专利名称：鱼类虹彩病毒实时荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类虹彩病毒，特别是大黄鱼虹彩病毒的定量检测方法。
背景技术：
近年来，随着鱼类养殖业的快速发展，由虹彩病毒所引起的鱼类养殖病害正日益加剧，已引发多种经济名贵鱼如大黄鱼、石斑鱼、鳜鱼、鲆鱼、鲈鱼、美国红鱼等大规模死亡。据估计每年由虹彩病毒所致水产病害造成的经济损失达数十亿元。对于鱼类病毒性疾病，目前尚没有特效的治疗方法，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此，建立快速灵敏实用的鱼类虹彩病毒PCR检测技术，不仅能快速诊断病因、及时预测预报虹彩病毒所致病害的发生，减少经济损失，而且也是今后加强科学养殖管理，建立种苗检疫体系所必须的。
目前，对鱼类虹彩病毒的检测主要有电镜观察、常规组织学方法、免役组织化学法和原位杂交，但这些技术分别使用时，却各有其局限性。电镜观察耗时长，费用高并需要具备特殊的实验器材且视野较窄；组织病理观察则不太适用于早期检测，通常在病毒严重感染机体全身，产生明显的、不可逆转的组织病变时，方可得到确证；免疫组织化学法和原位杂交操作相对比较烦琐，灵敏度不高，且不能对病毒进行定量研究。PCR方法因为其操作简单、快速、灵敏度高等特点已广泛应用于鱼类虹彩病毒的检测。日本学者Oshima等以虹彩病毒核糖核酸还原酶小亚基基因高度保守序列设计合成引物，建立的PCR检测方法可用于真鲷虹彩病毒的早期诊断，但由于核糖核酸还原酶小亚基基因在各DNA病毒之间具有较高的同源性，利用其作为靶序列设计引物和建立PCR检测方法，可能会发生非特异性扩增，而影响PCR检测的特异性。Tamai等以一段与蛙虹彩病毒3型具有高度同源性的片段作为特异性探针，研制了鱼类虹彩病毒核酸探针检测方法。在实际应用中核酸探针检测方法的主要不足是其操作过程繁琐，且灵敏度不如PCR检测技术。Mao等人根据脊椎动物虹彩病毒主要衣壳蛋白基因保守区序列设计合成了一对引物，运用PCR技术可稳定地扩增几种脊椎动物虹彩病毒的相应序列，认为该PCR方法可应用于鱼类虹彩病毒的检测，但其仅应用于蛙病毒属的虹彩病毒。近几年国内在鱼类虹彩病毒的研究方面也取得了一些进展，邓敏等根据DNA病毒核糖核酸还原酶小亚基基因高度保守序列设计合成了一对引物，对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因组进行了扩增，并建立了PCR检测方法。本实验室通过比较几种虹彩病毒ATP酶基因序列，选择其中比较保守的区域设计了一对引物，建立了快速、简便的PCR检测方法。
实时荧光定量PCR技术巧妙的利用了PCR技术的DNA高效扩增、探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性。目前，荧光定量PCR技术已广泛应用于各种病毒的检测，如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肝炎病毒、HIV、腺病毒等，但还未见荧光定量PCR应用于虹彩病毒检测的报道。
发明内容
本发明的思路是通过对发病鱼排进行流行病学及电镜形态分析，发现引起大黄鱼、石斑鱼等致病的病原为虹彩病毒。在广泛查询分析已报道虹彩病毒核酸序列的基础上，结合生物信息学手段，确定以虹彩病毒ATPase基因保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了一对特异性引物，并根据引物扩增部分的核苷酸序列设计了一条分子信标探针。
