专利名称：芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双价抗病载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双价抗病载体pCam-TuMVCP-CMVCP。属于生物技术领域。
背景技术：
十字花科蔬菜是一种重要的蔬菜作物，病毒病是蔬菜生产过程中非常常见、危害极其严重的病害。如浙江的蔬菜产区，一般年份因病毒病而减产达30％-40％，受害严重的年份减产可达80％以上，甚至绝收。苗期至菜头膨大前后是发病严重的时期，常引起植株生长衰弱，直致死亡。尽管各地的报道的毒原略有差异，但病毒病的病原主要是芜菁花叶病毒(TuMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)。如浙江蔬菜病毒病的主要病原是由TuMV、CMV以及TuMV和CMV复合侵染引起，TuMV的检出率为87.5％，CMV为73.08％，两者复合侵染率为65.38％。研究还发现，随着气候变暖和栽培制度的改变，TuMV和CMV等侵染十字花科作物的主要病毒病原存在季节变化秋季(9-11月)以CMV为主，冬季(12-2月)和春季(3-5月)以TuMV为主。通常防治蔬菜病毒病是喷施农药，防止病毒扩散，但防治效果不理想，且对环境产生污染。利用交叉保护作用，弱病毒株很难寻找。传统育种手段培育抗病毒病的植物品种，会遇到植株的抗病性往往与不良性状紧密连锁，或抗性由多基因控制等问题，使得病毒抗性不理想。这些年来随着生物工程技术的发展，外源基因转化已在作物育种中得到广泛的应用。利用病毒外壳蛋白培育抗病毒的转基因植株的基因工程技术已发展成为抗病毒育种的一条十分诱人的新途径(Powell-Abel et al 1989)。该策略主要将病毒的外壳蛋白(CP)基因进行克隆，体外重组及构建表达载体，然后将重组后的外壳蛋白(CP)基因转化到植物细胞，使外壳蛋白(CP)基因在植物细胞内得以表达，从而使转基因植物获得对该病毒或相关病毒侵染的抗性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双价抗病载体，将芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因共同构建在同一植物表达载体上。
本发明的芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双价抗病载体pCam-TuMVCP-CMVCP，其特征在于由潮霉素(hygromycin)、NoS终止子NoSter、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMVCP)、35S启动子CaMV35Spro、35S启动子CaMV35Spro、芜菁花叶病毒外壳蛋白基因(TuMVCP)、NoS终止子NoSter依次连接而成，芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因共同构建在同一个植物表达载体上。
本发明载体的制备方法，其步骤如下1)从浙江杭州地区收集感病毒病榨菜和小青菜的样本，分别提取TuMV的RNA和CMV的RNA；2)分别以各自的RNA为模板，利用RT-PCR技术，进行扩增，并将扩增产物克隆至T-Vector；3)对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定；4)在序列测定的基础上，利用PCR，将TuMVCP构建到pCambia1301上，得到载体pCam-TuMV CP，将CMVCP构建到pBI121上，得到载体pBI121-CMV CP；5)用EcoRI/PstI双酶切pBI121-CMV CP，回收含有CaMV35Spro-CMV CP-NoSter的片断(1773pb)，用EcoRI/PstI双酶切将pCam-TuMVCP酶切开，将CaMV35Spro-CMVCP-NoSter片断连接在上面，得到双价抗病载体pCam-TuMVCP-CMV CP。
上述步骤4)中的pCambia1301载体是澳大利亚CAMBIA的产品，pBI121是美国CLONTECH的产品，芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的序列早已测定，是现有技术，有关这两个基因及其氨基酸序列的相关研究论文已公开发表。
本发明将芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因共同构建在同一个植物表达载体上(pCam-TuMV CP-CMV CP)，让其同时表达，由于外壳蛋白(CP)封闭了病毒基因组的脱壳过程，使病毒基因组的5′端难以释出，阻止了病毒的基因表达(Abel，1986)；外壳蛋白(CP)干扰病毒RNA的复制，当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，它们立即被细胞中的自由外壳蛋白(CP)所重新包裹，阻止了核酸的复制；外壳蛋白(CP)限制了病毒粒体的扩展与转运。因而使得转外壳蛋白(CP)基因植株获得了对病毒的抗性，从而提高转基因植物的抗性。
图1是本发明的双价抗病载体pCam-TuMVCP-CMVCP结构图。
具体实施例方式
