专利名称：一种完整藻胆体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种完整藻胆体的制备方法，具体地涉及从红藻和蓝藻中分离制备完整藻胆体的方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
藻胆蛋白是一类光合作用捕光色素-蛋白质复合物，主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中。在光合作用中起捕获和传递光能的作用，具有强烈的荧光。在蓝藻和红藻中，由2-3种藻胆蛋白组成超分子结构藻胆体，形成高效的能量传递序列。在80年代中期，美国研究藻类光合作用的学者提出将藻胆蛋白作为荧光标记物，用于诊断试剂。由于其独特的优点，藻胆蛋白和藻胆蛋白标记的诊断试剂在90年代初进入国际市场。
同常用的荧光标记物相比，藻胆蛋白具有下列优点生产过程安全、无毒，光能吸收强，荧光产率高，超过90％，背景光干扰和假阳性率低，在pH4-11的范围内稳定，可以作双色、三色和四色标记。所以，这类试剂的应用范围不断扩大。但是，由于价格昂贵，尚未应用到普及型的临床诊断试剂。我国全部进口，也仅限于用细胞流式仪进行的诊断。
藻胆蛋白做为荧光探针，有其独特的优势，但单个的藻胆蛋白分子，由于其分子较小、分子中含有的色素基团较少，因此，产生荧光的亮度不够，使得在高分辨率的检测中灵敏度不高。美国莫森曼(J.P.Morseman)提出，应用固定化的完整藻胆体做为荧光探针，可用于多种生物医学检测。由于藻胆体中含有更多的色素基团，因此，其亮度较高，并且，激发波长为藻红蛋白(PE)或藻蓝蛋白(PC)的吸收波长，而荧光发射来自APC，因此，激发波长和发射波长相距更远，避免相互干扰。其中，低成本的完整藻胆体的快速制备技术是制约该技术能否推广应用的关键。目前，藻胆体的制备技术都采用蔗糖密度离心的方法，由于蔗糖密度梯度法制备藻胆体操作繁琐，且必需超高速离心机，因而，寻找简便、迅速、规模化制备藻胆体替代方法显得尤为重要。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种完整藻胆体的制备方法，工艺简便、迅速，可规模化生产完整藻胆体。
本发明的完整藻胆体的制备方法，步骤如下(1)原料的破碎以新鲜的蓝藻和红藻为原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液中，采用超声波破碎细胞。
上述蓝藻选自钝顶螺旋藻或极大螺旋藻，红藻选自单细胞红藻紫球藻、大型红藻多管藻或三叉仙菜。
(2)藻胆体解离在破碎的藻体中加入去污剂吐温X-100(TritonX-100)，使藻胆体从类囊体膜上解离下来。离心，去除去污剂和破碎的细胞，得藻胆体的粗提物。
去污剂的加入量本发明不作特别限定，按本领域现有技术，以能使藻胆体从类囊体膜上解离为宜。
(3)藻胆体的浓缩用聚乙二醇沉淀藻胆体，收集沉淀。将沉淀重新溶解于pH＝6.8～7.0磷酸氢二钠—磷酸二氢钾溶液中。
(4)完整藻胆体的纯化将上述藻胆体溶液过Sepharose CL-4B柱层析，收集洗脱前端的蓝紫色溶液，得到完整的藻胆体溶液。
上述步骤(1)原料的破碎具体为新鲜藻体0.75～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.8～7.0)中，超声波破碎，破碎功率为12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，间隔2～3min。
上述步骤(2)藻胆体解离具体为在破碎的藻体溶液中加入体积百分比浓度为1.9～2.1％TritonX-100(V/V)，室温下，缓慢搅拌1小时～1.5小时，13000rpm～15000rpm离心3-4次，去除表层的TritonX-100、叶绿素和底部的细胞碎片，收集出离心管中部的溶液，即为藻胆体粗提液，其中混有少量的破碎藻胆体。
上述步骤(3)藻胆体的浓缩中所用聚乙二醇为聚乙二醇6000， 所用的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液pH＝6.8～7.0，浓度1mol·L-1，磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液的用量以能溶解沉淀为宜，没有特别限定。
上述步骤(4)Sepharose CL-4B柱为2.0×30cm，用pH＝6.98浓度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液洗脱，流速为0.4～0.5mL·min-1。
本发明以红藻和蓝藻为材料，应用超声波破碎细胞、去污剂TritonX-100从类囊体膜上解离藻胆体、常规离心去除TritonX-100、叶绿素和细胞碎片、聚乙二醇沉淀、最后经Sepharose CL-4B柱层析得到纯的完整藻胆体。本方法省去了传统的蔗糖密度剃度超速离心方法对设备要求高、操作复杂、并且很难进行大量制备的缺点，优良效果在于可以应用常规设备、对设备要求简单，容易大量制备并且大大降低了藻胆体的制备成本，从而为将藻胆体应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础，具有很好的应用前景和经济效益。
图1是实施例1层析法制备的藻胆体的吸收和室温荧光光谱。曲线1荧光激发光谱，Em＝680nm；曲线2吸收光谱；曲线3荧光发射光，Ex＝580nm曲线4荧光发射光谱，Ex＝436nm。
具体实施方式
实施例1完整藻胆体的制备方法，包括如下步骤(1)原料的破碎新鲜的蓝藻钝顶螺旋藻0.5g、单细胞红藻紫球藻0.4g为原料，溶于pH＝6.9的20mL 1mol·L-1磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液中，采用超声波破碎细胞，破碎功率为15W，破碎5次，每次2min，间隔2min。
