专利名称：一种改装钝顶螺旋藻整藻胆体的方法
技术领域：
本发明涉及一种改装钝顶螺旋藻整藻胆体的方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
为了研究蛋白质等生物大分子的细胞定位、相互作用及其动态变化，研究人员急需新技术和新材料来实现对蛋白质等生物大分子的“标识”、“阅读”和“查询”。现在常用的荧光标记，由于荧光染料分子荧光特性的限制(荧光光谱较宽、量子产率低)，远远不能适用于高通量的生物大分子专一标识。
藻胆蛋白是一类光合作用捕光色素-蛋白质复合物，主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中。在光合作用中起捕获和传递光能的作用，具有强烈的荧光。在蓝藻和红藻中，由2-3种藻胆蛋白组成超分子结构藻胆体，形成高效的能量传递序列。在80年代中期，美国研究藻类光合作用的学者提出将藻胆蛋白作为荧光标记物，用于诊断试剂。由于其独特的优点，藻胆蛋白和藻胆蛋白标记的诊断试剂在90年代初进入国际市场。
同常用的荧光标记物相比，藻胆蛋白具有下列优点生产过程安全、无毒，光能吸收强，荧光产率高，超过90％，背景光干扰和假阳性率低，在pH4-11的范围内稳定，可以作双色、三色和四色标记。所以，这类试剂的应用范围不断扩大。但是，由于价格昂贵，尚未应用到普及型的临床诊断试剂。我国全部进口，也仅限于用细胞流式仪进行的诊断。
藻胆蛋白做为荧光探针，有其独特的优势，但单个的藻胆蛋白分子，由于其分子较小、分子中含有的色素基团较少，因此，产生荧光的亮度不够，使得在高分辨率的检测中灵敏度不高。美国莫森曼(J.P.Morseman)提出，应用固定化的完整藻胆体做为荧光探针，可用于多种生物医学检测。由于藻胆体中含有更多的色素基团，因此，其亮度较高，并且，激发波长为藻红蛋白(PE)或藻蓝蛋白(PC)的吸收波长，而荧光发射来自APC，因此，激发波长和发射波长相距更远，避免相互干扰。钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)是目前可以进行规模化养殖的单细胞丝状蓝藻，是制备完整藻胆体的良好材料，钝顶螺旋藻的藻胆体由藻蓝蛋白(CPC)和异藻蓝蛋白(APC)及少量连接蛋白组成，其高效激发波长为CPC的最大吸收峰620nm，其发射峰是APC的荧光发射峰680nm，斯托克位移为80nm，为了进一步加大斯托克位移，更好的避免激发光对发射荧光的干扰，可以对易于制备的钝顶螺旋藻藻胆体进行人工改装。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法。能进一步加大钝顶螺旋藻完整藻胆体斯托克位移，更好的避免激发光对发射荧光的干扰。
本发明的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，步骤如下(1)以新鲜的蓝藻—钝顶螺旋藻为原料，溶于磷酸氢二钾—磷酸二氢钾溶液中，采用超声波破碎细胞。
(2)在破碎的藻体中加入去污剂，将藻胆体从类囊体膜上解离下来，离心，去除去污剂和破碎的细胞，制备藻胆体的粗提物。
去污剂的加入量本发明不作特别限定，按本领域现有技术，以能使藻胆体从类囊体膜上解离为宜。
(3)采用戊二醛交联技术，用R-藻红蛋白(RPE)改装钝顶螺旋藻藻胆体，具体如下取步骤(2)的藻胆体的粗提物用0.9mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液配制成溶液，取钝顶螺旋藻藻胆体溶液0.3mL～0.4mL，迅速与0.07mL～0.09mL R-藻红蛋白溶液混合，R-藻红蛋白溶液用0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH6.8。将混合液边振荡边缓慢滴加用0.75mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液配制的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.02mL～0.04mL，19～22℃反应2小时～2.5小时，加1mol/L的甘氨酸溶液0.04mL～0.06mL终止反应30分钟～40分钟，即得改装的钝顶螺旋藻藻胆体。
对改装的钝顶螺旋藻藻胆体进一步纯化，继续以下步骤(4)用聚乙二醇沉淀改装后的藻胆体，离心，收集沉淀。
(5)将步骤(4)所得的藻胆体沉淀重新溶解于磷酸氢二钠—磷酸二氢钾溶液中，再将该藻胆体溶液过Sepharose CL-4B柱层析，收集洗脱前端的紫红色溶液，得到纯化的改装钝顶螺旋藻整藻胆体。
