使用生物标志的测定法和方法

专利名称：使用生物标志的测定法和方法
技术领域：
本文所述的发明涉及用于检测可预示哺乳动物细胞对Apo2L/TRAIL和/或死亡受体激动剂抗体的敏感性的生物标志的方法和测定法。
背景技术：
本技术领域中已鉴定了多种属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的配体和受体。这样的配体包括肿瘤坏死因子α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、淋巴毒素-β(“LT-β”)，CD30配体，CD27配体，CD40配体，OX-40配体，4-1BB配体，LIGHT，Apo-1配体(也称Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称Apo2L或TRAIL)，Apo-3配体(也称TWEAK)，APRIL，OPG配体(也称RANK配体，ODF，或TRANCE)，和TALL-1(也称BlyS，BAFF或THANK)(参考例如Ashkenazi，Nature Review，2420-430(2002)；Ashkenazi和Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Ashkenazi和Dixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，377-411页；Locksley等人，Cell，104487-501(2001)；Gruss和Dower，Blood，853378-3404(1995)；Schmid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，831881(1986)；Dealtry等人，Eur.J.Immunol.，17689(1987)；Pitti等人，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1996)；Wiley等人，Immunity，3673-682(1995)；Browning等人，Cell，72847-856(1993)；Armitage等人Nature，35780-82(1992)；公开于1997年1月16日的WO97/01633；公开于1997年7月17日的WO97/25428，Marsters等人，Curr.Biol.，8525-528(1998)；Chicheportiche等人，Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Hahne等人，J.Exp.Med.，1881185-1190(1998)；1998年7月2日公开的WO98/28426；1998年10月22日公开的WO98/46751；1998年5月7日公开的WO/98/18921；Moore等人，Science，285260-263(1999)；Shu等人，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；Schneider等人，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay等人，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999))。
由这样的TNF家族配体所介导的多种细胞应答的诱导，典型地是由它们与特定的细胞受体的结合所引发的。某些，但不是所有的TNF家族配体结合细胞表面的“死亡受体”并通过其诱发多种生物活性，以活化胱天蛋白酶(caspases)或执行细胞死亡或凋亡途径的酶(Salvesen等人，Cell，91443-446(1997))。目前已鉴定的TNF受体超家族成员包括TNFR1，TNFR2，TACI，GITR，CD27，OX-40，CD30，CD40，HVEM，Fas(也称Apo-1或CD95)，DR4(也称TRAIL-R1)，DR5(也称Apo-2或TRAIL-R2)，DcR1，DcR2，护骨蛋白(OPG)，RANK和Apo-3(也称DR3或TRAMP)(参见例如，Ashkenazi，Nature Reviews，2420-430(2002)；Ashkenazi和Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Ashkenazi和Dixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)Wallach，CytokineReference，Academic Press，2000，377-411页；Locksley等人，Cell，104487-501(2001)；Gruss和Dower，Blood，853378-3404(1995)；Hohman等人，J.Biol.Chem.，26414927-14934(1989)；Brockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，873127-3131(1990)；1991年3月20日公开的EP417,563；Loetscher等人，Cell，61351(1990)；Schall等人，Cell，61361(1990)；Smith等人，Science，2481019-1023(1990)；Lewis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，882830-2834(1991)；Goodwin等人，Mol.Cell.Biol.，113020-3026(1991)；Stamenkovic等人，EMBO J.，81403-1410(1989)；Mallett等人，EMBO J.，91063-1068(1990)；Anderson等人，Nature，390175-179(1997)；Chicheportiche等人，J.Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Pan等人，Science，276111-113(1997)；Pan等人，Science，277815-818(1997)；Sheridan等人，Science，277818-821(1997)；Degli-Esposti等人，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；Marsters等人，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Tsuda等人，BBRC，234137-142(1997)；Nocentini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，946216-6221(1997)；vonBulow等人，Science，278138-141(1997))。
上述的TNF受体家族成员大部分具有共同的细胞表面受体典型结构，包括胞外、跨膜和胞内区，而其它的成员则天然地作为缺少跨膜和胞内区的可溶性蛋白出现。典型的TNFR的胞外部分含有从NH2末端开始的多个富半胱氨酸域(CRD)的重复氨基酸序列模式。
称为Apo-2L或TRAIL的配体是在数年前作为TNF细胞因子家族的成员被鉴定的(参见例如，Wiley等人，Immunity，3673-682(1995)；Pitti等人，J.Biol.Chem.，27112697-12690(1996)；WO97/01633；WO97/25428；1998年6月9日授权的美国专利5,763,223；2001年9月4日授权的美国专利6,284,236)。全长天然序列的人Apo2L/TRAIL多肽是281个氨基酸长的II型跨膜蛋白。某些细胞通过酶切割这种多肽的胞外区(Mariani等人，J.Cell.Biol.，137221-229(1997))可以产生天然可溶形式的该多肽。对可溶形式的Apo2L/TRAIL的晶体学研究揭示了与TNF和其它相关蛋白的结构类似的同源三聚体结构的存在(Hymowitz等人，Molec.Cell，4563-571(1999)；Cha等人，Immunity，11253-261(1999)；Mongkolsapaya等人，NatureStructural Biology，61048(1999)；Hymowitz等人，Biochemistry，39633-644(2000))。但是与其它TNF家族成员不同，Apo2L/TRAIL被发现具有独特的结构特征，即三个半胱氨酸残基(在同源三聚体中每个亚基的第230位)共同与一个锌原子配位，且锌结合对三聚体的稳定性和生物活性是重要的(Hymowitz等人，同上；Bodmer等人，J.Biol.Chem.，27520632-20637(2000))。
文献中已经报道，Apo2L/TRAIL可能在免疫系统调节，包括自身免疫疾病例如类风湿性关节炎中起作用[参见例如，Thomas等人，J.Immunol.，1612195-2200(1998)；Johnsen等人，Cytokine，11664-672(1999)；Griffith等人，J.Exp.Med.，1891343-1353(1999)；Song等人，J.Exp.Med.，1911095-1103(2000)]。
可溶性形式的Apo2L/TRAIL也被报道在多种癌细胞中，包括结肠、肺、乳腺、前列腺、膀胱、肾、卵巢和脑肿瘤，以及黑色素瘤、白血病和多发性骨髓瘤中诱导凋亡(参见例如，Wiley等人，同上；Pitti等人，同上；2000年2月29日授权的美国专利6,030,945；2004年6月8日授权的美国专利6,746,668；Rieger等人，FEBS Letters，427124-128(1998)；Ashkenazi等人，J.Clin.Invest.，104155-162(1999)；Walczak等人，Nature Med.，5157-163(1999)；Keane等人，Cancer Research，59734-741(1999)；Mizutani等人，Clin.Cancer Res.，52605-2612(1999)；Gazitt，Leukemia，131817-1824(1999)；Yu等人，Cancer Res.，602384-2389(2000)；Chinnaiyan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，971754-1759(2000))。在鼠肿瘤模型中进行的体内研究进一步提示，Apo2L/TRAIL单独地或与化学治疗或放射治疗组合使用时可产生显著的抗肿瘤作用(参见例如，Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上；Gliniak等人，Cancer Res.，596153-6158(1999)；Chinnaiyan等人，同上；Roth等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2651999(1999)；PCT申请US/00/15512；PCT申请US/01/23691)。与多种肿瘤细胞相反，大多数正常的人细胞种类似乎对某些重组形式的Apo2L/TRAIL的凋亡诱导具有抗性(Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上)。Jo等人报道，一种带多组氨酸标签的可溶形式的Apo2L/TRAIL在体外诱导了正常的分离的人类而不是非人类肝细胞的凋亡(Jo等人，Nature Med.，6564-567(2000)；另参见Nagata，NatureMed.，6502-503(2000))。人们认为特定的重组Apo2L/TRAIL制备物在生化性质或相对正常细胞对疾病细胞的生物活性方面可能有变化，这依赖于例如标签分子的存在或缺失，锌含量，和％三聚体含量(参见，Lawrence等人，Nature Med.，Letter to the Editor，7383-385(2001)；Qin等人，Nature Med.，Letter to the Editor，7385-386(2001))。
已经发现Apo2L/TRAIL与至少5种不同的受体结合。结合Apo2L/TRAIL的受体中的至少两种含有功能性的胞质死亡域(deathdomain)。一种这样的受体被称为“DR4”(或者TR4或TRAIL-R1)(Pan等人，Science，276111-113(1997)；另见1998年7月30日公开的WO98/32856；1999年7月29日公开的WO99/37684；2000年12月7日公开的WO00/73349；2002年8月13日授权的US6,433,147；2002年10月8日授权的US6,461,823，和2002年1月29日授权的US6,342,383)。
另一种这样的Apo2L/TRAIL受体被称为DR5(其也被称为Apo-2；TRAIL-R或TRAIL-R2，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER)(参见例如，Sheridan等人，Science，277818-821(1997)，Pan等人，Science，277815-818(1997)，1998年11月19日公开的WO98/51793；1998年9月24日公开的WO98/41629；Screaton等人，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17141-143(1997)；1998年8月20日公开的WO98/35986；1998年10月14日公开的EP870,827；1998年10月22日公开的WO98/46643；1999年1月21日公开的WO99/02653；1999年2月25日公开的WO99/09165；1999年3月11日公开的WO99/11791；2002年8月13日公开的US2002/0072091；2001年12月7日公开的US2002/0098550；2001年12月6日授权的US6,313,269；2001年8月2日公开的US2001/0010924；2003年7月3日公开的US2003/01255540；2002年10月31日公开的US2002/0160446，2002年4月25日公开的US2002/0048785；2002年2月授权的US6,342,369；2003年5月27日授权的US6,569,642，2000年6月6日授权的US6,072,047，2003年11月4日授权的US6,642,358；2004年6月1日授权的IS6,743,625)。和DR4类似，DR5被报道含有胞质死亡域，并能够在结合配体时(或结合模拟该配体的活性的分子，例如激动剂抗体(agonist antibody)时)传递凋亡信号。Hymowitz等人，Molecular Cell，4563-571(1999)描述了Apo-2L/TRAIL和DR5之间形成的复合物的晶体结构。
在配体结合时，DR4和DR5都可独立地通过称为FADD/Mort1的含死亡域的衔接分子募集并活化凋亡起始因子(apoptosis initiator)胱天蛋白酶-8，从而引发凋亡[Kischkel等人，Immunity，12611-620(2000)；Sprick等人，Immunity，12599-609(2000)；Bodmer等人，Nature Cell Biol.，2241-243(2000)]。
据报道Apo2L/TRAIL还结合被称为DcR1，DcR2和OPG的受体，这些受体被认为起信号传递的抑制物而非转导物(transducers)的作用(参见例如DCR1(也称TRID，LIT或TRAIL-R3)[Pan等人，Science，276111-113(1997)；Sheridan等人，Science，277818-821(1997)；McFarlane等人，J.Biol.Chem.，27225417-25420(1997)；Schneider等人，FEBS Letters，416329-334(1997)；Degli-Esposti等人，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；及Mongkolsapaya等人，J.Immunol.，1603-6(1998)；DCR2(又称TRUNDD或TRAIL-R4)[Marsters等人，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Pan等人，FEBS Letters，42441-45(1998)；Degli-Esposti等人，Immunity，7813-820(1997)]，和OPG[Simonet等人，同上]。与DR4和DR5相反，DcR1和DcR2受体不传递凋亡信号。
文献中报道了某些结合DR4和/或DR5受体的抗体。例如，针对DR4受体且在某些哺乳动物细胞中具有激动或凋亡活性的抗DR4抗体在例如1999年7月29日公开的WO99/37684；2000年7月12日公开的WO00/73349；2000年7月12日公开的WO03/066661中有记载。还参见例如Griffith等人，J.Immunol.，1622597-2605(1999)；Chuntharapai等人，J.Immunol.，1664891-4898(2001)；2002年12月2日公开的WO02/097033；2003年5月22日公开的WO03/042367；2003年5月8日公开的WO03/038043；2003年5月8日公开的WO03/037913。同样，某些抗DR5抗体也已被描述，参见例如，1998年11月8日公开的WO98/51793；Griffith等人，J.Immunol.，1622597-2605(1999)；Ichikawa等人，Nature Med.，7954-960(2001)；Hylander等人，“An Antibody to DR5(TRAIL-receptor2)Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown inSCID mice”，摘要，2d International Congress on Monoclonal Antibodies inCancers，2002年8月29日至9月1日，Banff，Alberta，加拿大；2003年5月8日公开的WO03/038043；2003年5月8日公开的WO03/037913。另外，还描述了某些与DR4和DR5受体有交叉反应性的抗体(参见例如，2001年6月26日授权的美国专利6,252,050)。
某些哺乳动物细胞的瘤性转化在特定情况下与唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X抗原的表达的特征性改变相关联。相对高量的唾液酰Lewis A/X在例如某些人类结肠、胰腺和胃的腺癌中出现，而且使用针对这些抗原上的糖结构的抗体的测定法已经被用作胰腺和胃肠癌的检测手段(参见例如，Ugorski等人，Acta Biochimica Polonica，492303-311(2002))。这些糖类肿瘤标志的表达水平也已经和临床结果、患者存活时间和转移性疾病的指标相互关联起来。
唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X都已被证明与一类糖结合蛋白家族结合，这类蛋白称为选择素，与细胞从血流外渗有关。一些报道提出唾液酰Lewis A和X是E-选择素的配体，而且可能负责人癌细胞对内皮的黏着。呈现于癌细胞表面的唾液酸化Lewis结构被糖蛋白和糖脂的糖链所携带，并与呈现于内皮细胞上的E-选择素结合。因此，选择素及其糖配体可能在转移过程中的肿瘤细胞的选择性归巢(homing)中起重要作用。
