专利名称：一种同时检测b、c组人轮状病毒的膜基因芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种基因微阵列的生物芯片，尤其涉及一种同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，属生物芯片和诊断试剂技术领域。
背景技术：
基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于固相支持物上，然后与待测的标记的核酸样品按碱基配对原理进行杂交，再经过一定的检测系统对杂交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号进行数据分析和处理，从而迅速得出所要的信息。与传统的杂交技术相比，该技术具有微型化，高灵敏性，高度平行性，和高速性的显著特点。其发展速度和其中所运用的技术令人瞩目。迄今为止，已在基因表达检测，基因突变检测，单核苷酸多态性和DNA序列测定等方面展开了广泛的研究和应用。
轮状病毒(Rotavirus，RV)是全世界人和动物急性腹泻的最主要病原，危害巨大。按其结构蛋白VP6的抗原性差异，轮状病毒被分成A～G共七个组，其中能够导致成人腹泻的仅有B组和C组人轮状病毒。由B、C组人轮状病毒导致的成人流行腹泻，迄今为止较多的爆发在亚洲，非洲等欠发达的地区，对其进行的研究相对较为薄弱。作为发展中国家，对B、C组轮状病毒的监测不容忽视。
轮状病毒通过粪-口途径传播，建立快速简便的检测技术，监测污染原中微量病毒，对于及时有效监控食品卫生，防止急性病毒腹泻和流行，保护人民健康有重要的意义。
目前已经建立起来的用于检测B、C组轮状病毒的检测方法存在一定的局限性，如不适用于基层检测，灵敏度低，检测样品的形态受限制等。并且这些方法无一不存在低通量的缺点，即一次仅能检测一组病毒。
经检索，有关利用地高辛标记的PCR产物和膜基因芯片杂交来同时检测B、C组人组轮状病毒的基因芯片，至今未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本实用新型要解决的技术问题是提供一种同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，并同时公开B、C组人轮状病毒的特异性检测探针和阴阳性探针。所述芯片能有效克服现有技术存在的低通量、检测灵敏度低和受检样品受限的缺陷，能满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域的需要。
本实用新型的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，由膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成，其特征在于，所述的膜基片是尼龙膜基片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～10个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括3条B组人轮状病毒特异性检测探针，3条C组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照。
其中，所述的膜基片是表面带正电荷的未经任何化学修饰的尼龙膜基片。
其中，所述的膜基片是任意几何形状之一，厚度为0.05mm～0.5mm。
其中，上述的膜基片优选是长方形，面积是50.0mm～77.0mm×20.0mm～27.0mm；厚度优选为0.1mm～0.3mm。
在上述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片中，所述的B、C组人轮状病毒特异性检测探针与对照样品的点涂层的大小，可以根据点直径、点个数和点间距的变化而变化。
其中，优选的实施方式是当点直径为0.25mm，点间距为0.6mm时，点涂层微阵列的面积为3.5mm×3.5mm(如图1所示)，且可同时在一张膜基片上设置1～8个涂层区。
在上述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片中，所述点涂层中3条B组人轮状病毒特异性检测探针是PbB15′-ACCTGAATTTACTCAAATGG-3′PbB25′-TTCCATTCAAGTGATGAGTT-3′PbB35′-CAGAATTTCCAGTGAGGCT-3′；3条C组人轮状病毒特异性检测探针是PbC15′-TTCAGACGGTCATGTAGCT-3′PbC25′-AATACCAAGTAATCCGAAC-3′PbC35′-ACTCCAATAGCTTCATCTAG-3′；1条阳性对照探针是PbP即5′-DIG-PbB1-3′；4条阴性对照探针是PbEC即大肠杆菌特异性探针，PbSA即金黄色葡萄球菌特异性探针，PbHBV即HBV乙肝病毒特异性探针，PbPSE即铜绿假单胞菌特异性探针；空白点样液对照是3×SSC。
其中，所述阳性对照探针优选分布位于点涂层阵列的四角。
本实用新型所述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片具有如下优点与效果(1)本实用新型所采用的地高辛标记的上游引物对待检病毒核酸实现扩增和标记，并结合带正电荷的尼龙膜，可以不通过特定的仪器，而以肉眼直接观察并判定实验结果，更适合于基层单位使用。
(2)本实用新型所采用的以带正电荷的尼龙膜作为基因芯片的基片，可以使用以常规方法合成的寡核苷酸作为探针，较之采用其它材料作为基片需要以化学基团和连接臂修饰寡核苷酸，大大节约了成本。
(3)本实用新型所采用的以带正电荷的尼龙膜作为基因芯片的基片，由于尼龙膜是一种多孔材料和具有渗水性，作为黏附核酸的载体，可以固定大量的核酸分子，从而提高检测的灵敏度。
(4)本实用新型所采用的B、C组人轮状病毒组特异性检测探针，能够同时实现对B、C组人轮状病毒的高度灵敏性检测和组别鉴定。
总之，本实用新型涉及的芯片可用于对B、C组人轮状病毒的基因检测和组别鉴定，具有广阔的应用前景，有望满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域对人轮状病毒检测的需要。
图1本实用新型所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片的直观图，其中，1为膜基片；2为探针涂层区。
图2本实用新型所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片的探针排布图，其中，所述探针排布为A1，A6，B1，B6，F1，F6为阳性对照PbP(10μmol/L)；A2，A3，A4，A5为检测探针PbB1(10μmol/L)；B2，B3，B4，B5为检测探针PbB2(10μmol/L)；C2，C3，C4，C5为检测探针PbB3(10μmol/L)；D2，D3，D4，D5为检测探针PbC1(10μmol/L)；E2，E3，E4，E5为检测探针PbC2(10μmol/L)；F2，F3，F4，F5为检测探针PbC3(10μmol/L)；C1为阴性探针PbEC(10μmol/L)；C6为阴性探针PbSA(10μmol/L)；E1为阴性探针PbHBV(10μmol/L)；E6为阴性探针PbPSE(10μmol/L)；D1，D6为空白对照3×SSC。
图3琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其中所述各泳道是泳道1为核酸分子marker DL2000；泳道2为实施例3中所述对B组人轮状病毒的PCR扩增，泳道3为实施例4中所述对C组人轮状病毒的PCR扩增，泳道4为实施例5中所述对B、C组人轮状病毒的多重PCR扩增。