通过优化扩增条件和反应体系，扩增出一条约122bp的条带，与预期相符。根据引物扩增的序列，经软件分析设计了一条分子信标探针，经检测发现该探针的荧光信号强度为19.9∶1，荧光淬灭效率为95％，表明该探针能与目的DNA较好的结合，其淬灭基团具有较好的淬灭效率。将含扩增靶序列的阳性质粒按7×108、7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、3.5×101拷贝数/μl系列稀释，各取1ul做模板，以正常鱼组织DNA做阴性对照，在荧光PCR仪上进行扩增反应，结果显示每个反应管内的荧光信号达到阈值所需的循环数(Ct)和起始模板拷贝数的对数存在明显的线形关系(R2＝0.998)，检测的最小模板浓度为7×101拷贝数/μl，相当于70个病毒粒子。然后分别以正常大黄鱼DNA、对虾白斑综合症病毒DNA以及流行性造血组织坏死病毒DNA作为模板，进行PCR扩增以测试该方法检测的特异性，结果仅虹彩病毒感染的鱼组织能检测到扩增产物，而大黄鱼DNA、对虾白斑综合症病毒DNA以及流行性造血组织坏死病毒DNA均无扩增产物产生，证明该方法具有很好的检测特异性；然后以LYCIV DNA为模板，分别用扩增LYCIV主衣壳蛋白(MCP)基因以及DNA聚合酶基因的引物进行荧光PCR扩增，结果没有检测到荧光信号，证明分子信标探针具有很好的与目的DNA结合的特异性。
特异性及灵敏性实验表明了该PCR检测方法不仅可应用于鱼类虹彩病毒早期感染和潜伏感染的检测的快速诊断，还能用于鱼类虹彩病毒。
图1分子信标探针结构示意图；图2不同拷贝数阳性质粒荧光PCR扩增的动力学曲线；(1～87×108～7×101拷贝，9阴性对照)图3荧光定量PCR标准曲线；
具体实施例方式1.PCR模板的制备1.1分别取健康的、自然感染病毒大黄鱼脾和肾，按1∶10(w/v)加入磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.2)，冰浴匀浆。
1.25000rpm，4℃离心10min。
1.3取匀浆离心上清300ul与DNA提取缓冲液等体积混合，同时加蛋白酶K至终浓度为100ul/ml，置37℃作用15min。
1.4加入400ul平衡好的酚，手摇10min后12000rpm离心5min。
1.5取上清用等体积的酚/氯仿/异丙醇(25∶24∶1)抽提1-2次。
1.6再用氯仿/异丙醇(24∶1)抽提一次以彻底去除蛋白。
1.7取上清加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min。
1.812000rpm，4℃离心30min，70％预冷乙醇洗一次，12000rpm离心10min。
1.9风干后溶解于20μlTE中，-20℃保存备用。
2.PCR引物及探针查询分析国际上已报道的虹彩病毒核酸序列，选取虹彩病毒ATPase基因保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设计合成了以下引物对P15’-CGTCACTGGAATGTTCTGGT-3’P25’-TTGTCCACACATGTCTGGCT-3’
预期扩增产物为122bp。
根据引物之间的序列设计合成了一条分子信标5’-Fam-GCCAGCCGTCTATACAACACCTCAGGCTGGC-Dabcyl-3’(划线部分为发夹臂互补序列，其中5’的发夹臂与模板互补，斜体部分为与模板无关序列)。在其5’端标记荧光染料Fam，而3’端则标记荧光淬灭剂Dabcyl。
3.分子信标荧光信号强度检测在比色皿中加入100μl PCR反应缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2)，测定其荧光值(Fbuffer)；然后在再加入终浓度为50nM的分子信标探针，5分钟后测定其荧光值(Fclose)；最后在上述溶液中加入是分子信标20倍摩尔浓度的目的DNA，5分钟后测定其荧光值(Fopen)。分子信标淬灭效率(Eff)按以下公式计算得出Eff＝〔1-(Fopen-Fbuffer)/(Fclose-Fbuffer)〕×100，分子信标荧光信号强度按照以下公式计算得出(Fclose-Fbuffer)/(Fopen-Fbuffer)；。
4.PCR扩增反应反应体系为无菌双蒸水 15.4ul10倍反应缓冲液(10×Buffer) 2.5ulMgCl2(25mM)2ul脱氧核糖核苷酸(dNTP)(2.5mM) 3ul引物1(12.5uM) 0.5ul引物2(12.5uM) 0.5ul分子信标探针(12.5uM)0.6ul模板DNA 1ulTaq DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul反应条件为95℃预处理3min，进行40个循环反应，每个循环反应包括94℃30sec，54℃45sec，72℃45sec，于54℃时测定荧光值。