唾液酰Lewis A和X的生物合成被认为依赖于细胞类型特异性和发育阶段特异性的酶将岩藻糖从鸟苷二磷酸-岩藻糖(GDP-Fuc)通过α(1，3)和α(1，4)键最终添加到唾液酸化的前体上，该步骤被α-1，3/1，4-岩藻糖基转移酶(α-1，3/1，4 Fuc-T，FUT)所催化。
目前已经克隆和定性了数种岩藻糖基转移酶基因。这些基因(FUT 3-7)和它们的酶产物(Fuc-TIII-VII)的表达似乎是组织特异性的。由这5种基因编码的酶名为FUTIII，FUTIV，FUTV，FUTVI和FUTVII。编码FUTIII，FUTV和FUTVI的三个基因位于染色体19p13.3上邻近的物理位置。生化和分子克隆研究提示，唾液酰Lewis A/X部分的谱系特异性(lineage-specific)的表达是由α-1，3-岩藻糖基转移酶基因的谱系特异性的表达所决定的，这些基因的酶产物作用于组成性地表达的寡糖前体以产生定位于表面的(surface-localized)唾液酰Lewis A/X决定簇(determinants)。负责上皮组织中的活性的人岩藻糖基转移酶是FUT3和FUT6。FUT3[又称Lewis α-(1，3/1，4)岩藻糖基转移酶基因]和FUT6[血浆α-(1，3)岩藻糖基转移酶基因]的转录物在正常和转化的组织中都存在。岩藻糖基转移酶转录物也在多种腺癌细胞系中普遍存在，其中在结肠癌中具有显著的FUT3和6的高表达(参见例如Ugorski等人，Acta Biochimica Polonica，49303-311(2002)；Nakamori等人，Dis.Colon Rectum.，40420-431(1997)；Takada等人，CancerRes.，53354-361(1993)；Ichikawa等人，J.Surg.Oncol.，7598-102(2000))；Nakagoe等人，J Exp Clin Cancer Res.，2002.03；21(1)107-13；Matsumoto等人，Br J Cancer.2002.01.21；86(2)161-7；Ito等人，J Gastroenterol.2001.12；36(12)823-9；Nakagoe等人，Cancer Detect Prev.2001；25(3)299-308；Kumamoto等人，Cancer Res.2001.06.01；61(11)4620-7；Murata等人，Dis Colon Rectum.2001.04；44(4)A2-A4；Nakagoe等人，J Exp Clin CancerRes.2001.03；20(1)85-90；Nakagoe等人，J Gastroenterol.2001.03；36(3)166-72；Nakagoe等人，Tumour Biol.2001.03-04；22(2)115-22；Nakagoe等人，Can J Gastroenterol.2000.10；14(9)753-60；Izawa等人，Cancer Res.2000.03.01；60(5)1410-6；Tanaka等人，Hepatogastroenterology.1999.03-04；46(26)875-82；Matsushita等人，Cancer Lett.1998.11.27；133(2)151-60；Sato等人，Anticancer Res.1997.09-10；17(5A)3505-11；Yamada等人，Br J Cancer.1997；76(5)582-7；Nakamori等人，Dis Colon Rectum.1997.04；40(4)420-31；Srinivas等人，Scand J Immunol.1996.09；44(3)197-203；Matsushita等人，Lab Invest.1990.12；63(6)780-91；Ashizawa等人，J Exp Clin Cancer Res.2003.03；22(1)91-8；Nakagoe等人，J Exp Clin Cancer Res.2002.09；21(3)363-9；Nakagoe等人，Anticancer Res.2002.01-02；22(1A)451-8；Nakagoe等人，J Clin Gastroenterol.2002.04；34(4)408-15；Nakagoe等人，Cancer Lett.2002.01.25；175(2)213-21；Tatsumi等人，Clin Exp Metastasis.1998.11；16(8)743-50；Ikeda等人，J Surg Oncol.1996.07；62(3)171-6；Ikeda等人，Eur J Surg Oncol.1995.04；21(2)168-75；Togayachi等人，Int J Cancer.1999.09.24；83(1)70-9；Satoh等人，Clin Cancer Res.1997.04；3(4)495-9；Satoh等人，Respiration.1998；65(4)295-8；Satoh等人，Anticancer Res.1998.07-08；18(4B)2865-8；Fukuoka等人，Lung Cancer.1998.05；20(2)109-16；Fujiwara等人，Anticancer Res.1998.03-04；18(2A)1043-6；Ogawa等人，Int J Cancer.1997.04.22；74(2)189-92；Ogawa等人，J ThoracCardiovasc Surg.1994.08；108(2)329-36；Asao等人，Cancer.1989.12.15；64(12)2541-5；Narita等人，Breast Cancer.1996.03.29；3(1)19-23；Yamaguchi等人，Oncology.1998.07-08；55(4)357-62；Sikut等人，Int J Cancer.1996.05.29；66(5)617-23；Saito等人，Anticancer Res.2003.07-08；23(4)3441-6；Fujii等人，Urol Int.2000；64(3)129-33；Idikio等人，GlycoconjJ.1997.11；14(7)875-7；Inoue等人，Obstet Gynecol.1992.03；79(3)434-40；Yamashita等人，Eur J Cancer.2000.01；36(1)113-20；Hamanaka等人，Pancreas.1996.08；13(2)160-5；Ho等人，Cancer Res.1995.08.15；55(16)3659-63)。
发明概述本文所公开的发明提供检查哺乳动物组织或细胞样品中的一种或多种生物标志的表达的方法和测定法，其中所述一种或多种生物标志的表达可预示所述组织或细胞样品是否将对凋亡诱导剂例如Apo2L/TRAIL及抗-DR5激动剂抗体敏感。在本发明的不同实施方案中，所述方法和测定法检查生物标志的表达，例如某些岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)，特别是岩藻糖基转移酶3(FUT3)和/或岩藻糖基转移酶6(FUT6)，以及唾液酰(sialyl)Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达。
如上面所讨论的，大多数正常人细胞类型似乎对某些重组形式的Apo2L/TRAIL的凋亡诱导具有抗性(Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上)。还观察到人类疾病细胞类型的某些群体(例如癌细胞的某些群体)对某些重组形式的Apo2L/TRAIL的凋亡诱导(Ashkenazi等人，J.Clin.Invest.，1999，同上；Walczak等人，Nature Med.，1999，同上)是抵抗的。因此，通过进行某种测定方法检查哺乳动物组织或细胞样品的特定生物标志的表达，就可以方便和高效地得到对于评估治疗患者的合适或有效的疗法有用的信息。例如，从检测哺乳动物组织或细胞样品中的FUT3或FUT6表达的测定所得的信息，可以为内科医生提供有用的数据，这些数据可以用来为患有例如癌症等疾病的病人确定最佳的治疗方案(使用Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体)。
本发明提供预测哺乳动物组织或细胞样品(例如癌细胞)对Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体的敏感性的方法。在某些实施方案中，所述方法包括得到哺乳动物组织或细胞样品并检查该组织或细胞的岩藻糖基转移酶3或岩藻糖基转移酶6的表达。所述方法还包括检查该组织或细胞的其它生物标志例如唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达。这些方法可以以多种测定模式实施，包括检测mRNA表达的测定，检测酶活性存在的酶测定，免疫组化测定和本文中描述的其它测定。确定这样的生物标志在所述组织或细胞中的表达可预示所述组织或细胞样品是否将对凋亡诱导剂例如Apo2L/TRAIL及死亡受体抗体敏感。在可选的实施方案中，还可以检查所述组织或细胞的DR4，DR5，DcR1或DcR2受体的表达。
本发明的其它方法包括在哺乳动物组织或细胞样品中诱导凋亡的方法，其包括下列步骤得到哺乳动物组织或细胞样品，检查该组织或细胞的一种或多种生物标志，例如岩藻糖基转移酶3，岩藻糖基转移酶6，唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达，并且一旦确定了所述组织或细胞样品表达所述一种或多种生物标志，则使组织或细胞样品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体。检查一种或多种生物标志的表达的方法中的步骤可以以多种测定模式进行，包括检测mRNA表达的测定，检测酶活性存在的酶测定，和免疫组化测定。在可选的实施方案中，所述方法还包括检查组织或细胞样品的DR4，DR5，DcR1，或DcR2受体的表达。任选地，所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
本发明的其它方法包括治疗哺乳动物中的疾病，例如免疫相关的疾病或癌症的方法，包括下列步骤得到哺乳动物组织或细胞样品，检查该组织或细胞的一种或多种生物标志，例如岩藻糖基转移酶3，岩藻糖基转移酶6，唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达，并且一旦确定了所述组织或细胞样品表达所述一种或多种生物标志，则对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体。检查一种或多种生物标志的表达的方法中的步骤可以以多种测定模式进行，包括检测mRNA表达的测定，检测酶活性存在的酶测定，和免疫组化测定。在可选的实施方案中，所述方法还包括检查组织或细胞样品的DR4，DR5，DcR1，或DcR2受体的表达。任选地，这些方法包括治疗哺乳动物中的癌症。任选地，所述方法除了施用有效量的Apo2L/TRAIL和/或死亡受体激动剂抗体以外，还包括对所述哺乳动物施用化学治疗剂或放射治疗。
进一步的实施方案由下面的权利要求更具体地公开1.预测哺乳动物组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步骤得到哺乳动物组织或细胞样品；检查所述组织或细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，其中，所述一种或多种生物标志的表达预示所述组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL的凋亡诱导活性敏感。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过检测岩藻糖基转移酶3或岩藻糖基转移酶6的mRNA表达来检查的。
3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过免疫组化检测唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达来检查的。
4.权利要求1的方法，还包括检查所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达的步骤。
5.权利要求1的方法，其中组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述癌细胞是结肠、结肠直肠、胃肠或胰腺的癌细胞或组织。
7.在哺乳动物组织或细胞样品中诱导凋亡的方法，包括下列步骤得到哺乳动物组织或细胞样品；检查所述组织或细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及检测到所述一种或多种生物标志的表达后，使所述组织或细胞样品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL。
8.权利要求7的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过检测岩藻糖基转移酶3或岩藻糖基转移酶6的mRNA表达来检查的。
9.权利要求7的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过免疫组化检测唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达来检查的。
10.权利要求7的方法，还包括检查所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达的步骤。
11.权利要求7的方法，其中组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
12.权利要求11的方法，其中所述癌细胞是结肠、结肠直肠、胃肠或胰腺的癌细胞或组织。
13.权利要求7的方法，其中所述细胞被暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽，该Apo2L/TRAIL多肽包括图1的氨基酸114-281。
14.治疗哺乳动物中的疾病，例如免疫相关疾病或癌症的方法，包括下列步骤得到所述哺乳动物的组织或细胞样品；检查所述组织或细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及检测到所述一种或多种生物标志的表达后，对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过检测岩藻糖基转移酶3或岩藻糖基转移酶6的mRNA表达来检查的。
16.权利要求14的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过免疫组化检测唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达来检查的。
17.权利要求14的方法，还包括检查所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达的步骤。
18.权利要求14的方法，其中组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述癌细胞或组织包含结肠、结肠直肠、胃肠或胰腺的癌细胞或组织。
20.权利要求14的方法，其中对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL多肽，该Apo2L/TRAIL多肽包括图1的氨基酸114-281。
21.权利要求14的方法，其中还对所述哺乳动物施用化学治疗剂或放射疗法。
22.权利要求14的方法，其中还对所述哺乳动物施用细胞因子、细胞毒剂或生长抑制剂。
23.权利要求7的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
24.权利要求14的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
25.权利要求6的方法，其中所述癌细胞是结肠或结肠直肠癌细胞。
26.权利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包含图1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281的多肽，或其生物活性片段。
27.权利要求26的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281的多肽。
28.权利要求12的方法，其中所述癌细胞是结肠或结肠直肠癌细胞。
29.权利要求20的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽由图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281组成。
30.预测哺乳动物的结肠或结肠直肠癌细胞对Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步骤得到哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞；检查所述癌细胞以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，其中所述一种或多种生物标志的表达预示所述癌细胞对Apo2L/TRAIL的凋亡诱导活性敏感。
31.在哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞中诱导凋亡的方法，包括下列步骤得到哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞；检查所述癌细胞以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及在检测所述一种或多种生物标志表达后，将所述癌细胞暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽。
32.权利要求31的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
33.权利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
34.权利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。
35.治疗哺乳动物中结肠或结肠直肠的癌症的方法，包括下列步骤得到所述哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞样品；检查所述癌细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及在检测所述一种或多种生物标志表达后，对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