(2)藻胆体解离在破碎的藻体中加入去污剂TritonX-100浓度2.0％(体积)，藻体与去污剂体积比为1∶0.2，室温下，缓慢搅拌1.5小时，使藻胆体从类囊体膜上解离下来。14000rpm离心4次，去除表层的TritonX-100、叶绿素和底部的细胞碎片，收集出离心管中部的溶液，即为藻胆体粗提液，其中混有少量的破碎藻胆体。
(3)藻胆体的浓缩用聚乙二醇6000沉淀藻胆体，收集沉淀。将沉淀重新溶解于pH＝6.8～7.0浓度1mol·L-1的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾溶液中。
(4)完整藻胆体的纯化将上述藻胆体溶液过2.0×30cm的Sepharose CL-4B柱层析，用pH＝6.98浓度0.9mol·L-1磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液洗脱，流速为0.45mL·min-1。收集洗脱前端的蓝紫色溶液，得到完成的藻胆体溶液。
图1显示，钝顶螺旋藻藻胆体的吸收峰在620nm处，没有436nm的叶绿色的特征吸收峰(曲线2)。用580nm波长的光激发，藻胆体的发射波长在680nm(曲线3)，这与蔗糖密度梯度高速离心法制备的藻胆体的发射波长相同，说明该种藻胆体是完整的；而用436nm波长的光激发，其发射波长依然为680nm(曲线4)，没有出现叶绿素的特征荧光峰，且其680nm激发峰在621nm，也未出现叶绿素的特征峰值(曲线1)，说明藻胆体溶液内不含叶绿素。
实施例2如实施例1所述，所不同的是步骤(1)原料为新鲜的钝顶螺旋藻(蓝藻)0.4g和多管藻(大型红藻)0.5g，溶于pH＝7.0的16mL 1mol·L-1磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液中，采用超声波破碎细胞，破碎功率为14W，破碎6次，每次1.5min，间隔3min。
实施例3如实施例1所述，所不同的是步骤(1)原料为钝顶螺旋藻0.3g和多管藻0.7g。
实施例4如实施例1所述，所不同的是步骤(1)原料为钝顶螺旋藻0.5g和三叉仙菜0.5g。
权利要求
1.一种完整藻胆体的制备方法，步骤如下(1)原料的破碎以新鲜的蓝藻和红藻为原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，采用超声波破碎细胞；(2)藻胆体解离在破碎的藻体中加入去污剂吐温X-100，使藻胆体从类囊体膜上解离下来，离心，去除去污剂和破碎的细胞，得藻胆体的粗提物；(3)藻胆体的浓缩用聚乙二醇沉淀藻胆体，收集沉淀；将沉淀重新溶解于pH＝6.8～7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾溶液中；(4)完整藻胆体的纯化将上述藻胆体溶液过Sepharose CL-4B柱层析，收集洗脱前端的蓝紫色溶液，得到完整的藻胆体溶液。
2.如权利要求1所述的完整藻胆体的制备方法，其特征在于，所述蓝藻选自钝顶螺旋藻或极大螺旋藻。
3.如权利要求1所述的完整藻胆体的制备方法，其特征在于，所述红藻选自单细胞红藻紫球藻、大型红藻多管藻或三叉仙菜。
4.如权利要求1所述的完整藻胆体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)原料0.75g～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中。
5.如权利要求1所述的完整藻胆体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的超声波破碎，破碎功率为12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，间隔2～3min。
6.如权利要求1所述的完整藻胆体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)藻胆体解离具体为加入体积百分比浓度为1.9～2.1％的去污剂吐温X-100，室温下，缓慢搅拌1小时～1.5小时，13000rpm～15000rpm离心3-4次。
7.如权利要求1所述的完整藻胆体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)Sepharose CL-4B柱为2.0×30cm，用pH＝6.98浓度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗脱，流速为0.4～0.5mL·min-1。
全文摘要
一种完整藻胆体的制备方法，属于海洋生物技术领域。本发明以红藻和蓝藻为材料，应用超声波破碎细胞、去污剂从类囊体膜上解离藻胆体、常规离心去除去污剂、叶绿素和细胞碎片、聚乙二醇沉淀、最后经Sepharose CL－4B柱层析得到纯的完整藻胆体。本方法省去了传统的蔗糖密度剃度超速离心方法对设备要求高、操作复杂、并且很难进行大量制备的缺点，优良效果在于可以应用常规设备、对设备要求简单，容易大量制备并且大大降低了藻胆体的制备成本，从而为将藻胆体应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础，具有很好的应用前景和经济效益。
文档编号C12N1/12GK1654629SQ200510042029
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者张玉忠, 张熙颖, 陈秀兰, 周百成 申请人:山东大学