5.阳性定量标准曲线的建立将鉴定好的质粒，分光光度计测定其浓度，并计算出拷贝数，然后分别稀释成7×108、7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、3.5×101拷贝数/μl浓度梯度，按上述PCR反应体系和反应程序在荧光PCR仪进行扩增，经计算机分析得出不同拷贝数的Ct值，根据Ct值以及相应拷贝数的对数做出标准曲线。
6.荧光PCR特异性试验分别以正常大黄鱼DNA、对虾白斑综合症病毒(white spot syndromevirus，WSSV)DNA以及流行性造血组织坏死病毒(EHNV)DNA作为模板，进行荧光PCR扩增以测试该方法检测的特异性；以LYCIV DNA为模板，分别用扩增LYCIV主衣壳蛋白(MCP)基因以及DNA聚合酶基因的引物进行荧光PCR扩增，以检测分子信标与目的DNA结合的特异性。
权利要求
1.一种鱼类虹彩病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于选取虹彩病毒ATPase基因保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设计合成特异性的引物和分子信标探针，对鱼类虹彩病毒进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的一种鱼类虹彩病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于设计合成了以下引物对和分子信标探针P15’-CGTCACTGGAATGTTCTGGT-3’P25’-TTGTCCACACATGTCTGGCT-3’5’-Fam-GCCAGCCGTCTATACAACACCTCAGG CTGGC-Dabcyl-3’
3.根据权利要求1所述的一种鱼类虹彩病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于对大黄鱼、石斑鱼、美国红鱼、鲈鱼、真鲷等在内的鱼类虹彩病毒进行定量检测。
4.根据权利要求1所述的一种鱼类虹彩病毒PCR快速检测方法，其特征在于PCR扩增反应反应体系为无菌双蒸水 15.4ul10倍反应缓冲液(10×Buffer) 2.5ulMgCl2(25mM)2ul脱氧核糖核苷酸(dNTP)(2.5mM) 3ul引物1(12.5uM) 0.5ul引物2(12.5uM) 0.5ul分子信标探针(12.5uM)0.6ul模板DNA 1ulTaqDNA聚合酶(5U/ul) 0.5ul反应条件为95℃预处理3min，进行40个循环反应，每个循环反应包括94℃30sec，54℃45sec，72℃45sec，于54℃时测定荧光值。特异性及灵敏性实验表明了该PCR检测方法不仅可应用于鱼类虹彩病毒早期感染和潜伏感染的检测的快速诊断，还能用于鱼类虹彩病毒。
全文摘要
本发明是通过对发病鱼排进行流行病及电镜形态学分析，引起大黄鱼、石斑鱼等致病的病原为虹彩病毒。确定以虹彩病毒ATPase基因保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了一对特异性引物和一条分子信标探针应用于对鱼类虹彩病毒的定量检测。根据不同浓度梯度的阳性质粒制作的定量标准曲线可以看出，不同梯度定量模板数的对数值与Ct值之间有较好的相关关系，其相关系数为0.998；同时，该检测方法具有很高的灵敏度，最低能检测到70个病毒粒子。对其他病毒以及LYCIV其他基因进行检测表明，该方法具有很好的特异性。
文档编号C12Q1/68GK1827778SQ200510042129
公开日2006年9月6日 申请日期2005年3月2日 优先权日2005年3月2日
发明者陈新华, 王小文 申请人:国家海洋局第三海洋研究所