36.权利要求35的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
37.权利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
38.权利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。


图1显示人Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO2)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。第447位核苷酸处的“N”表示该核苷酸碱基可以是“T”或“G”。
图2A和2B显示全长人DR4 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO4)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。Pan等人，Science，276111(1997)中也分别报道了人DR4的核苷酸和氨基酸序列。
图3A显示如1998年11月19日的WO98/51793所公开的人DR5的411个氨基酸的序列(SEQ ID NO5)。人DR5的转录剪接变体是本领域已知的。该DR5剪接变体编码图3B和3C所示的人DR5的440个氨基酸的序列(SEQID NO6)，如1998年8月20日的WO98/35986所公开的。
图3D显示全长人DcR1 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO7)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。WO98/58062中也分别描述了人DcR1(特别是其各个域)的核苷酸和氨基酸序列。
图3E显示全长人DcR2 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO9)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。WO99/10484中也分别描述了人DcR2(特别是其各个域)的核苷酸和氨基酸序列。
图4显示全长人(1，3/1，4)岩藻糖基转移酶(FUT3)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO9)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。这些序列对应于GenBank登录号HSU27328，并在例如Kukowska-Latallo等人，Genes Dev.1990 Aug；4(8)1288-303中有记载。
图5显示全长人α(1，3)岩藻糖基转移酶(FUT6)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO9)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。这些序列对应于GenBank登录号HSU27333，并在例如Koszdin和Bowen，Biochem BiophysRes Commun.1992 Aug 31；187(1)152-7中有记载。
图6提供分析28个结肠或结肠直肠癌细胞系对Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5单克隆抗体“mab”(交联的“XL”或非交联的，+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)的凋亡活性的敏感性或抗性，及其FUT 3、FUT 6、唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X的表达，所得数据的汇总表。
图7提供不同的结肠或结肠直肠癌细胞系对DR5抗体的抗性及由定量PCR测量的FUT3的表达的比较。
图8提供不同的结肠或结肠直肠癌细胞系对DR5抗体(加上交联物)的敏感性或抗性及由FACS确定的唾液酰Lewis X或A的表达的比较。
图9A显示分析不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的敏感性或抗性与FUT3表达之间的相关性的Spearman等级相关性检验。
图9B显示分析不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的敏感性(“sens”)或抗性(“res”)的Fisher’s Exact检验结果，和FUT3和唾液酰Lewis A/X的表达与各细胞系对DR5抗体凋亡活性的敏感性之间的统计学显著性。
图10比较不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的DcR1或DcR2受体的表达(由定量PCR确定)及特定的细胞系对Apo2L或DR5抗体的状态(敏感或抵抗)。
图11比较不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的DcR1或DcR2受体的表达(由FACS确定)及特定的细胞系对Apo2L或DR5抗体的状态(敏感或抵抗)。
图12显示在4种结肠直肠细胞癌细胞系CaCo2，SW 1417，DLD-1，和Colo 205中对唾液酰Lewis A和X的免疫组化染色，及其与唾液酰LewisA和X的表达(如FACS测量的)的关联和与对Apo2L的敏感性的关联。
图13是显示正常结肠粘膜、正常肝组织、原发性结肠癌和结肠癌转移的组织样品中的唾液酰Lewis A和X的表达的IHC实验的总结。
发明详述本文所描述或引用的技术和程序是通常为本领域技术人员所充分理解，并使用常规的方法普遍采用的，例如被广泛使用的、由Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y所描述的分子克隆方法。除了另有说明的以外，涉及使用可商购的试剂盒和试剂的程序通常按照制造商给定的规程和/或参数进行，视何者适用而定。
在描述本发明的方法和测定法以前，应当理解本发明不应局限于所描述的具体的方法、操作规程、细胞系、动物属或种，构建体和试剂，因为这些理所当然是可以变化的。还应当理解这里所用的术语只是为了描述具体的实施方案，并非意在限制本发明的范围，该范围仅由所附权利要求所限定。
应当指出，本文中和所附的权利要求中使用的单数形式(“a”，“an”，“the”)包括复数的被指称事物，除非上下文明确地另有指示。因此，例如，“遗传改变”(“a genetic alteration”)包括多个这样的改变，而“探针”(“a probe”)包括一个或多个探针及其为本领域技术人员所知的等同物，等等。
本文中提到的所有出版物在此都通过引用并入本文，以公开并描述连同这些出版物被引用的方法和/或材料。本文所引用的出版物，被引用的是其在本发明的申请日之前的公开。这里的一切都不应被理解为承认本发明人无权基于更早的优先权日期或在先的发明日期使这些出版物日期提前。另外，真实的出版日期可能和所示的不同，需要独立的核实。
定义本文的术语“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2L”和“TRAIL”是用来指包括图1所示的氨基酸序列中的氨基酸残基114-281(含)，95-281(含)，残基92-281(含)，残基91-281(含)，残基41-281(含)，残基15-281(含)，或残基1-281(含)，及上述序列的生物活性片段，缺失、插入或替代性变体。在一个实施方案中，所述多肽序列包括图1的残基114-281，及任选地，由图1的残基114-281组成。任选地，所述多肽序列包括图1的残基92-281或残基91-281。Apo-2L多肽可以由图1所示的天然核苷酸序列编码。任选地，编码图1中Pro119残基的密码子可以是“CCT”或“CCG”。在其它的实施方案中，所述片段或变体是生物活性的，且与任一上述的Apo2L/TRAIL序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选至少约90％的同一性，更优选地，具有至少95％，96％，97％，98％，或99％的序列同一性。任选地，所述Apo2L/TRAIL多肽被在严紧条件下与图1提供的编码核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码。该定义涵盖Apo2L/TRAIL的替代性变体，其中它的至少一个天然氨基酸被替代为丙氨酸残基。具体的Apo2L/TRAIL的替代性变体包括至少一个氨基酸被替代为丙氨酸残基的变体。这些替代性变体包括例如标识为“D203A”、“D218A”和“D269A”的那些变体。该术语被用来标识第203、218和/或269位(使用图1所示的编号)的天冬氨酸被替代为丙氨酸残基的Apo2L/TRAIL变体。可选地，所述Apo2L/TRAIL变体可包含公开的PCT申请WO01/00832的表I中所述的一种或多种丙氨酸替代。替代性变体包括2001年1月4日公开的WO01/00832的表I指明的残基替代。该定义还涵盖从Apo2L/TRAIL源分离的，或通过重组或合成方法制备的天然序列的Apo2L/TRAIL。本发明的Apo2L/TRAIL包括PCT申请WO97/01633和WO97/25428中公开的、称为Apo2L/TRAIL或TRAIL的多肽。术语“Apo2L/TRAIL”或“Apo2L”用来泛指Apo2L/TRAIL的形式，包括该多肽的单体、二聚体或三聚体形式。Apo2L序列中提到的所有氨基酸残基的编号都使用根据图1的编号，除非另有特别说明。例如，“D203”或“Asp203”指图1中提供的序列的第203位的天冬氨酸残基。
术语“Apo2L/TRAIL胞外域”或“Apo2L/TRAIL ECD”是指Apo2L/TRAIL的基本上没有跨膜和胞质域的形式。通常，ECD将具有少于1％的所述跨膜和胞质域，且优选地，将具有少于0.5％的所述域。应当理解，对本发明的多肽而言，任何被鉴定的跨膜域都是根据本领域中鉴定那种疏水域的常规标准鉴定的。跨膜域的确切边界可以是变化的，但最有可能是在最初鉴定的域的任一末端处不多于约5个氨基酸的变化。在优选的实施方案中，ECD由所述多肽的可溶性胞外域序列组成，基本上没有跨膜和胞质或胞内域(而且不是膜结合的)。具体的Apo-2L/TRAIL胞外域序列在PCT申请WO97/01633和WO97/25428中有描述。
术语“Apo2L/TRAIL单体”或“Apo2L单体”指Apo2L的胞外域序列的共价链。
术语“Apo2L/TRAIL二聚体”或“Apo2L二聚体”指通过二硫键共价键连接的2个Apo-2L单体。用于本文的该术语包括游离存在的Apo2L二聚体和三聚体形式的Apo2L中的Apo2L二聚体(即，与另一第三Apo2L单体联合)。
术语“Apo2L/TRAIL聚集体(aggregate)”用于指自联合(self-associated)的较高级寡聚体形式的Apo2L/TRAIL，例如Apo2L/TRAIL三聚体，其形成例如六聚体和九聚体形式的Apo2L/TRAIL。使用本领域已知的方法和测定法(及使用可商购的材料)，例如天然(native)大小排阻HPLC(“SEC”)、使用十二烷基硫酸钠的变性大小排阻色谱(“SDS-SEC”)，反相HPLC和毛细管电泳，可以确定Apo2L/TRAIL单体、二聚体或三聚体(及其它聚集体)的存在和数量。
“Apo-2配体受体”包括本领域称为“DR4”和“DR5”的受体，其多核苷酸和多肽序列分别如图2和3所示。Pan等人描述了被称为“DR4”的TNF受体家族成员(Pan等人，Science，276111-113(1997)；另参见1998年7月30日公开的WO98/32856；1999年7月29日公开的WO99/37684；2000年12月7日公开的WO00/73349；2002年8月13日授权的US6,433,147；2002年10月8日授权的US6,461,823，2002年1月29日授权的US6,342,383)。Sheridan等人，Science，277818-821(1997)和Pan等人，Science，277815-818(1997)描述了另一种Apo2L/TRAIL的受体(1998年11月19日公开的WO98/51793；1998年9月24日公开的WO98/41629)。该受体被称为DR5(该受体又被称为Apo-2；TRAIL-R，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER；Screaton等人，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17141-143(1997)；1998年8月20日公开的WO98/35986；1998年10月14日公开的EP870，827；1998年10月22日公开的WO98/46643；1999年1月21日公开的WO99/02653；1999年2月25日公开的WO99/09165；1999年3月11日公开的WO99/11791；2002年8月13日公开的US2002/0072091；2002年12月7日公开的US2002/0098550；2001年12月6日授权的US6,313,269；2001年8月2日公开的US2001/0010924；2003年7月3日公开的US；2002年10月31日公开的US2002/0160446，2002年4月25日公开的US2002/0048785；2003年5月27日授权的US6,569,642，2000年6月6日授权的US6,072,047，2003年11月4日授权的US6,642,358)。如上所述，其它Apo-2L受体包括DcR1，DcR2，和OPG(参见，Sheridan等人，同上；Marsters等人，同上；和Simonet等人，同上)。术语“Apo-2L受体”当用于本文时，包括天然序列的受体和受体变体。这些术语涵盖在多种哺乳动物，包括人类中表达的Apo-2L受体。Apo-2L受体可以如多种人类组织谱系中天然存在的那样内源表达，或通过重组或合成方法表达。“天然序列的受体”包括与来自自然界的Apo-2L受体具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然序列的Apo-2L受体可具有来自任何哺乳动物的天然存在的Apo-2L受体的氨基酸序列。这样的天然序列Apo-2L受体可以从自然界分离或者可以通过重组或合成手段生产。术语“天然序列Apo-2L受体”特别涵盖该受体的天然存在的截短的或分泌形式(例如，含有例如胞外域序列的可溶形式)，天然存在的变体形式(例如以可选方式剪接的形式)和天然存在的等位变体。受体变体可包括天然序列Apo-2L受体的片段或缺失突变体。图3A显示人DR5的411个氨基酸的序列，如WO98/51793于1998年11月19日所公开的。人DR5转录剪接变体是本领域已知的。该DR5剪接变体编码图3B和3C所示的人DR5的440个氨基酸的序列，如WO98/35986于1998年8月20日所公开的。
“死亡受体抗体”在本文中用来泛指针对肿瘤坏死因子受体超家族中的并含有可传递凋亡信号的死亡域(death domain)的受体的抗体，这样的抗体包括DR5抗体和DR4抗体。
“DR5受体抗体”，“DR5抗体”，或“抗-DR5抗体”用来广义地指结合至少一种形式的DR5受体或其胞外域的抗体。可选地，该DR5抗体与异源序列或分子连接或融合。优选地，该异源序列允许或帮助所述抗体形成较高级或寡聚复合物。可选地，DR5抗体结合DR5受体，但不与任何其它Apo-2L受体(例如DR4，DcR1，或DcR2)结合或交叉反应。可选地，所述抗体是DR5信号传递活性的激动剂。
可选地，本发明的DR5抗体以约0.1nM到约20mM的浓度范围结合DR5受体，如BIAcore结合测定所测得的。可选地，本发明的DR5抗体显示约0.6nM到约18mM的Ic50值，如BIAcore结合测定所测得的。
“DR4受体抗体”，“DR4抗体”，或“抗-DR4抗体”用来广义地指结合至少一种形式的DR4受体或其胞外域的抗体。可选地，该DR4抗体与异源序列或分子融合或连接。优选地，该异源序列允许或帮助所述抗体形成较高级或寡聚复合物。可选地，DR4抗体结合DR4受体，但不与任何其它Apo-2L受体(例如DR5，DcR1，或DcR2)结合或交叉反应。可选地，所述抗体是DR4信号传递活性的激动剂。
可选地，本发明的DR4抗体以约0.1nM到约20mM的浓度范围结合DR4受体，如BIAcore结合测定所测得的。可选地，本发明的DR4抗体显示约0.6nM到约18mM的Ic50值，如BIAcore结合测定所测得的。
术语“激动剂”是在最广义的意义上使用的，包括任何在体外、体内或原位部分地或完全地增强、刺激或活化Apo2L/TRAIL，DR4或DR5的一种或多种生物活性的分子。这样的Apo2L/TRAIL与DR4或DR5结合的生物活性的例子包括凋亡和文献中报道的其它活性。所述激动剂可以直接或间接的方式起作用。例如，激动剂可直接结合DR4或DR5，导致受体活化或信号转导，结果起到在体外、原位或体内部分地或完全地增强、刺激或活化DR4或DR5的一种或多种生物活性的作用。所述激动剂也可以例如刺激另一种效应分子，然后该分子导致DR4或DR5活化或信号转导，结果间接地起到在体外、原位或体内部分地或完全地增强、刺激或活化DR4或DR5的一种或多种生物活性的作用。本文认为激动剂可充当增强分子(enhancermolecule)，间接地起增强或增加DR4或DR5活化或活性的作用。例如，所述激动剂可增强哺乳动物中内源Apo-2L的活性。这可以通过，例如，预先复合(pre-complexing)DR4或DR5，或通过稳定DR4或DR5受体与其各自配体的复合物(例如稳定Apo-2L和DR4或DR5形成的天然复合物)来实现。
本申请中使用的术语“生物标记”泛指一种分子，包括基因、蛋白质、糖结构，或糖脂，其在哺乳动物组织或细胞中的表达可以通过标准方法(或本文中公开的方法)测定，且该表达可预示哺乳动物组织或细胞对Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的敏感性。本发明所考虑的这样的生物标志包括但不限于“(1，3/1，4)岩藻糖基转移酶”或“FUT3”，“α(1，3)岩藻糖基转移酶”或“FUT6”，“唾液酰Lewis A”，和“唾液酰Lewis X”。可选地，该生物标志测得的表达高于对照组织或细胞样品中观察到的表达。可选地，例如，通过PCR或FACS测定所测得的该生物标志在待测组织或细胞样品中的表达，比在对照组织或样品中观察到的表达高至少50倍，或优选至少100倍。可选地，通过IHC测定所测得的该生物标志的表达，其着色强度(stainingintensity)得分将至少为2或更高。
“(1，3/1，4)岩藻糖基转移酶”或“FUT3”在本文中用来指这样的分子其具有如本文所述的结构特征，且可选地催化岩藻糖残基从供体底物GDP-岩藻糖转移给受体底物，与GlcNAc形成α3或α4键连接(FUT III-VII及IX)。人FUT3的DNA序列和氨基酸序列在图4中给出。这些序列对应于GenBank登录号HSU27328，并在例如Kukowska-Latallo等人，Genes Dev.1990 Aug；4(8)1288-303中有描述。FUT通常是存在于高尔基体空泡中的II型跨膜糖蛋白，典型地由N末端胞质尾部、跨膜区和高尔基体中朝向腔内的催化域组成。在跨膜区和催化域之间是称为主干(stem)的区域(Paulson和Colley，J.Biol.Chem.，26417615-17618(1989))。