对步骤(5)得到纯化的改装钝顶螺旋藻整藻胆体测定光谱，检测藻胆体的改装效果(见图3)。
上述各步骤中，没有特别限定的部分均可采用本领域现有技术。也可采用本发明在下面提供的详细的操作说明。
上述步骤(1)原料的破碎具体操作为新鲜钝顶螺旋藻0.75～1.0g，溶于15～20mL1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.8～7.0)中，超声波破碎，破碎功率为12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，间隔2～3min。
上述步骤(2)藻胆体解离具体操作为在破碎的藻体溶液中加入去污剂吐温X-100(TritonX-100)，体积百分比浓度1.9～2.1％，室温下，缓慢搅拌1小时～1.5小时，13000rpm～15000rpm离心3-4次，去除表层的TritonX-100、叶绿素和底部的细胞碎片，收集出离心管中部的溶液，即为藻胆体粗提液，其中混有少量的破碎藻胆体。
上述步骤(4)所用聚乙二醇为聚乙二醇6000。
上述步骤(5)所用的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液pH＝6.8～7.0，浓度为1mol·L-1，藻胆体沉淀与磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液的重量比为1∶1.5～2.0。
上述步骤(5)Sepharose CL-4B柱为2.0cm×30cm，用pH＝6.98浓度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液洗脱，流速为0.4mL·min-1～0.5mL·min-1。
本发明以可以大规模培养的蓝藻钝顶螺旋藻为材料，首先应用超声波破碎细胞、去污剂TritonX-100从类囊体膜上解离藻胆体、常规离心去除TritonX-100、叶绿素和细胞碎片得到钝顶螺旋藻藻胆体，然后应用戊二醛交联技术，用RPE改装钝顶螺旋藻藻胆体，最后经聚乙二醇沉淀和Sepharose CL-4B柱(2.0×30cm)层析得到纯的用RPE改装的钝顶螺旋藻藻胆体。
本方法的优良效果为(1)以可以大规模人工培养的藻胆体由CPC和APC组成的钝顶螺旋藻为材料，从而可以大量得到低成本的原材料；(2)以用常规设备和试剂为主的简易方法大量、快速制备藻胆体，从而避免了传统制备藻胆体的蔗糖密度剃度超速离心方法对设备要求高、操作复杂、并且很难进行大量制备的缺点；(3)用激发波长为498nm的RPE，依托戊二醛交联技术，对钝顶螺旋藻藻胆体进行改装，改装后的藻胆体，激发波长为RPE的吸收峰498nm，而发射波长为APC的荧光发射峰660～680nm，斯托克位移达到180nm，改装前的斯托克位移为80nm，斯托克位移加大80～100nm，从而可有效避免激发光对发射光的干扰。同时，由于每个RPE上含有6个色素色素基团，因此，改装后的藻胆体含有更多的色素基团，亮度更高。因此，改装后的藻胆体，可以大幅度的提高检测的质量和检测灵敏度，在超灵敏的生物医学检测中具有很好的应用前景。
图1是R-藻红蛋白(曲线1)和钝顶螺旋藻藻胆体(曲线2)的吸收光谱。由曲线1可看到R-藻红蛋白有三个吸收峰，分别位于565nm，539nm，498nm，这是三峰型R-藻红蛋白的特征吸收峰，曲线2可看到钝顶螺旋藻的最大吸收峰在613nm，在650nm处有肩峰。
图2是R-藻红蛋白和钝顶螺旋藻藻胆体的交联物(粗线)及混合物(细线)的吸收光谱。与图1比较，R-藻红蛋白和钝顶螺旋藻藻胆体混合物的吸收光谱(图中细线)显然是R-藻红蛋白和藻胆体两者吸收光谱的叠加，其中R-藻红蛋白539nm的吸收峰在混合物中成为吸收肩峰，而混合物在紫外区的吸收峰依然在278nm。
图3是R-藻红蛋白和钝顶螺旋藻藻胆体的交联物(1)及混合物(2)的室温荧光发射光谱(激发波长480nm)。可以看到，混合物(曲线2)在480nm光激发下在578nm有最大发射峰，此峰为R-藻红蛋白的特征发射峰，在其他位置没有峰出现，说明R-藻红蛋白吸收能量后以自身荧光的形式发散掉，中间无能量传递过程。而交联物(曲线1)的发射光谱除在578nm出现R-藻红蛋白的发射峰外，在660nm出现另一发射峰，这是藻胆体的荧光发射峰(或异藻蓝蛋白的发射峰)，而且R-藻红蛋白的发射峰的荧光强度明显降低，说明R-藻红蛋白已将部分能量传递给了藻胆体，证明R-藻红蛋白与藻胆体交联成功。