图4B组人轮状病毒PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，B组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测B组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现了阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
图5C组人轮状病毒PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，C组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测B组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现了阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
图6B、C组人轮状病毒多重PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，B、C组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测B、C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
具体实施方式
实施例1下面结合图1所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片的直观图以及图2所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片的探针排布图对本实用新型的内容作进一步阐述
本实用新型的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，由膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成，其中，所述的膜基片是表面带正电荷的未经任何化学修饰的尼龙膜基片，形状是长方形，面积是25.0mm×76.0mm，厚度为0.12mm；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1个，所述涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括3条B组人轮状病毒特异性检测探针，3条C组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照；具体为3条B组人轮状病毒特异性检测探针是PbB15′-ACCTGAATTTACTCAAATGG-3′PbB25′-TTCCATTCAAGTGATGAGTT-3′PbB35′-CAGAATTTCCAGTGAGGCT-3′；3条C组人轮状病毒特异性检测探针是PbC15′-TTCAGACGGTCATGTAGCT-3′PbC25′-AATACCAAGTAATCCGAAC-3′PbC35′-ACTCCAATAGCTTCATCTAG-3′；1条阳性对照探针是PbP即5′-DIG-PbB1-3′；4条阴性对照探针是PbEC即大肠杆菌特异性探针，PbSA即金黄色葡萄球菌特异性探针，PbHBV即HBV乙肝病毒特异性探针，PbPSE即铜绿假单胞菌特异性探针；空白点样液对照是3×SSC。
上述圆形点涂层直径为0.25mm，点间距为0.6mm，点涂层微阵列的面积为3.5mm×3.5mm。且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角。
实施例2 本实用新型所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片的制备以5′-DIG-PbB1-3′作为阳性对照(记为PbP)，以大肠杆菌特异性探针(记为PbEC)，金黄色葡萄球菌特异性探针(记为PbSA)，HBV乙肝病毒特异性探针(记为PbHBV)和铜绿假单胞菌特异性探针(记为PbPSE)作为阴性对照，以3×SSC作为稀释液将上述检测探针分别稀释为10μM，以3×SSC为空白对照，以生物芯片点样仪Pixsys5500配以SMP3点样针接触式点制在所述带正电荷的尼龙膜基片上，取样板中液面高度是5mm，针在取样孔中停留时间是20ms，点样时，针在尼龙膜基片上的停留时间是10ms，且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角，各点的直径为0.25mm，点间距为0.6mm，点涂层微阵列的大小为3.5mm×3.5mm(详见图1，图2所示)；将点制后的芯片平放于紫外交联仪内，4500J/cm2下交联3min，即得所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片。
实施例3 利用本实用新型所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片检测B组人轮状病毒(1)对人B组人轮状病毒靶核酸序列建立PCR扩增体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，0.6μl引物混合物(DIG-PBu，PBd，DIG-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl B组人轮状病毒模板。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(2)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图3。
(3)PCR扩增产物同同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片杂交取50μl扩增产物与杂交液等体积混合，杂交液为10×Denhardt’s，10×SSPE，50μg/ml葡聚糖，0.1％SDS。将杂交混合液变性100℃10min。然后迅速置于冰水浴中。膜芯片置于合适尺寸的自制塑料袋中，加入60μl杂交混合液，在55℃的杂交温度下杂交30min。
(4)免疫显色和结果的读取杂交结束后，以双蒸水洗膜3min；然后以5×SSC/0.5％SDS洗膜10min，浸入封闭液(1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/LNaCl)封闭30min。然后再浸入抗体溶液(0.02％Anti-DIG-AP，1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/LNaCl)中，37℃反应15min。以洗脱液洗脱5min后，在检测稀释液中平衡2min，再加入2％NBT/BCIP，37℃下显色。待阳性对照的颜色深度达到要求时，以双蒸水冲洗膜芯片终止反应，以AlphaScanTM扫描仪对膜芯片上的杂交信号进行扫描和图像的存储(见图4)。
结果显示，B组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测B组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现了阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