“α(1，3)岩藻糖基转移酶”或“FUT6”在本文中用来指这样的分子，其在结构上与例如图5给出的人FUT6的DNA序列及氨基酸序列相关。这些序列对应于GenBank登录号HSU27333，并在例如Koszdin和Bowen，BiochemBiophys Res Commun.1992 Aug 31；187(1)152-7中有描述。FUT 6通常在上皮细胞和肝、肾及胃肠组织中，特别是胃、空肠和结肠中表达(并且通常在脾、肺和子宫颈中表达最少)。通常在脑、肾上腺皮质或外周血淋巴细胞中检测不到FUT 6。
“唾液酰Lewis A”(sialyl Lewis A)在本文中用于指具有下述序列或结构的四糖碳水化合物结构或抗原，其可以为膜结合的，或者为可溶性形式，在例如血浆中循环
NeuAcα2--＞3Galβ1--＞3[Fucα1--＞4]GlcNAcβ1--＞R(NeuAcα2--＞3Galβ1--＞3(Fucα1--＞4)GlcNAcβ1--＞R) “唾液酰Lewis X”(sialyl Lewis X)在本文中用于指具有下述序列或结构的四糖碳水化合物结构或抗原，其可以为膜结合的，或者为可溶性形式，在例如血清中循环NeuAcα2--＞3Galβ1--＞4[Fucα1--＞3]GlcNAcβ1--＞R(NeuAcα2--＞3Galβ1--＞4(Fucα1--＞3)GlcNAcβ1--＞R) “受试者”或“患者”意指任何需要治疗的单个对象，包括人、牛、犬、豚鼠、兔、鸡、昆虫等。作为受试者还意在包括任何临床研究试验中涉及的、不显示任何疾病临床征象的对象，或流行病学研究中涉及的对象，或用作对照的对象。
术语“哺乳动物”在本文中指任何归类为哺乳动物的哺乳动物，包括人、牛、马、犬和猫。在本发明的优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。
“组织或细胞样品”指从受试者或患者的组织得到的类似细胞的集合。所述组织或细胞样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或防腐保存的(preserved)器官或组织样品或活检物(biopsy)或抽吸物(aspirate)的固体组织；血液或任何血液组分；体液例如脑脊液，羊水，腹水，腹膜液(peritoneal fluid)或间质液(interstitial fluid)；来自受试者的妊娠或发育过程中的任意时间的细胞。该组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。可选地，该组织或细胞样品是从原发性或转移的肿瘤得到的。组织样品可含有不与天然状态下的所述组织天然地混合的化合物，例如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。
对本文而言组织样品的“切片”(section)是组织样品的单个部分或片段，例如从组织样品切下的组织或细胞薄片。可以理解，可以从组织样品取多个切片并根据本发明加以分析，只要理解本发明包括同时在形态学水平和分子水平上分析同一组织样品的切片，或对同一组织样品的切片同时分析蛋白质和核酸的方法。
“相互关联”是指以任何方式比较第一分析或程序的执行情况和/或结果与第二分析或程序的执行情况和/或结果。例如，可以第二程序的执行中使用第一分析或程序的结果，并且/或者，可以使用第一分析或程序的结果来确定是否应该进行第二分析或程序。对于免疫组化分析或程序，可以使用IHC的结果来确定是否应该执行特定的治疗方案。
“核酸”意图包括任何DNA或RNA。例如，存在于组织样品中的染色体、线粒体、病毒和/或细菌核酸。术语“核酸”涵盖双链核酸分子的任一或两条链，并包括完整核酸分子的任何片段或部分。
“基因”意指在编码或转录蛋白质或调节其它基因的表达中起功能性作用的任何核酸序列或其部分。基因可由负责编码功能性蛋白质的所有核酸组成，或仅由负责编码或表达蛋白质的核酸的一部分组成。核酸序列在外显子、内含子、起始或终止区域、启动子序列、其它调节序列或所述基因的独特的邻近区域中可含有遗传异常(genetic abnormality)。
术语“标记”在本文中用来指这样的化合物或组合物，其直接或间接地与例如核酸探针或抗体等试剂偶联或融合，并有助于检测与其偶联或融合的所述试剂。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，对酶标记而言，可催化可检测的底物反应物或组合物的化学变化。
术语“抗体”在本文中使用其最广的含义，具体覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展示所需生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的分子量约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在具有不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(VH)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL)，而另一端是一个恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛，且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在某些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，(1991))。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示出多种效应物功能，诸如抗体介导的细胞毒作用(ADCC)中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点，并且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中Fab’-SH是其中恒定区的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定区的氨基酸序列，可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体归入不同的类别。完整抗体有五种主要的类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315，(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP404,097；WO1993/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，(1993)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了天然发生的、可能以极少量存在的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原性位点。另外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等人，Nature256495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clacksonet al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技术由噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变区抗原结合序列以及人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。
非人源(如鼠源)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体指人源免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人源免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人源残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个如下可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人源免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR是人源免疫球蛋白序列的FR。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人源免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“框架”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的可变区残基。
“结合”目的抗原的抗体是这样的抗体，其能够以充分的亲和力和/或亲和力结合该抗原，因而该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞的治疗或诊断剂。
对本文而言，“免疫疗法”指用抗体治疗哺乳动物(优选人类患者)的方法，其中所述抗体可以是未偶联的或“裸露的”抗体，或者该抗体可以与异源的分子或药剂，例如一种或多种细胞毒剂偶联或融合，从而产生“免疫偶联物”。
“分离的”抗体指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到均一。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
表述“有效量”指预防、改善或治疗所述疾病或病症有效的量的药剂(例如Apo2L/TRAIL，抗DR4或DR5抗体等)。
本文中所用的术语“治疗”和“疗法”指治愈性疗法和预防性(prophylactic及preventative)疗法。连续治疗或施用是指至少每日一次的、治疗中无间断的、经过一日或多日的治疗。间歇性治疗或施用，或间歇式治疗或施用，指非连续性，而是周期性的治疗。
术语“细胞因子”是由一细胞群体所释放的、作为细胞间的媒介对另一细胞起作用的蛋白质。这样的细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞激素包括生长激素例如人生长激素，N-甲硫胺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺素(TSH)，和黄体生成素(LH)；肝生长因子(hepatic growth factor)；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素(placental lactogen)；肿瘤坏死因子-α和-β；中肾旁管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和II；红细胞生成素；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素例如干扰素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-13，IL-17；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用的，术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，和天然序列的细胞因子的生物学活性的等同物。
术语“细胞毒剂”在本文中用来指抑制或防止细胞的机能，和/或造成细胞的破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(例如I131，I125，Y90和Re186)，化学治疗剂，及毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性的毒素或其片段。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和环膦酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))、苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ψI1(见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(ADRIAMYCINTM)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)(NAVELBINETM)；诺安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTONTM)；抑制调节肾上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)(MegaseTM)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)(RIVISORTM)、来曲唑(letrozole)(FemaraTM)和阿纳托唑(anastrozole)(ArimidexTM)；及抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
生长抑制剂用于本文时指在体内或体外抑制细胞的生长，特别是过表达任何本文中鉴定的基因的癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂显著地减少在S期过表达这些基因的细胞的百分比。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期进行(在不同于S期的他处)的药剂，例如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春胺(vincas)(长春新碱和长春碱)，紫杉醇和拓扑异构酶II抑制剂(topo II inhibitors)，例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。导致G1停滞的药剂还会进而导致S期停滞，例如，DNA烷基化剂诸如他莫昔芬、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶，和阿糖胞苷。更多信息可以在The Molecular Basis ofCancer，Mendelsohn和Israel编，第一章题为“Cell cycle regulation，oncogens，and antineoplastic drugs”作者为Murakami等人(WB SaundersPhiladelphia，1995)，特别是第13页找到。
术语“凋亡”和“凋亡活性”在本文中以其广义使用，指哺乳动物中有序或受控形式的细胞死亡，其典型地伴随着一种或多种特征性的细胞变化，包括细胞质的浓缩，质膜微绒毛的丧失，细胞核的片段化，染色体DNA的降解或线粒体功能的丧失。该活性可以通过例如本领域已知的细胞存活力测定(例如Alamar blue测定或MTT测定)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA断裂(见例如Nicoletti等人，J.Immunol.Methods，139271-279(1991))、及聚-ADP核糖聚合酶“PARP”，切割分析等确定和测量。
本文使用的“障碍(疾病)”(disorder)泛指任何可从使用本文描述的组合物的治疗受益的状况，包括任何可用有效量的Apo2L/TRAIL、抗DR4抗体，和/或抗DR5抗体治疗的疾病或障碍。这包括慢性和急性的障碍，以及使得所述哺乳动物易于遭受所述障碍的病理状态。本文中要治疗的障碍的非限制性例子包括良性和恶性癌；炎性、血管发生性和免疫性障碍，自身免疫障碍，关节炎(包括类风湿性关节炎)，多发性硬化，和HIV/AIDS。
术语“癌症”(cancer)、“癌性”(cancerous)或“恶性”(malignant)是指代或描述哺乳动物中的典型地以不受调控的细胞生长为特征的生理状态。癌症的例子包括但不限于，癌瘤(carcinoma)，淋巴瘤，白血病，母细胞瘤，和肉瘤。所述癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、胃肠(道)癌、肾癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、急性淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(head and neck cancer)。
术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。此术语包括自身免疫病、免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、和免疫缺陷病。可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T细胞介导的，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化病、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病诸如炎性肠病(溃疡性结肠炎克罗恩氏病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。传染病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。
“自身免疫疾病”使用其广义、一般性的意义，指哺乳动物中的障碍或病症，其中所述哺乳动物个体对其自身组织成分的体液或细胞免疫反应导致正常或健康组织的破坏。例子包括，但不限于，红斑狼疮，甲状腺炎，类风湿性关节炎，银屑病，多发性硬化，自身免疫性糖尿病(autoimmunediabetes)，及炎性肠病(IBD)。
术语“带标签的”(tagged)在本文中用来指包含与“标签多肽”融合的抗体或多肽的嵌合分子标签多肽具有足够的残基来提供可针对其制造抗体的表位，或提供其它的某些功能例如寡聚化(例如具有亮氨酸拉链的肽所发生的)的能力，但该多肽又足够短，使得其通常不影响所述抗体或多肽的活性。所述标签多肽优选地还具有相当的独特性，使得针对标签特异性的抗体不与其它表位发生显著的交叉反应。合适的标签多肽一般具有至少6个氨基酸残基，通常为约8个到约50个氨基酸残基(优选地，约10到约20个残基之间)。
术语“二价金属离子”指具有两个正电荷的金属离子。二价金属离子的例子包括但不限于锌、钴、镍、镉、镁和锰。所述金属的可以利用的具体形式包括盐形式(例如药学上可接受的盐形式)，例如上述二价金属的氯化物、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐形式。可选地，用于本发明的二价金属离子是锌，优选为盐形式硫酸锌或氯化锌。
