。
实施例4、如实施例2所述，所不同的是步骤1的原料是大型红藻多管藻1.0g，溶于20mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液(pH＝7.0)中，超声波破碎细胞，破碎功率为12～15W，破碎6次，每次2 min，间隔3min。
步骤3提取藻胆体的蔗糖密度梯度离心的方法取步骤2制备的藻胆体粗提液4mL，小心叠加到蔗糖密度梯度离心管的上层，从底层到上层蔗糖的摩尔浓度及体积2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L-15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm离心3～4h，取1mol·L-1层的蓝色液，对1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液透析过夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液稀释，至藻胆蛋白浓度的为0.30mg/mL。
权利要求
1.蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，方法如下(1)原料的破碎以新鲜的蓝藻或红藻为原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，采用超声波破碎细胞；(2)藻胆体解离在上述破碎的藻体中加入去污剂吐温X-100，使藻胆体从类囊体膜上解离下来，离心，去除去污剂、叶绿素和破碎的细胞，得藻胆体的粗提物；(3)完整藻胆体的提取以蔗糖密度梯度高速离心的方法提取制备上述蓝藻或红藻的完整藻胆体。(4)完整藻胆体的稳定性保护采用下列方法之一①采用葡聚糖，对藻胆体非共价交联，准确称量相对分子质量为20000的葡聚糖，加入到上述步骤3完整藻胆体溶液中，溶解，使终浓度达9～10％W/V；②采用甲醛交联技术，对藻胆体分子内进行共价交联，取上述步骤3完整藻胆体溶液，用0.75mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液pH＝6.98，调整蛋白浓度至0.25～0.30mg/mL，然后，取该藻胆体溶液1.8mL，边振荡边缓慢滴加用0.75mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的3～5％W/V甲醛浓溶液0.2mL，直至甲醛浓度为0.3～0.5％W/V，20℃保温12-13h。
2.如权利要求1所述的蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，其特征在于蓝藻选自钝顶螺旋藻或鱼腥藻，红藻选自单细胞红藻紫球藻、大型红藻多管藻或三叉仙菜。
3.如权利要求1所述的蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，其特征在于步骤(1)新鲜藻体0.75～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，超声波破碎，破碎功率为12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，间隔2～3min。
4.如权利要求1所述的蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，其特征在于步骤(2)加入去污剂吐温X-100的体积百分比浓度为1.9～2.1％，室温下，缓慢搅拌1小时～1.5小时，13000rpm～15000rpm离心1～2次，收集出离心管中部的溶液。
5.如权利要求1所述的蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，其特征在于步骤(3)具体为取步骤2制备的藻胆体粗提液3～4mL，叠加到蔗糖密度梯度离心管的上层，从底层到上层蔗糖的摩尔浓度及体积2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L- 15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm离心3～4h，取1mol·L-1层的蓝色液，对1mol·L-1的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液透析过夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液稀释，至藻胆蛋白浓度为0.25～0.30mg/mL。
全文摘要
蓝藻和红藻完整藻胆体的稳定化技术，属于海洋生物技术领域。本发明以红藻和蓝藻为材料，应用超声波破碎细胞、去污剂TritonX－100从类囊体膜上解离藻胆体、常规离心去除TritonX－100、叶绿素和细胞碎片、应用蔗糖密度梯度超速离心制备完整藻胆体，然后应用多糖葡聚糖非共价键包被和甲醛共价交联两种方法，对藻胆体的完整性进行保护，室温下保存30天，藻胆体依然保持完整，没有解离。从而为将藻胆体应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础。
文档编号C12N1/12GK1654627SQ20051004202
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者张玉忠, 张熙颖, 陈秀兰, 周百成 申请人:山东大学