图4是R-藻红蛋白和钝顶螺旋藻藻胆体的交联物(1)及混合物(2)的室温荧光激发光谱(发射波长660nm)。图中，混合物(曲线2)的660nm的激发峰在618nm，这是藻胆体的峰，在其他位置没有明显的激发峰，说明混合物660nm荧光主要来自于藻胆体自身的光吸收；而交联物的激发光谱(曲线1)显示除了618nm的激发峰，还有498nm和568nm两个R-藻红蛋白的激发峰，568nm的峰值甚至与618nm的峰值相当，这说明交联物660nm的荧光是由R-藻红蛋白吸收光能产生激发态，并将能量传递给藻胆体产生的荧光。由以上分析可知，只有R-藻红蛋白与藻胆体共价交联在一起，才存在能量从R-藻红蛋白向藻胆体的传递，若两者没有共价交联在一起，则没有能量传递进行。
具体实施方式
实施例1(1)新鲜的钝顶螺旋藻1.0g溶于pH＝6.9的20mL 1mol·L-1磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液中，采用超声波破碎细胞，破碎功率为15W，破碎5次，每次2min，间隔2min。
(2)在破碎的藻体中加入去污剂TritonX-100，藻体与去污剂体积比为1∶0.2，室温下，缓慢搅拌1.5小时，使藻胆体从类囊体膜上解离下来。14000rpm离心4次，去除表层的TritonX-100、叶绿素和底部的细胞碎片，收集出离心管中部的溶液，即为藻胆体粗提液，其中混有少量的破碎藻胆体。
(3)取步骤(2)的藻胆体的粗提物用0.9mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液pH＝6.8～7.0按1∶1的比例配制成溶液，取钝顶螺旋藻藻胆体溶液0.3mL，迅速与0.07mL R-藻红蛋白溶液混合，R-藻红蛋白溶液用0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH6.8，蛋白浓度1mg/ml。将混合液边振荡边缓慢滴加用0.75mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液配制的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.02mL，20℃反应2h，加1mol/L的甘氨酸溶液0.05mL终止反应30min，即得改装的钝顶螺旋藻藻胆体。
(4)用聚乙二醇6000沉淀藻胆体，收集沉淀。
(5)将沉淀重新溶解于pH＝6.9浓度1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾溶液中，然后过2.0×30cm的Sepharose CL-4B柱层析，用pH＝6.98浓度0.9mol·L-1磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液洗脱，流速为0.45mL·min-1。收集洗脱前端的蓝紫色溶液，得到纯化的改装的钝顶螺旋藻整藻胆体。
改装的钝顶螺旋藻整藻胆体用R-藻红蛋白的吸收峰498nm激发，而发射波长为APC的荧光发射峰660nm，斯托克位移达到160nm，改装前的斯托克位移为80nm，斯托克位移加大了80nm，从而可有效避免激发光对发射光的干扰，同时，由于每个R-藻红蛋白上含有6个色素色素基团，因此，改装后的藻胆体含有更多的色素基团，亮度更高。因此，改装后的藻胆体，可以大幅度的提高检测的质量和检测灵敏度。
实施例2如实施例1所不同的是步骤(3)如下取步骤(2)的藻胆体的粗提物用0.9mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液pH＝6.8～7.0按1∶1的比例配制成溶液，取钝顶螺旋藻藻胆体溶液0.4mL，迅速与0.08mLR-藻红蛋白溶液混合，R-藻红蛋白溶液用0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH6.8，蛋白浓度1.5mg/ml。将混合液边振荡边缓慢滴加用0.75mol/L的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液配制的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.03mL，19℃反应2.5小时，加1mol/L的甘氨酸溶液0.055mL终止反应35分钟，即得改装的钝顶螺旋藻藻胆体。
权利要求