“分离的”当用于描述本文所公开的各种肽或蛋白质时，意思是肽或蛋白质已经由其天然环境的成分鉴别和分离和/或回收。其天然环境的污染性成分是可通常干扰所述肽或蛋白质的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性的或非蛋白质性的溶质。在优选的实施方案中，将所述肽或蛋白质纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到均一。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，然而，分离的肽或蛋白质通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
针对本文中鉴定的序列的“氨基酸序列同一性百分率(％)”定义为，在比对所述序列，并且必要的话引入缺口，以达到最大的序列同一性百分率以后，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数，并且不将任何保守性替代看作序列同一性的部分。为确定氨基酸序列同一性百分率所作的比对可以通过本领域现有技术之内的多种方法来实现，本领域技术人员可确定合适的衡量序列匹配的参数，包括在被比较的全长序列上实现最大序列匹配所需的指认算法(assigning algorithms)。对本文而言，氨基酸同一性百分率的值可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得，该程序由Genentech Inc.创作，其源代码和用户文档已提交到美国版权局(US Copyright Office，Washington DC，20559)，注册为美国版权注册号TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.，South San Francisco，CA.获取ALIGN-2程序。所有序列比较参数都由ALIGN-2程序设定并且不改变。
杂交反应的“严紧度”可由本领域的普通技术人员容易地确定，其通常是根据探针长度、洗涤温度和盐浓度经验计算的。一般而言，较长的探针需要较高的温度来进行合适的退火，而较短的探针需要的温度较低。杂交通常依赖于变性的DNA在它们的熔点温度以下环境中存在互补链时重新退火的能力。探针与可杂交的序列之间所需的同一性程度越高，可使用的相对温度就越高。从而，较高的相对温度倾向于使反应条件更严紧，而较低的温度则较少如此。更多的细节以及杂交反应的严紧度的解释可参见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley IntersciencePublishers，(1995)。
本文所定义的“高严紧度条件”由下面的条件确定(1)洗涤使用低离子强度和高的温度；0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂；50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt溶液，超声处理过的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，42℃，并在42℃下，0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和55℃下，50％甲酰胺中洗涤，然后进行由55℃的含EDTA的0.1xSSC组成的高严紧度洗涤。
“中度严紧条件”可以如Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989所述确定，包括在包含20％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5xDenhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑精DNA的溶液中37℃下温育过夜，然后在1xSSC中37-50℃下洗涤滤液。本领域技术人员可理解如何按需要调节温度、离子强度等以适应探针长度等因素。
术语“引物”指这样的寡核苷酸序列，其与互补RNA或DNA目标多核苷酸杂交，并作为起点，在核苷酰转移酶的作用下，由单核苷酸逐步合成多核苷酸，如在多聚酶链式反应中发生的那样。
术语“控制序列”指DNA序列在特定的宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所需要的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子，可选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能关系中时，其被“可操作地连接”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA如果表达为参与多肽的分泌的前蛋白，则所述前序列或分泌前导序列的DNA与所述多肽的DNA是可操作地连接的；启动子或增强子的DNA如果影响某编码序列的转录，则其与该编码序列是可操作地连接的；或者，核糖体结合位点如果位于便于翻译的位置，则其与编码序列是可操作地连接的。通常，“可操作地连接”意味着被连接的DNA序列是邻接的，并且，就分泌前导序列而言，是连续的并且共阅读框(in reading phase)。但是，增强子不需要是邻接的。连接是通过在方便的限制性位点进行连接反应而实现的。如果这样的位点不存在，则根据常规的做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞——NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等人，PNAS(USA)95652-656(1998)中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应物功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质域。激活受体FcγRIIA在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel等人.，Immunomethods 425-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24249(1994))。这里，FcR包括多态性，例如在编码FcγRIIIa的基因中的遗传二态性，造成该受体结合IgG1的区域中158位上的氨基酸为苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)。相对于纯合的苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或杂合的(FcγRIIIa-158F/V)受体，纯合的缬氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158V)已被证明对人IgG1具有更高的亲和性，且其体外介导的ADCC增加。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等人.，J.Immunol.Methods 202163(1996)中所描述的。
II本发明的典型方法和材料本文所公开的方法和测定法涉及检查哺乳动物组织或细胞样品中的一种或多种生物标志的表达，其中一种或多种所述生物标志的表达的确定预示或表明所述组织或细胞样品是否将对凋亡诱导剂例如Apo2L/TRAIL和抗DR5激动剂抗体敏感。所述方法和测定法包括那些检查诸如某些岩藻糖基转移酶，特别是岩藻糖基转移酶3(FUT3)和/或岩藻糖基转移酶6(FUT6)，及唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原等生物标志的表达的方法。
如上面讨论的，一些人类疾病细胞类型的群体(例如某些癌细胞群体)对凋亡诱导具有抗性。因此相信这里公开的方法和测定法可提供方便、高效且潜在的经济的(cost-effective)手段，来获得有用的数据和信息用于评估治疗患者的合适的或有效的疗法。例如，已经被诊断为患有癌症或免疫相关病症的患者可以进行活检以获得组织或细胞样品，然后通过多种体外测定检查该样品以确定该患者的细胞是否会对治疗剂例如Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体敏感。
本发明提供预测哺乳动物组织或细胞样品(例如癌细胞)对Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体的敏感性的方法。在这些方法中，获得哺乳动物组织或细胞样品并检查其一种或多种生物标志的表达。这些方法可使用多种测定模式进行，包括检测mRNA表达的测定，检测酶活性存在的酶测定，免疫组化测定和本文中描述的其它测定。所述生物标志的表达的确定预示或表明所述组织或细胞样品将对Apo2L/TRAIL和死亡受体抗体抗体敏感。申请人惊奇地发现，这些生物标志的表达与这些组织和细胞对凋亡诱导剂例如Apo2L/TRAIL和死亡受体激动剂抗体的敏感性相互关联。
如下所述，样品中许多生物标志的表达可以用多种方法来分析，这些中很多是本领域已知并为本领域技术人员所理解的，包括但不限于，免疫组化和/或Western分析，定量的基于血液的测定(例如血清ELISA)(例如用来检查蛋白表达水平)，生化酶活性测定，原位杂交，mRNA的Northern分析和/或PCR分析，和基因组Southern分析(例如用来检查基因缺失或扩增)，以及多种可通过基因和/或组织阵列分析进行的测定中的任何一种。评估基因和基因产物状况的典型规程可见例如Ausubel等人编，1995，Current Protocols In Molecular Biology，第2(Northern印迹)，第4(Southern印迹)，第15(免疫印迹)和第18(PCR分析)单元。
为了举例说明，下面提供涉及特定生物标志，例如岩藻糖基转移酶3(FUT3)，岩藻糖基转移酶6(FUT6)，唾液酰Lewis A，和唾液酰Lewis X的检测的规程。
本发明的可选的方法包括检查或检验哺乳动物组织或细胞样品中唾液酰Lewis A(sialyl Lewis A)和/或唾液酰Lewis X蛋白质的存在的规程。可以使用多种方法来检测唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis相关蛋白，例如免疫组化分析，免疫沉淀，Western印迹分析，分子结合测定，ELISA，ELIFA，荧光激活细胞分选术(FACS)等。例如，一种检测组织或样品中唾液酰LewisA和/或唾液酰Lewis X相关蛋白的表达的可选方法包括将样品与唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗体、其唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X反应性片段，或含有唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗体的抗原结合区域的重组蛋白接触；然后检测样品中唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X相关蛋白的结合。
在本发明的具体实施方案中，使用免疫组化和染色规程来检查样品中唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X蛋白的表达。组织切片的免疫组化染色已被证明是评估或检测样品中蛋白质的存在的可靠方法。免疫组化(“IHC”)技术使用抗体来原位探测并显现细胞抗原，通常利用生色或荧光方法。
样品的制备可以使用来自哺乳动物(通常为人类患者)的组织或细胞样品。样品的例子包括但不限于癌细胞，例如结肠、乳腺、前列腺、卵巢、肺、胃、胰腺、淋巴瘤和白血病的癌细胞。所述样品可以通过本领域的多种已知方法获得，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。所述组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，该样品被固定并包埋在石蜡等中。
组织样品可以用常规方法固定(及保存)(见，例如，“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，”第三版(1960)Lee G.Luna，HT(ASCP)编，The Blakston Division McGraw-HillBook Company，New York；The Armed Forces Institute of Pathology AdvancedLaboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel编，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.)。本领域的技术人员将理解，固定剂的选择取决于对该样品作组织染色或其它分析的目的。本领域的技术人员还将理解，固定的时间长短依赖于组织样品的大小和所用的固定剂。举例而言，中性缓冲的福尔马林、布安固定液(Bouin’s)或多聚甲醛都可以用来固定样品。
一般而言，首先将样品固定，然后通过递增系列浓度的醇脱水，用石蜡或其它切片介质浸润并包埋，使组织样品可切片。作为选择，可以将组织切片，并固定所得的切片。举例而言，可以根据常规的方法将组织样品包埋在石蜡中并处理(见例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology”，同上)。可使用的石蜡的例子包括但不限于Paraplast，Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋，则可用切片机等将组织切片(见例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology”，同上)。举例而言，该方法切片的厚度可为约3微米到约5微米。切片后，即可使用多种标准方法将切片附着在玻片上。玻片的粘合剂的例子包括但不限于硅烷、明胶、聚-L-赖氨酸等。例如，石蜡包埋的切片可以附着于带正电的玻片和/或聚L-赖氨酸包被的玻片。
如果包埋材料使用的是石蜡，组织切片通常被脱石蜡(deparaffinize)并用水重新水化。组织切片可以用数种标准方法脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和逐渐降低的系列浓度的醇(见例如“Manual of Histological StainingMethod of the Armed Forces Institute of Pathology”，同上)。或者可使用可商购的非有机脱石蜡剂例如Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。
可选地，制备样品以后，可使用IHC分析组织切片。IHC可与其它的技术例如形态学染色(morphological staining)和/或荧光原位杂交组合使用。可用的IHC方法有两种直接和间接测定。根据第一种测定法，直接确定抗体对目标抗原(例如唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X)的结合。该直接测定使用使用无需进一步抗体相互作用即可显现的标记试剂，例如荧光标签或酶标记的第一抗体。在典型的间接测定中，非偶联的第一抗体结合抗原，然后标记的第二抗体结合该第一抗体。在第二抗体与酶标记物结合的情况下，加入生色或荧光底物以显现抗原。由于数个不同的第二抗体可与第一抗体的不同表位反应，产生信号的放大。
免疫组化所用的第一和/或第二抗体通常用可检测的部分标记。可用的标记物很多，通常可以分为下面几类(a)放射性同位素，例如35S，14C，125I，3H，和131I。例如，可以根据Current Protocols in Immunology，第1、2卷，Coligen等人编，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)中描述的方法用放射性同位素标记抗体，放射性可以用闪烁计数法测量。
(b)胶体金颗粒。
(c)荧光标记，包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)，德克萨斯红，罗丹明，萤光素，丹磺酰，丽丝胺(Lissamine)，伞形酮，藻红蛋白(phycocrytherin)，藻蓝蛋白，或可商购的荧光团，例如SPECTRUMORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述一种或多种的衍生物。荧光标记物可以例如用Current Protocols in Immunology，同上，公开的技术与抗体偶联。荧光可以用荧光计定量。
(d)可用的酶底物有很多，美国专利4,275,149综述了其中的一些。酶通常催化生色底物发生可以用多种技术测量的化学改变。例如，酶可催化底物中的颜色变化，该变化可以用分光光度方法测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。定量荧光变化的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应成为电子激发状态，然后可能发射可测量(例如使用化学发光分析仪)的光，或者将能量供给荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利4,737,456；荧光素，2，3-二氢肽嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)，脲酶，过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。将酶偶联到抗体的技术在O′Sullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme-抗体Conjugatesfor use in Enzyme Immunoassay，于Methods in Enzym.中(J.Langone和H.VanVunakis编)，Academic press，New York，73147-166(1981)中有描述。
酶-底物组合的例子包括，例如(i)辣根过氧化物酶(HRPO)及底物过氧化氢，其中该过氧化物酶氧化染料前体(例如正苯二胺(OPD)或盐酸3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)；(ii)碱性磷酸酶(AP)及生色底物对-磷酸硝基苯酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)及生色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶)。
对本领域技术人员而言可用的其它酶-底物组合有很多。关于这些的一般性综述可参见美国专利4,275,149和4,318,980。有时，标记物和抗体是间接地偶联的。本领域技术人员可知道多种实现此目的的技术。例如，可以将抗体和生物素偶联，并将上述四大类标记物中的任意标记物与抗生物素蛋白偶联，反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合，这样所述标记物就可以间接地与所述抗体结合。或者，为了实现标记物和抗体的间接偶联，将抗体与小的半抗原偶联，将上述不同类型标记物中的一种与抗半抗原抗体偶联。这样，可实现所述标记物与抗体的间接偶联。