本发明的芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双价抗病载体pCam-TuMVCP-CMVCP如图1所示，由潮霉素、NoS终止子NoSter、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMVCP)、35S启动子CaMV35Spro、35S启动子CaMV35Spro、芜菁花叶病毒外壳蛋白基因(TuMVCP)、NoS终止子NoSter依次连接而成。
双价抗病载体pCam-TuMV CP-CMV CP的制备方法，其步骤如下1.提取感病毒病榨菜的RNA，以RNA为模板，oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下，合成cDNA的第一链，以cDNA第一链为模板，根据TuMV CP基因序列，设计引物为5’引物(5’-ACAGATCTAGCAGGTGAGACGCTTGAT-3’)，3’引物(5’-TAGGTGACCTAACCCCTTAACGCCAAGT-3’)，为了便于TuMV CP基因的克隆和表达，在PCR5’引物中引入了BglII(AGATCT)酶切位点，在3’引物中引入了BstEII(GGTGACC)酶切位点，PCR条件94℃预变性2min，94℃45s，55℃45s，72℃45s，35个循环，72℃延伸10min。将PCR产物采用琼脂凝胶电泳回收试剂盒回收后，将其连接到T-Vector载体上，对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定，共864bp，将pCambia1301用BglII/BstEII双酶切，回收载体片段(9795bp)，用BglII/BstEII双酶切T-Vector载体，回收TuMV CP，并与载体片段(9795bp)连接，得到一个质粒，用BglII/BstEII双酶切及PCR鉴定，得到载体pCam-TuMVCP。
2.提取感病毒病小青菜的RNA，以RNA为模板，oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下，合成cDNA的第一链，以cDNA第一链为模板，根据CMV CP基因序列，设计引物为5’引物(5’-GATCTAGAATGGACAAATCTGAAT-3’)3’引物(5’-ATGAGCTCTCAAACTGGGAGCA-3’)，为了便于CP基因的克隆和表达，在PCR5’引物中引入了XbaI(TCTAGA)酶切位点，在3’引物中引入了SacI(GAGCTC)酶切位点，PCR条件94℃预变性2min，94℃45s，50℃45s，72℃45s，35个循环，72℃延伸10min。将PCR产物采用琼脂凝胶电泳回收试剂盒回收后，将其连接到T-Vector载体上，对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定，共657bp，将pBI121用SacI/XbaI双酶切，回收载体片段(12858bp)，用SacI/XbaI双酶切T-Vector载体，回收CMVCP，用连接酶将CMVCP与载体片段连接(12858bp)，得到一个质粒，用SacI/XbaI双酶切及PCR鉴定，得到载体pBI121-CMVCP。
3.将载体pBI121-CMVCP用EcoRI/PstI双酶切，回收长度为1773pb的片断，该片段为CaMV35Spro-CMVCP-NoSter。将载体pCam-TuMVCP用EcoRI/PstI双酶切，回收较大的载体片断，用连接酶将CaMV35Spro-CMVCP-NoSter片断(1773pb)与较大的载体片段连接，得到此双价载体pCam-TuMVCP-CMVCP。
权利要求
1.芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双价抗病载体pCam-TuMVCP-CMVCP，其特征在于由潮霉素、NoS终止子NoSter、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因、35S启动子CaMV35Spro、35S启动子CaMV35Spro、芜菁花叶病毒外壳蛋白基因、NoS终止子NoSter依次连接而成，芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因共同构建在同一个植物表达载体上。
全文摘要
本发明的芜菁花叶病毒外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双价抗病载体pCam－TuMVCP－CMVCP是由潮霉素、NoS终止子NoSter、黄瓜花叶病毒CP基因(CMVCP)、35S启动子CaMV35Spro、35S启动子CaMV35Spro、芜菁花叶病毒CP基因(TuMVCP)、NoS终止子NoSter依次连接而成。把芜菁花叶病毒CP基因和黄瓜花叶病毒CP基因共同构建在同一个植物表达载体上，由于CP封闭了病毒基因组的脱壳过程，当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，它们立即被细胞中的自由CP所重新包裹，阻止了核酸的复制；CP限制了病毒粒体的扩展与转运，从而提高转基因植物的抗性。
文档编号C12N15/33GK1687421SQ20051004965
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月25日 优先权日2005年4月25日
发明者郭得平, 张维 申请人:浙江大学