1.一种改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，步骤如下(1)以新鲜的蓝藻-钝顶螺旋藻为原料，溶于磷酸氢二钾-磷酸二氢钾溶液中，采用超声波破碎细胞；(2)在破碎的藻体中加入去污剂，将藻胆体从类囊体膜上解离下来，离心，去除去污剂和破碎的细胞，制备藻胆体的粗提物；(3)采用戊二醛交联技术，用R-藻红蛋白改装钝顶螺旋藻藻胆体，具体如下取步骤(2)的藻胆体的粗提物用0.9mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制成溶液，取钝顶螺旋藻藻胆体溶液0.3mL～0.4mL，迅速与0.07mL～0.09mL R-藻红蛋白溶液混合，R-藻红蛋白溶液用0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH6.8；将混合液边振荡边缓慢滴加用0.75mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.02mL～0.04mL，19～22℃反应2小时～2.5小时，加1mol/L的甘氨酸溶液0.04mL～0.06mL终止反应30分钟～40分钟，即得改装的钝顶螺旋藻藻胆体。
2.如权利要求1所述的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，其特征在于，对改装的钝顶螺旋藻藻胆体进一步纯化，继续以下步骤(4)用聚乙二醇沉淀改装后的藻胆体，离心，收集沉淀；(5)将步骤(4)所得的藻胆体沉淀重新溶解于磷酸氢二钠-磷酸二氢钾溶液中，再将该藻胆体溶液过Sepharose CL-4B柱层析，收集洗脱前端的紫红色溶液，得到纯化的改装钝顶螺旋藻整藻胆体。
3.如权利要求1所述的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，其特征在于，所述步骤(1)原料钝顶螺旋藻0.75～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中。
4.如权利要求1所述的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，其特征在于，所述步骤(1)超声波破碎功率为12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，间隔2～3min。
5.如权利要求1所述的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，其特征在于，所述步骤(2)去污剂是吐温X-100，体积百分比浓度1.9～2.1％，室温下，缓慢搅拌1小时～1.5小时，13000rpm～15000rpm离心3-4次，收集出离心管中部的溶液。
6.如权利要求2所述的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，其特征在于，所述步骤(4)所用聚乙二醇为聚乙二醇6000。
7.如权利要求2所述的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，其特征在于，所述步骤(5)所用的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液pH＝6.8～7.0，浓度为1mol·L-1。
8.如权利要求2所述的改装钝顶螺旋藻完整藻胆体的方法，其特征在于，所述步骤(5)Sepharose CL-4B柱为2.0cm×30cm，用pH＝6.98浓度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗脱，流速为0.4mL·min-1～0.5mL·min-1。
全文摘要
一种改装钝顶螺旋藻整藻胆体的方法，属于海洋生物技术领域。本发明以可以大规模培养的蓝藻钝顶螺旋藻为材料，首先应用超声波破碎细胞、去污剂TritonX－100从类囊体膜上解离藻胆体、常规离心去除TritonX－100、叶绿素和细胞碎片得到钝顶螺旋藻藻胆体，然后应用戊二醛交联技术，用RPE改装钝顶螺旋藻藻胆体，最后经聚乙二醇沉淀和Sepharose CL－4B柱层析得到纯的用RPE改装的钝顶螺旋藻藻胆体。改装后的藻胆体，可以大幅度的提高检测的质量和检测灵敏度，在超灵敏的生物医学检测中具有很好的应用前景。
文档编号C12N1/12GK1654628SQ20051004202
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者张玉忠, 张熙颖, 陈秀兰, 周百成 申请人:山东大学