除了上面讨论的样品制备方法，可能需要在IHC之前、之中和之后进一步处理所述组织切片。例如可进行表位修复(epitope retrieval)方法，例如在柠檬酸缓冲液中加热组织样品(参见例如，Leong等人Appl.Immunohistochem.4(3)201(1996))。
在可选的封闭步骤后，将组织切片在合适的条件下暴露于第一抗体充分的时间，使得第一抗体结合组织样品中的目标蛋白质抗原。实现这一点的合适条件可以通过常规实验来确定。通过使用上述的任一种可检测标记物来确定抗体结合样品的程度。优选地，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化生色底物例如3，3’-二氨基联苯胺生色团的化学变化。优选地，所述酶标记物与特异性结合第一抗体的抗体偶联(例如，第一抗体是兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗兔抗体)。
可选地，IHC分析中用来检测唾液酰Lewis A或唾液酰Lewis X的表达的抗体分别是抗唾液酰Lewis A和抗唾液酰Lewis X抗体。可选地，所述抗唾液酰Lewis A和抗唾液酰Lewis X抗体是单克隆抗体。抗唾液酰Lewis A和抗唾液酰Lewis X抗体在本领域中是很容易得到的，包括从多个商业来源获得。
这样制备的样品可以封固并加盖玻片。然后对样品进行评估，例如使用显微镜，而且可以使用本领域常规使用的染色强度标准。在抗原是唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X蛋白质的情况下，可以如下评估染色强度标准表1

典型地，在这样的IHC测定中，2+左右或更高的染色型态被认为预示或表明哺乳动物细胞(例如哺乳动物癌细胞)对Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体的敏感性。
在其它的方法中，可以使样品和对所述生物标志特异性的抗体在足以形成抗体-生物标志复合物的条件下接触，然后检测所述复合物。生物标志的存在可以通过多种方式检测，例如通过Western印迹和ELISA方法来测定多种组织和样品，包括血浆或血清。使用这样的测定模式的免疫测定技术有很多，参见例如，美国专利4,016,043，4,424,279和4,018,653。上述这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法还包括标记的抗体直接结合目标生物标志。
夹心测定法是最有用和最常用的测定法之一。夹心测定技术存在多种变化形式，本发明意图涵盖所有这些变化形式。简单地说，在典型的正向测定(forward assay)中，将未标记的抗体固定在固相支持物上，将待测样品与所述结合的分子接触。在一段合适的时间的温育后，其中温育时间足以允许抗体-抗原复合物的形成，加入对所述抗原特异性的、且用能够产生可检测信号的报道分子标记的第二抗体并温育，提供充分的时间供另一抗体-抗原-标记抗体的复合物形成。洗去任何未反应的物质，然后通过观察报道分子产生的信号确定抗原的存在。这些结果可以是通过简单观察可视信号而得的定性结果，也可以通过与含有已知量的生物标志的对照样品比较而定量。
正向测定的变化形式包括同时测定(simultaneous assay)，其中样品和标记的抗体被同时施加于结合的抗体。这些技术对本领域技术人员而言是熟知的，包括显而易见的微小变化。在典型的正向夹心测定中，对生物标志具有特异性的第一抗体共价地或被动地(passively)结合到固体表面。固体表面通常是玻璃或聚合物，其中最常用的聚合物为纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。所述固相支持物的形式可以是管、珠子、微量培养板的盘，或任何其它适于实施免疫测定的表面。结合过程是本领域熟知的，通常由交联共价结合或物理吸附组成，在制备待测样品的过程中洗涤所述聚合物-抗体复合物。然后将等份待测样品施加于固相复合物并在合适的条件下(例如从室温到40℃，如25℃到32℃之间(含二端点))温育足够的时间(例如2-40分钟或者过夜，如果更方便的话)以允许抗体中存在的任何亚基的结合。温育阶段以后，将抗体亚基固相洗涤并干燥，并与对所述生物标志的部分特异的第二抗体温育。第二抗体与报道分子连接，报道分子用来表征该第二抗体与该分子标志的结合。
另外一种方法涉及将样品中的目标生物标志固定，然后将被固定的目标暴露于特异性的抗体，该抗体可以用也可以不用报道分子标记。依赖于目标的量和报道分子信号的强度，结合的目标可通过用抗体直接标记而得以检测。或者，将对第一抗体特异性的且被标记的第二抗体暴露于目标-第一抗体复合物，形成目标-第一抗体-第二抗体三元复合物。通过报道分子发出的信号检测该复合物。本说明书中使用的“报道分子”指这样的分子，其由于自身化学性质提供可分析鉴定的信号，该信号使结合抗原的抗体能够被检测。在这种类型的测定法中最常用的报道分子是酶，荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)，和化学发光的分子。
在酶免疫测定中，酶与第二抗体偶联，一般是通过戊二醛或高碘酸盐偶联。但是很容易认识到，存在本领域技术人员容易得到的多种不同的偶联技术。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。通常，选择在特定酶水解时产生可检测的颜色变化的底物来与相应的酶一起使用。可使用的酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上述的生色底物。在所有的情况下，将酶标记的抗体施加于所述第一抗体-分子标志复合物，让其结合，然后去除多余的试剂。然后向该抗体-抗原-抗体复合物施加含有合适底物的溶液。底物将与和第二抗体连接的酶反应，产生定性的可视信号，该信号可以进一步定量，通常通过分光光度法，来指示样品中存在的生物标志的量。或者，可以将荧光化合物，例如荧光素和罗丹明，化学偶联到抗体上，而不影响其结合能力。当受特定波长的光照射而被活化时，荧光团标记的抗体吸收光能，诱导分子内导致可激发的状态，然后发射可以用光学显微镜检测的特征性颜色的光。如酶免疫测定(EIA)中那样，让荧光标记的抗体与第一抗体-分子标志复合物结合。洗去未结合的试剂后，再将余下的三元复合物暴露于合适波长的光，观察到的荧光指示目标分子标志的存在。免疫荧光和EIA方法在本领域都是非常成熟的。但是，其它的报道分子，例如放射性同位素，化学发光性或生物发光性分子，也可以使用。
本文认为上述的方法也可以用来检测FUT3或FUT6多肽的表达。
本发明的方法还包括检查组织或细胞样品中mRNA，例如FUT3和/或FUT6mRNA的存在和/或表达的规程。评估细胞中的mRNA的方法是熟知的，包括，例如，使用互补DNA探针的杂交测定(例如使用标记的FUT3和/或FUT6核糖核酸探针的原位杂交，Northern印迹和相关技术)和多种核酸扩增测定(例如使用FUT3和/或FUT6特异性互补引物的RT-PCR，和其它扩增型检测方法，例如分支DNA，SISBA，TMA等)。
可以使用Northern、斑点杂交或PCR分析方便地对来自哺乳动物的组织或细胞样品进行例如FUT3和/或FUT6mRNA的测定。例如，RT-PCR，例如定量PCR测定，是本领域熟知的。在本发明的一个说明性的实施方案中，一种检测生物样品中的FUT3和/或FUT6mRNA的方法包括使用至少一种引物进行反转录，从该样品产生cDNA；使用FUT3和/或FUT6多核苷酸作为有义和反义引物扩增所产生的cDNA，以扩增其中的FUT3和/或FUT6cDNA；并检测被扩增的FUT3和/或FUT6cDNA的存在。
另外，这样的方法可包括一个或多个可确定生物样品中FUT3和/或FUT6mRNA水平的步骤(例如通过同时检测比较性对照“持家”基因例如肌动蛋白家族成员的mRNA序列水平)。可选地，可以确定被扩增的FUT3和/或FUT6 cDNA的序列。
本发明的这个方面的重要的实施方案包括FUT3和/或FUT6引物和引物对，其允许特异性扩增本发明的多核苷酸或其任意特定的部分；以及选择性地或特异性地与本发明的核酸分子或其任意部分杂交的探针。探针可以用可检测的标志例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光性化合物、化学发光性化合物、金属螯合物或酶来标记。这样的探针和引物可以用来检测样品中FUT3和/或FUT6多核苷酸的存在，或作为检测表达FUT3和/或FUT6蛋白的细胞的手段。如本领域技术人员了解的，基于本文提供的序列可以制备很多种不同的引物和探针，用来有效地扩增、克隆和/或确定FUT3和/或FUT6mRNA的存在和/或水平。
本发明的可选的方法包括通过微阵列(microarray)技术检查或检测组织或细胞样品中的mRNA，例如FUT3和FUT6或其它岩藻糖基转移酶mRNA的规程。使用核酸微阵列，来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品被反转录和标记，以生成cDNA探针。然后将这些探针与固定在固体载体上的核酸阵列杂交。该阵列这样配置，使阵列的各个成员的序列和位置都是已知的。例如，可以用一组选定的可能在特定疾病状态中表达的基因在固体载体上形成阵列。标记的探针与特定的阵列成员发生杂交表明该探针所来源的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达的分析可提供有价值的信息。微阵列技术使用核酸杂交技术和计算技术在单次实验中评估数以千计的基因的mRNA表达模式。(参见例如，2001年10月11日公开的WO01/75166 published October 11，2001；(制备阵列的讨论可参见例如，U.S.5,700,637，美国专利5,445,934，和美国专利5,807,522，Lockart，NatureBiotechnology，141675-1680(1996)；Cheung，V.G.等人，Nature Genetics21(Suppl)15-19(1999))。DNA微阵列是含有基因片段的微型阵列，这些基因片段或者直接被合成到，或者被点样到玻璃或其它支持物上。单个阵列中通常有数以千计的基因。典型的微阵列实验涉及下面的步骤1.由从样品分离的RNA制备荧光标记的目标，2.标记的目标与微阵列杂交，3.洗涤，染色，并扫描阵列，4.分析扫描的图像，和5.生成基因表达模式。目前有两种类型的DNA微阵列在使用寡核苷酸(通常是25至70mer)阵列和含有从cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列。形成阵列时，寡核苷酸可以预先合成再点样到表面，或直接在表面上(原位)合成。
Affymetrix GeneChip系统是一种可商购的微阵列系统，其包含通过直接在玻璃表面上合成寡核苷酸而制造的阵列。探针/基因阵列通过组合使用基于半导体的光刻和固相化学合成技术，通常为25聚体的寡核苷酸被直接合成在玻璃晶片上。每个阵列含有多达400,000种不同的寡聚物，每种寡聚物以数以百万计的拷贝数存在。由于寡核苷酸是在阵列上的已知位置合成的，使用Affymetrix Microarray Suite软件，杂交模式和信号强度可以解析为基因的同一性和相对表达水平。每种基因在该阵列上由一系列的不同寡核苷酸探针所代表。每个探针组由一完全匹配的寡核苷酸和一错配的寡核苷酸组成。完全匹配的探针具有与特定基因完全互补的序列，由此量度该基因的表达。错配的探针和完全匹配的探针的不同之处在于中心碱基位置有单个碱基的替换，干扰了目标基因转录物的结合。这有助于确定背景和对完全匹配的寡聚物的测得的信号有影响的非特异性杂交。该MicroarraySuite软件从完全匹配的探针的杂交强度中减去错配探针的杂交强度，以确定每个探针组的绝对强度或比强度值。探针是基于Genbank和其它核苷酸库的现有信息来选择的。这些序列被认为识别基因的3’端的独特区域。使用GeneChip杂交炉(“rotisserie”炉)进行一次多达64个阵列的杂交。射流工作站(fluidics station)执行探针阵列的洗涤和染色。它是完全自动化的，包括四个组件，每个组件持有一个探针阵列。每个组件通过Microarray Suite软件使用预编程的射流规程被独立地控制。扫描装置是共聚焦激光扫描仪，其测量与探针阵列结合的标记cRNA所发射的荧光的强度。配备MicroarraySuite软件的计算机工作站控制所述射流工作站和扫描仪。Microarray Suite软件使用为预编程的探针阵列杂交、洗涤和染色规程可控制多达8个射流工作站。该软件还采集杂交强度信号并通过合适的算法将其转换为每个基因的有/无判定。最后，该软件通过比较分析检测实验之间基因表达的改变，并以.txt文件的格式输出，该文件可以供其它软件程序用来进行进一步的数据分析。
所选的生物标志的表达也可以通过检查基因缺失或基因扩增来评估。基因缺失或扩增可以通过本领域已知的多种规程中的任一种来测量，例如通过使用合适地标记的探针进行常规的Southern印迹，Northern印迹以定量mRNA的转录(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980))，斑点杂交(DNA分析)，或原位杂交(例如FISH)，或使用合适地标记的探针进行细胞遗传学方法或比较基因组杂交(CGH)。例如，可以使用这些方法来检测FUT3和/或FUT6基因的缺失或扩增。
另外，可以检查组织或细胞样品中生物标志例如FUT3和/或FUT6基因的甲基化状态。CpG岛的异常去甲基化和/或过度甲基化在永生化和转化细胞中经常发生，并可能造成多种基因的表达改变。本领域中有很多检查基因的甲基化状态的测定法是公知的。例如，在Southern杂交方法中，可以使用甲基化敏感的限制酶来评估CpG岛的甲基化状态，该酶不能切割含甲基化CpG位点的序列。另外，MSP(甲基化特异PCR)可以容易地描述给定基因的CpG岛中的所有CpG位点的甲基化状态。该方法包括首先用亚硫酸氢钠修饰DNA(这将把所有非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶)，然后用甲基化DNA特异性(相对于非甲基化DNA)的引物扩增。涉及甲基化干扰的规程还可以在例如下列文献中找到Current Protocols In Molecular Biology，第12单元，Frederick M.Ausubel等人编，1995；De Marzo等人，Am.J.Pathol.155(6)1985-1992(1999)；Brooks等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.，1998，7531-536)；及Lethe等人，Int.J.Cancer 76(6)903-908(1998)。
所选生物标志在组织或细胞样品中的表达也可以通过基于功能或活性的测定来检查。例如，如果生物标志是酶，则可以进行本领域已知的测定来确定或检测所述组织或细胞样品中特定的酶活性的存在。
在本发明的方法中，认为还可以检查所述组织或细胞样品中Apo2L/TRAIL的表达或结合Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的受体的表达。如上所述和本领域已知的，目前认为Apo2L/TRAIL结合至少5种不同的受体DR4，DR5，DcR1，DcR2，和OPG。使用本领域已知的方法，包括本文描述的方法，可以在mRNA和蛋白质水平上检测Apo2L/TRAIL，DR4，DR5，DcR1，DcR2，和/或OPG的表达。如图10和11所示，从数据可知，检查组织或细胞样品的DcR1和/或DcR2受体表达，可能提供更多有关该组织或细胞样品是否会对Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体敏感的信息。例如，可以使用上面描述的IHC技术来检测所述样品中一种或多种这样的分子的存在。本文认为，对于不但检查组织或样品FUT或Lewis抗原标志的存在，还检查例如DR4，DR5或DcR1的存在的方法，可以从相同的组织或样品制备不同的玻片，并用对各种特定的生物标志或受体特异的试剂来测试各个玻片。或者，可以从组织或细胞样品制备单个玻片，并使用针对各种生物标志或受体的抗体进行多颜色染色程序，从而得以显现和检测各种生物标志或受体。
本文认为，确定了所述组织或细胞样品表达一种或多种指示该组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的活性敏感的生物标志以后，可以对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体来治疗疾病，例如该哺乳动物正患有的癌症或免疫相关疾病。哺乳动物中本文所述的多种病理状态的诊断可以由相关领域的技术人员进行。诊断技术是本领域已知的，其允许例如诊断哺乳动物中的癌症或免疫相关疾病。例如，癌症可以通过包括但不限于扣诊、血液分析、x射线、NMR等技术来鉴定。免疫相关疾病也可以容易地鉴定。
Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体可以根据已知的方法来施用，例如以推注或经历时程的连续输注的形式静脉施用，经由肌肉内、腹膜内、脑脊髓内(intracerebrospinal)，皮下，关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入途径。可选地，施用可以使用多种可商购的装置通过微泵(mini-pump)进行。
施用Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的有效剂量和方案可以基于经验确定，对这些的确定是本领域现有技术范围之内的。可以使用单个或多个剂量。目前认为，单独使用的Apo2L/TRAIL的有效剂量或量可为每日约1μg/kg到约100mg/kg体重或更高。剂量的种间缩放(interspecies scaling)可以以本领域已知的方式进行，例如Mordenti等人，Pharmaceut.Res.，81351(1991)所公开的。
当采用Apo2L/TRAIL体内施用时，正常的剂量可为每日约10ng/kg到100mg/kg哺乳动物体重或更高，优选约1μg/kg/日到10mg/kg/日，依赖于施用途径。文献中提供了具体的剂量和送递方法，见，例如，美国专利4,657,760；5,206,344；或5,225,212。本文预期，对于不同的治疗化合物和不同的疾病有效的剂型将是不同的，例如以一种器官或组织为目标的施用可以需要与以另一种器官或组织为目标的施用不同的送递方式。
本文还认为所述方法中还可以采用其它疗法。所述一种或多种其它疗法可包括但不限于施用放射疗法、细胞因子、生长抑制剂、化学治疗剂、细胞毒剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法尼基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂，和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，这些是本领域已知的，并由上述的特征进一步限定。本文认为所述其它疗法可以作为Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体之外的药剂使用。另外，还可使用基于靶向肿瘤抗原的治疗性抗体，例如RituxanTM或HerceptinTM，及抗血管发生抗体，如抗VEGF。