实施例4 利用本实用新型所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片检测C组人轮状病毒(1)对人C组人轮状病毒靶核酸序列建立PCR扩增体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，0.6μl引物混合物(DIG-PBu，PBd，DIG-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl C组人轮状病毒模板。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(2)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图3。
(3)PCR扩增产物同同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片杂交取50μl扩增产物与杂交液等体积混合，杂交液为10×Denhardt’s，10×SSPE，50μg/ml葡聚糖，0.1％SDS。将杂交混合液变性100℃10min。然后迅速置于冰水浴中。膜芯片置于合适尺寸的自制塑料袋中，加入60μl杂交混合液，在55℃的杂交温度下杂交30min。
(4)免疫显色和结果的读取杂交结束后，以双蒸水洗膜3min；然后以5×SSC/0.5％SDS洗膜10min，浸入封闭液(1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)封闭30min。然后再浸入抗体溶液(0.02％Anti-DIG-AP，1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)中，37℃反应15min。以洗脱液洗脱5min后，在检测稀释液中平衡2min，再加入2％NBT/BCIP，37℃下显色。待阳性对照的颜色深度达到要求时，以双蒸水冲洗膜芯片终止反应，以AlphaScanTM扫描仪对膜芯片上的杂交信号进行扫描和图像的存储(见图5)。
结果显示，C组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测B组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现了阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
实施例5 利用本实用新型所述同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片检测B、C组人轮状病毒(1)对人B、C组人轮状病毒靶核酸序列建立PCR扩增体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，0.6μl引物混合物(DIG-PBu，PBd，DIG-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl B、C组人轮状病毒模板。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(2)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图3。
(3)PCR扩增产物同同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片杂交取50μl扩增产物与杂交液等体积混合，杂交液为10×Denhardt’s，10×SSPE，50μg/ml葡聚糖，0.1％SDS。将杂交混合液变性100℃10min。然后迅速置于冰水浴中。膜芯片置于合适尺寸的自制塑料袋中，加入60μl杂交混合液，在55℃的杂交温度下杂交30min。
(4)免疫显色和结果的读取杂交结束后，以双蒸水洗膜3min；然后以5×SSC/0.5％SDS洗膜10min，浸入封闭液(1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)封闭30min。然后再浸入抗体溶液(0.02％Anti-DIG-AP，1.0％鲑精蛋白，0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl)中，37℃反应15min。以洗脱液洗脱5min后，在检测稀释液中平衡2min，再加入2％NBT/BCIP，37℃下显色。待阳性对照的颜色深度达到要求时，以双蒸水冲洗膜芯片终止反应，以AlphaScanTM扫描仪对膜芯片上的杂交信号进行扫描和图像的存储(见图6)。
结果显示，B、C组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测B、C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
权利要求1.一种同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，由膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成，其特征在于，所述的膜基片是尼龙膜基片；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～10个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括3条B组人轮状病毒特异性检测探针，3条C组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照。
2.如权利要求1所述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述的膜基片是表面带正电荷的未经任何化学修饰的尼龙膜基片。
3.如权利要求1所述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述的膜基片是任意几何形状之一，厚度为0.05mm～0.5mm。
4.如权利要求3所述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述的膜基片是长方形，面积是5.0mm～77.0mm×5.0mm～27.0mm；厚度为0.1mm～0.3mm。
5.如权利要求1、3或4所述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，点直径为0.25mm，点间距为0.6mm，点涂层微阵列的面积为3.5mm×3.5mm，且在一张膜基片上同时设置1～8个涂层区。
6.如权利要求1所述的同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角。
专利摘要本实用新型公开了一种同时检测B、C组人轮状病毒的膜基因芯片，由表面带正电荷的尼龙膜基片和阵列式分布于基片之上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层组成；所述点涂层的形状为圆形，涂层区设1～10个，每涂层区的点涂层平行垂直排列成六排六列；所述点涂层包括3条B组人轮状病毒特异性检测探针，3条C组人轮状病毒特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照。本实用新型的芯片可同时用于对B、C组人轮状病毒的基因检测和组别鉴定，具有广阔的应用前景，有望满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域对人轮状病毒检测的需要。
文档编号C12Q1/00GK2876781SQ2005201245
公开日2007年3月7日 申请日期2005年11月15日 优先权日2005年11月15日
发明者黄海燕, 韩金祥, 王健伟 申请人:山东省医药生物技术研究中心