化学治疗剂的配制和剂量给药方案可以根据制造商的指示，或者如相关领域技术人员经验确定的使用。所述化学治疗法的配制和剂量给药方案还在Chemotherapy Service，M.C.Perry编，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中有描述。化学治疗剂可在Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体施用之前或之后，或与之同时施用。
除此之外还施用针对其它抗原的抗体可能是理想的，例如结合CD20，CD11a，CD18，CD40，ErbB2，EGFR，ErbB3，ErbB4，血管内皮生长因子(VEGF)、或其它TNFR家族成员(例如OPG，TNFR1，TNFR2，GITR，Apo-3，TACI，BCMA，BR3)。或者/并且，可以对患者共同施用结合相同抗原或两种或多种不同抗原的两种或多种不同抗体。施用后，可以分析体外处理的细胞。如果进行了体内处理，可以使用相关领域技术人员熟知的多种方法监测被处理的哺乳动物。例如，可对肿瘤细胞进行病理学检查以测定坏死，或者分析血清的免疫系统反应。
本发明还提供用于上面描述或提示过的用途的试剂盒或制品。这样的试剂盒可包含载体装置，其被分为区室以密闭地容纳一种或多种容器装置例如小瓶、管等等。每个容器装置包含方法中要使用的不同元件中的一种。例如，容器装置中的一个可包含探针，该探针是或可以是可检测地标记的。这样的探针可以是分别针对FUT3和/或FUT6蛋白或FUT3和/或FUT6基因或信使分子特异性的抗体或多核苷酸。在所述试剂盒利用核酸杂交来检测目的核酸时，该试剂盒还可以具有含有核苷酸的容器，该核苷酸用于扩增目标核酸序列，和/或具有包含报道工具的容器，所述报道工具，例如生物素结合蛋白，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，与报道分子例如酶、荧光或放射性同位素标记物结合。
本发明的试剂盒通常包括上面描述的容器，和一种或多种其它的容器，这些其它的容器包含从商业和使用者观点看来需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器，以及带使用说明的包装说明书。容器上可能有标识，提示该组合物用于特定的疗法或非治疗性的用途，还可以提示体内或体外用途的指导，例如上面描述的那些用途。
本发明的试剂盒有多种实施方案。一种典型的实施方案是一种试剂盒，包括容器、所述容器上的标识、及所述容器内含有的组合物，其中所述组合物包括结合FUT3和/或FUT6多肽序列的第一抗体，所述容器上的标识指示该组合物可用于评估至少一类哺乳动物细胞中的FUT3和/或FUT6蛋白质的存在，以及使用FUT3和/或FUT6抗体评估至少一类哺乳动物细胞中的FUT3和/或FUT6蛋白质的存在的指导。该试剂盒可进一步包括用于制备组织样品和将抗体和探针施加于组织样品的相同切片的一套指导和材料。该试剂盒可包括第一和第二抗体，其中第二抗体与标记物偶联，例如酶标记物。
另一种实施方案是一种试剂盒，包括容器、所述容器上的标识、及所述容器内含有的组合物，其中所述组合物包括在严紧条件下与FUT3和/或FUT6多核苷酸互补物(complement)杂交的多核苷酸，所述容器上的标识指示该组合物可用于评估至少一类哺乳动物细胞中的FUT3和/或FUT6的存在，以及使用FUT3和/或FUT6多核苷酸评估至少一类哺乳动物细胞中的FUT3和/或FUT6RNA或DNA的存在的指导。
该试剂盒中其它的可选组分包括一种或多种缓冲液(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液，等等)，其它试剂例如被酶标记物化学改变的底物(例如色原(chromogen))，抗原修复溶液，对照样品(阳性和/或阴性对照)，对照玻片等。
实施例通过下面的实施例，对本发明的多个方面作进一步的描述和说明，所有这些实施例都不意在限制本发明的范围。
方法和材料细胞培养和细胞系下面的人结肠直肠细胞系HCT-8，COLO 205，HCT 116，SW403，LoVo，SW948，Caco-2，COLO 201，SW1417，DLD-1，CX-1，HCT-15，LS 180，RKO，RKO-AS45-1，SK-CO-1，SW480，SW620，SW837，CL-40，COLO-206F，COLO 320DM，COLO 320HSR，COLO-678，HT-29，KM12，LS1034，SW1116得自ATCC(美国典型培养物保藏中心)储藏库(Manassas，Virginia)、DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心)、JCRB(日本细胞资源银行)或ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心)，并在加有10％热灭活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES的RPMI-1640培养基中培养。
细胞毒性测定MTT测定(CellTiter 96非放射性细胞增殖测定系统，来自Promega)，是一种基于活细胞将可溶性四唑盐(MTT)还原为蓝色甲晶体的能力的比色测定方法，使用MTT测定来确定Apo2L/TRAIL或DR5抗体处理后活细胞的数量。MTT测定通过在含不同浓度(0到1000ng/ml)的Apo2L/TRAIL或DR5抗体的96孔板的培养孔中加入预混合的经过优化的染料溶液来进行。在4小时的温育过程中，活细胞将染料溶液的四唑组分转化为甲产物。然后向培养孔中加入溶解/终止溶液以溶解该甲产物，使用96孔板读板器(SpectraMax)记录570nm的吸光度。570nm吸光度的测量值与增殖测定中正常使用的细胞的数目成正比。虽然甲产物的最大吸收是570nm，而且纯溶液显蓝色，但测定终点时的颜色可能不是蓝色，而是依赖于存在的甲相对于培养基中其它组分(包括血清、酸化的酚红和未还原的MTT)的量。
通过进行细胞滴定，在测定的线性范围的高端的附近产生测定信号，来优化细胞数目。由于不同的细胞类型具有不同的代谢活性水平，对各种细胞系分别进行上述优化。对于被检查的大多数肿瘤细胞，使用每孔5,000细胞到每孔20,000细胞。
下面是所采用的测定法的逐步描述1.用于生物测定的细胞来自储用培养物。
2.确定细胞数目和锥虫蓝活力，以5,000到20,000细胞每孔的终数目悬浮细胞。
3.向96孔板中分别加入50μl细胞培养物。
4.在37℃、加湿的5％CO2气氛下温育该培养板过夜。
5.向所述96孔板的样品中加入含0到100ng/ml的不同浓度的Apo2L/TRAIL或DR5抗体的50μl培养基。对照是50μl培养基(无Apo2L/TRAIL或DR5抗体)和100μl培养基(无细胞)。
每个实验都按一式三组孔进行，并在独立的三天中进行。孔中总体积是100μl/孔。
6.在37℃、加湿的5％CO2气氛下温育培养板72小时。
7.向每个孔加入15μl染料溶液。
8.在37℃、加湿的5％CO2气氛下温育培养板4小时。
9.向每个孔加入100μl溶解/终止溶液。
10.在37℃温育培养板过夜。
11.使用96孔板读板器记录570nm波长的吸光度。使用750nm的参比波长来减少细胞碎片、指纹和其它非特异性吸收带来的背景。
12.用阴性对照的吸收值的平均值作为空白值，从其它所有的读数中减去该值。用每个浓度的Apo2L/TRAIL或DR5抗体的吸收值的平均值除以阳性对照(100％活细胞-未处理的)的吸收值的平均值，来计算活细胞的量(以％计)。
13.以活细胞的百分率(Y轴)对Apo2L/TRAIL或DR5抗体的浓度(X轴，对数标度)作图，找到对应于50％的活细胞的X轴的值(ng/ml)来确定IC50值。
Affymetrix标记规程读取所有样品的OD260/280，在BioAnalyzer上运行样品。使用5μg的高质量总RNA。
第一链cDNA合成1.引物杂交DEPC-H2O xμl 涡旋混合 快速旋转DNA(5μg) yμl 在70℃温育10分钟示踪物(Spike)(对5μg 1∶4稀释储液)1μl 快速旋转并置于冰上T7-(dT)24引物 1μl体积 12μl2.温度调节5X第一链cDNA缓冲液 4μl每个样品加入 7μl(的左边的混合物)。
0.1M DTT 2μl 涡旋混合.快速旋转10mM dNTP混合物1μl 42℃温育2分钟。
体积 7μl3.第一链合成向每个样品加入 1μl SSII RT。
SSII RT 1μl 用移液器吹吸或轻微涡旋混合快速旋转总体积 20μl 42℃温育1小时。
B.第二链cDNA合成1 将第一链反应物放在冰上，短暂离心以带下管壁上的凝结物2 制备下面的第二链主混合物(master-mix)DEPC处理的H2O 91μl5X第二链反应混合物 30μl10mM dNTP混合物 3μl10U/μl DNA连接酶 1μl10U/μl DNA聚合酶I 4μl2U/μl RNA酶H 1μl总体积 130μl
3.向20μl第一链cDNA中加入130μl第二链主混合物(终体积＝150μl)4.用移液器吹吸或轻微涡旋混合，快速旋转。
5.在冷却水浴中16℃温育2小时。
6.加入2μl[10U]T4 DNA聚合酶。用移液器吹吸或轻微涡旋混合。快速旋转。
7.16℃温育5分钟。
8.加入10μl 0.5M EDTA，轻微涡旋。快速旋转9.继续进行到cDNA净化步骤，或者保存在-20℃备用。
双链cDNA的净化(GeneChip样品净化组件(module))1.向162μl最终的双链cDNA合成制备物中加入600μl cDNA结合缓冲液。
涡旋3秒钟混合。
2.检查确认混合物的颜色是黄色的(与没有cDNA合成反应物的cDNA结合缓冲液相似)。如果混合物的颜色是橙色或紫色的，加入10μl 3M乙酸钠，pH 5.0，并混合。混合物的颜色将变成黄色。
3.将500μl样品加到cDNA净化旋转柱上，该柱置于2ml的收集管中，≥8,000xg(≥10,000rpm)离心1分钟。将流过物(flow-through)作为危险废物弃去。
4.再将剩余的混合物(262μl)加样到旋转柱上，并如上离心。流过物作为危险废物弃去，并弃去收集管。
5.将旋转柱转移到新的2ml收集管(有提供)中，用移液器加750μlcDNA洗涤缓冲液到旋转柱上。≥8,000xg(≥10,000rpm)离心1分钟。弃去流过物。
6.打开旋转柱的盖，并以最大速度(≤25,000xg)离心5分钟，将柱放入离心机的槽中，每隔一个槽放入，使盖位于旁边的槽的上方，使得它们朝向与旋转相反的方向，即，如果旋转是顺时针的，则使各个盖朝向逆时针方向。这可以避免盖的损伤。弃去流过物和收集管。
7.将旋转柱转移到1.5ml收集管中。用移液器将10μl cDNA洗脱缓冲液直接加到旋转柱的膜上。确保cDNA洗脱缓冲液被直接地分施到膜上。室温温育1分钟，然后在最大速度(≤25,000xg)离心1分钟洗脱。
准备和进行IVT反应EnzoBioarray高产率RNA转录物标记试剂盒(件号900182)1.使用10μl的净化的双链cDNA2.制备下面的IVT主混合物蒸馏水或去离子水12μl10X HY反应混合物4μl10x生物素标记的核糖核苷酸4μl10X DTT 4μl10X RNA酶抑制剂混合物4μl20X T7 RNA聚合酶2μl总体积 30μl3.向10μl双链cDNA中加入30μl的IVT主混合物(总体积＝40μl)。
4.用移液器吹吸或轻微涡旋混合，快速旋转。
5.立即将管放在37℃水浴中温育5小时。
6.如果不立即纯化RNA，在-20℃保存。
生物素标记的cRNA的净化(GeneChip样品净化组件)1.向IVT反应物中加入60μl H2O，涡旋混合3秒。
2.向该样品中加入350μl IVT cRNA结合缓冲液，涡旋混合3秒。
3.向裂解物中加入250μl乙醇(96-100％)，通过移液器吹吸充分混合，不要离心。
4.将样品(700μl)加到IVT cRNA净化旋转柱上，该柱置于2ml的收集管中，≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒。
5.使洗脱物再过柱一次。≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒。将流过物作为危险废物弃去，并弃去收集管。
6.将旋转柱转移到新的2ml收集管(有提供)中。
7.加入500μl IVT cRNA洗涤缓冲液并以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒来洗涤。弃去流过物。
8.用移液器将500μl 80％(v/v)乙醇加到旋转柱上，并以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒。弃去流过物。
9.打开旋转柱的盖，以最大速度(≤25,000xg)离心5分钟。弃去流过物和收集管。
10.将旋转柱转移到新的1.5ml收集管中。
11.用移液器将11μl无RNA酶的水直接加到旋转柱的膜上。静置1分钟。以最大速度(≤25,000xg)离心1分钟以洗脱。
12.用移液器将10μl无RNA酶的水直接加到旋转柱的膜上。静置1分钟。以最大速度(≤25,000xg)离心1分钟以洗脱。
定量cRNA(IVT产物)使用分光光度分析来确定RNA的产率。适用260nm处的1OD等于40μg/ml RNA的惯例。检查260nm和280nm处的OD以确定样品浓度和纯度。对于纯RNA，保持A260/A280接近2.0(1.9到2.1之间的比值是可接受的)。
当使用总RNA作为起始材料时，定量cRNA，必须计算调整的cDNA产率，以反映未标记的总RNA的残余(carryover)。使用100％残余的估计值时，使用下式来确定调整的cRNA产率调整的cRNA产率＝RNAm-(总RNAi)(y)RNAm＝IVT后测得的cRNA的量(μg)总RNAi＝总RNA的起始量(μg)y＝IVT中使用的cDNA反应物的分数断裂cRNA以制备目标断裂使用调整的cRNA浓度。
1.对每8μl的RNA加水，加2μl的5x断裂缓冲液20μg cRNA 1到32μl5X断裂Buffer 8μl加无RNA酶水到40μl总体积40μl
2.在94℃温育30分钟。温育后立即放在冰上。
制备杂交目标1.将20X真核杂交对照(Eukaryotic Hybridization Controls)和Oligo B2在65℃加热5分钟。
Affymetrix GeneChip真核杂交对照试剂盒(件号900362(150rxns)。
2.轻微涡旋，旋转使之沉降。
3.主混合物(假设断裂的cRNA浓度是0.5μg/μl)标准阵列 (μl) 终浓度断裂的cRNA 15μg 30 0.05μg/μlOligo B2(3nM)5 50pM20x对照示踪物15 1.5，5，25，100pM(Bio B，C，D，Cre)鲑精DNA 3 0.1mg/ml乙酰化BSA3 0.5mg/ml人cot-1 DNA(1mg/ml) 30 0.1mg/ml2X MES Hyb缓冲液 150 1XH2O 64终体积 3004.将270μl等份的主混合物加入管中，并向每个管中加入30μl的断裂的cRNA。这即是杂交混合物。
5.在即将使用之前使探针阵列平衡到室温。
6.用1x MES Hyb缓冲液充满探针阵列，在rotisserie炉中45℃、60rpm温育10分钟。
7.在99℃水浴中加热杂交混合物5分钟。
8.将杂交混合物转移到45℃水浴中5分钟。
9.以最大速度离心杂交混合物5分钟。
10.从探针阵列中移去1x MES Hyb缓冲液。
11.将最上面的200μl杂交混合物充入探针阵列。
12.用Tough-Spots封闭隔板。
13.在45℃、60RPM杂交该探针阵列19小时。
14.按照Affymetrix的规程洗涤、染色并扫描该探针阵列。
项目供应商目录号T7-(dT)24引物 Biosearch Technologies自定义对照示踪物 内部来源 -Superscript II/5X第一链缓冲液/0.1M DTT Invitrogen18064-0145X第二链缓冲液 Invitrogen10812-01410mM dNTP Invitrogen18427-08810U/ul大肠杆菌DNA连接酶 Invitrogen18052-01910U/ul大肠杆菌DNA聚合酶IInvitrogen18010-0252U/ul RNA酶HInvitrogen18021-07110U/ul T4 DNA聚合酶 Invitrogen18005-0250.5M EDTA Sigma E-7889ENZO高产率RNA转录物标记试剂盒 Affymetrix或ENZO 900182(ENZO)GeneChip样品净化组件Affymetrix900371乙酰化牛血清白蛋白 Invitrogen15561-020山羊IgG-试剂级 Sigma I-5256抗链霉抗生物素蛋白抗体(山羊)，生物素化 Vector Labs BA-0500R-藻红蛋白链霉抗生物素蛋白 Molecular Probes S-86620X SSPEBioWhittaker 51214真核对照试剂盒 Affymetrix900362水，分子生物学级Ambion9934人Cot-1 DNA Roche 1-581-0745M NaCl，无RNA酶，无DNA酶 Ambion9760消泡剂0-30 Sigma A-808210％Tween-20Pierce Chemical 28320MES游离酸单水合物 Sigma M5287MES钠盐 Sigma M3885EDTA二钠盐，0.5M溶液Sigma E7889Tough Spots Label Dots USA Scientific 9902GeneChip杂交炉640 Affymetrix800139
GeneChip扫描仪3000w/工作站 Affymetrix 00-0074射流工作站(Fluidics Station)Affymetrix 00-0081自动上样器w/外置条形码读码器Affymetrix 00-0129定量PCRcDNA合成

温育条件25℃10分钟37℃2小时TaqMan反应，使用ABI Prism 7700测序检测器

热循环条件
95℃10分钟40个循环95℃15秒60℃1分钟TaqMan探针Assays-on-DemandTM(TaqManMGB探针，FAMTM染料标记的)扩增内源对照GAPDH(探针浓度100nM，正向和反向引物浓度200nM)来使加到每个反应的样品RNA(cDNA)的量标准化。
使用标准曲线法进行相对定量。为了进行针对内源对照归一化的定量，对目标和内源对照都制作标准曲线。对每个实验样品，由合适的标准曲线确定目标和内源参照的量。然后，用目标的量除以内源参照的量以得到归一化的目标值。用实验样品之一作为校正样品，或1x样品。然后用各个归一化的目标值除以校正样品的归一化的目标值，生成相对表达水平。
FACS/流式细胞术(2°抗体染色规程)所有温育和旋转都在4℃下进行，各管不在冰箱中时都保持在冰上。
1.通过确定要使用的细胞系、目标抗体和任何特殊的条件或处理，来确定管的规格。
a.对照i.未染色的，2°抗体，如果荧光团具有重叠的发射光谱则进行补偿。
b.举例

2.标记FACS管。
a.BD Falcon 12×75mm聚苯乙烯圆底。目录号3520523.准备用于染色的细胞a.用Accutase或胰蛋白酶处理贴壁细胞i.Innovative Cell Technologies Inc，Accutase.
ii.Gibco，胰蛋白酶。目录号25200-106b.如果细胞悬浮则继续下面的步骤4.将细胞等分在15mL或50mL锥形管中。
5. 4℃，1200rpm旋转细胞5min。
6.吸出上清。
7.将细胞重悬于5mL的FACS缓冲液中。
8. 4℃，1200rpm旋转细胞5min。
9.吸出上清。
10.将细胞重悬于封闭缓冲液中。
a.确定所需的封闭缓冲液的体积i.每种细胞系的管数/处理×100μl封闭缓冲液每管。
ii.每100μl封闭缓冲液需要1×106个细胞。
11.向合适的管中加入100μl等份的细胞。
a.基于预先确定的管的规格。
12.将1°抗体加入合适的管中。
a.Lewis Ai.每管使用0.2μg/μl的储液10μl。
1.终浓度为2μg。
ii Chemicon抗-唾液酰Lewis A.目录号MAB2095b.Lewis Xi.每管使用0.5μg/μl的储液5μl。
1.终浓度为2.5μg。
ii.BD PharmingenCD15s(唾液酰Lewis X)目录号551344。
13. 4℃温育30min。
14.每管加入1mL FACS缓冲液。
15. 4℃，1200rpm旋转细胞5min。
16.吸出上清17.轻柔地使管“过架(rack)”以悬起沉淀。
a.“过架”使管在12×75mm的试管架的表面上从一边运动到另一边18.重复步骤14-17。
19.向每个组中加入100μl封闭缓冲液。
20.将2°抗体加入合适的管中。
a.每管用10μlb.Jackson，山羊抗小鼠FITC.目录号115-096-06821. 4℃温育30分钟。
22.重复步骤14-17两次。
23.将细胞重悬于FACS缓冲液/PI中。
a.确定需要的体积i.每管需要1mL溶液。
ii.PI＝1μl每1mL缓冲液。
b.Molecular Probes，碘化丙锭.目录号P356624.将管置于冰槽或冰镇的试管架上。
25.用铝箔覆盖，送到FACS实验室，由合格的操作人员采样并分析。
5％封闭缓冲液1.FBS到总体积的5％。
2.FACS缓冲液。
3.通过0.2μm滤器过滤该溶液。
FACS缓冲液1. 980mL PBS。
2. 8mL 0.25M EDTA3. 20mL FBS.
4.通过0.2μm滤器过滤该溶液。
免疫组化方法唾液酰Lewis A抗体唾液酰Lewis A AB-1克隆121SLE
供应商NeoMarkers目录号.MS-279-PIg物种小鼠IHC方法石蜡预处理无IHC操作自动染色装置(Autostainer)同种型小鼠IgM方法物种人IgG浓度200μg/ml常规步骤脱石蜡并用蒸馏水重新水化。
用Vector抗生物素蛋白生物素封闭系统(Vector Avidin Biotin BlockingSystem)封闭内源生物素。
用TBS漂洗换液2次，每次5分钟。
用10％正常马血清室温封闭30分钟。
将切片与用10％正常马血清稀释到5μg/ml的小鼠单克隆唾液酰Lewis A抗体在室温共温育60分钟。
将用10％正常马血清稀释到5μg/ml的小鼠同种型IgM作为阴性对照。
用TBS漂洗换液2次，每次5分钟。
将切片与用10％正常马血清1∶200稀释的生物素化马抗小鼠抗体在室温共温育30分钟。
用TBS漂洗换液2次，每次5分钟。
将切片与稀释的Vector ABC Elite System在室温共温育30分钟。
用TBS漂洗换液2次，每次5分钟。
将切片与Pierce金属增强DAB(PierceMetal Enhanced DAB)共温育5分钟在流动的自来水中漂洗5分钟。
用Mayers苏木精复染1分钟。
在流动的自来水中漂洗5分钟。
用Richard-Allan蓝染试剂蓝染苏木精1分钟。
在流动的自来水中漂洗2分钟。脱水，透明，并封固在合成的封固介质中。
免疫组化方法唾液酰Lewis X抗体小鼠抗唾液酰Lewis X克隆KM93供应商Chemicon目录号.MAB2096Ig物种小鼠IHC方法石蜡预处理DAKO目标修复剂(DAKO Target Retrieval)IHC操作自动染色装置同种型小鼠IgM方法物种人IgG浓度100μg/ml常规步骤脱石蜡并用蒸馏水重新水化。
用稀释于dH2O中的1∶10稀释液KPL封闭溶液(KPL Blocking Solution)室温4分钟消除内源过氧化物酶活性。
在蒸馏水中漂洗5分钟。
在沸水浴中，在预热到99℃的DAKO Target Retrieval(S1700)中温育20分钟。从沸水浴中移出，使之冷却20分钟。
用Vector Avidin Biotin Blocking System封闭内源生物素。
用10％正常马血清(Normal Horse Serum)在室温封闭30分钟。
将切片与用10％正常马血清稀释到5μg/ml的小鼠单克隆唾液酰Lewis X抗体在室温共温育60分钟。
将用10％正常马血清稀释到5μg/ml的小鼠同种型IgM作为阴性对照。
用TBS漂洗换液2次，每次5分钟。
将切片与用10％正常马血清1∶200稀释的生物素化马抗小鼠抗体在室温共温育30分钟。
用TBS漂洗换液2次，每次5分钟。
将切片与稀释的Vector ABC Elite System在室温共温育30分钟。
用TBS漂洗换液2次，每次5分钟。
将切片与Pierce金属增强DAB(PierceMetal Enhanced DAB)共温育5分钟在流动的自来水中漂洗5分钟。
用Mayers苏木精复染1分钟。
在流动的自来水中漂洗5分钟。
用Richard-Allan蓝染试剂蓝染苏木精1分钟。
在流动的自来水中漂洗2分钟。
脱水，透明，并封固在合成封固介质中。
实验结果实验用上述的方法和材料进行。这些实验的结果如下面要讨论的图6-13所示。
图6提供分析28个结肠或结肠直肠癌细胞系对Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5单克隆抗体“mab”(交联的“XL”或非交联的，+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)的凋亡活性的敏感性或抗性，及其FUT 3，FUT 6，唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X的表达，所得数据的汇总表。
图7提供不同的结肠或结肠直肠癌细胞系对DR5抗体的敏感性及由定量PCR测量的FUT3的表达的比较。
图8提供不同的结肠或结肠直肠癌细胞系对DR5抗体(加上交联物)的敏感性或抗性及由FACS确定的唾液酰Lewis X或A的表达的比较。
图9A显示分析不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的敏感性或抗性与FUT3表达之间的相关性的Spearman等级相关性检验(Spearman RankCorrelation test)。
图9B显示分析不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的敏感性(“sens”)或抗性(“res”)的Fisher’s Exact检验结果，和FUT3和唾液酰Lewis A/X的表达与各细胞系对DR5抗体凋亡活性的敏感性之间的统计学显著性。
图10比较不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的DcR1或DcR2受体的表达(由定量PCR确定)及特定的细胞系对Apo2L或DR5抗体的状态(敏感或抵抗)。
图11比较不同的结肠或结肠直肠癌细胞系的DcR1或DcR2受体的表达(由FACS确定)及特定的细胞系对Apo2L或DR5抗体的状态(敏感或抵抗)。
图12显示4种结肠直肠细胞癌细胞系CaCo2(Colo2)，SW 1417，DLD-1，和Colo 205对唾液酰Lewis A和X的免疫组化染色，及其与唾液酰Lewis A和X的表达(如FACS测量的)的相互关系和与对Apo2L TRAIL的敏感性的相互关系。结肠直肠癌细胞系Colo 2和SW1417在FACS中对于唾液酰Lewis抗原分别显示无染色和弱的染色，分别是阴性和弱阳性的并对Apo2L/TRAIL有抗性。而结肠直肠癌细胞系DLD-1和Colo 205在FACS中对于唾液酰Lewis抗原分别显示中等染色和强的染色，分别是中度和强阳性的并对Apo2L/TRAIL敏感。
图13是显示正常结肠粘膜、正常肝组织、原发性结肠癌和结肠癌转移的组织样品中的唾液酰Lewis A和X的表达的IHC实验的总结。在IHC实验中检验了排列在组织微阵列中的正常结肠和原发性结肠癌的组织样品，而正常肝和转移的结肠癌的组织样品在单独的玻片上。从正常结肠组织到原发性结肠癌再到转移性结肠癌，唾液酰Lewis A和X的表达的广泛度和免疫组化染色强度增加。正常的肝细胞对唾液酰Lewis A或X都没有染色。
权利要求
1.预测哺乳动物组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步骤得到哺乳动物组织或细胞样品；检查所述组织或细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，其中，所述一种或多种生物标志的表达预示所述组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL的凋亡诱导活性敏感。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过检测岩藻糖基转移酶3或岩藻糖基转移酶6的mRNA表达来检查的。
3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过免疫组化检测唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达来检查的。
4.权利要求1的方法，还包括检查所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达的步骤。
5.权利要求1的方法，其中组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述癌细胞是结肠、结肠直肠、胃肠或胰腺的癌细胞或组织。
7.在哺乳动物组织或细胞样品中诱导凋亡的方法，包括下列步骤得到哺乳动物组织或细胞样品；检查所述组织或细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及检测所述一种或多种生物标志的表达后，使所述组织或细胞样品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL。
8.权利要求7的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过检测岩藻糖基转移酶3或岩藻糖基转移酶6的mRNA表达来检查的。
9.权利要求7的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过免疫组化检测唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达来检查的。
10.权利要求7的方法，还包括检查所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达的步骤。
11.权利要求7的方法，其中组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
12.权利要求11的方法，其中所述癌细胞是结肠、结肠直肠、胃肠或胰腺的癌细胞或组织。
13.权利要求7的方法，其中所述细胞被暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽，该Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ ID NO1)的氨基酸114-281。
14.治疗哺乳动物中的疾病，例如免疫相关疾病或癌症的方法，包括下列步骤得到所述哺乳动物的组织或细胞样品；检查所述组织或细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及检测所述一种或多种生物标志的表达后，对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过检测岩藻糖基转移酶3或岩藻糖基转移酶6的mRNA表达来检查的。
16.权利要求14的方法，其中所述一种或多种生物标志的表达是通过免疫组化检测唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表达来检查的。
17.权利要求14的方法，还包括检查所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达的步骤。
18.权利要求14的方法，其中组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述癌细胞或组织包含结肠、结肠直肠、胃肠或胰腺的癌细胞或组织。
20.权利要求14的方法，其中对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL多肽，该Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ ID NO1)的氨基酸114-281。
21.权利要求14的方法，其中还对所述哺乳动物施用化学治疗剂或放射疗法。
22.权利要求14的方法，其中还对所述哺乳动物施用细胞因子、细胞毒剂或生长抑制剂。
23.权利要求7的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
24.权利要求14的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
25.权利要求6的方法，其中所述癌细胞是结肠或结肠直肠癌细胞。
26.权利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281的多肽，或其生物活性片段。
27.权利要求26的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281的多肽。
28.权利要求12的方法，其中所述癌细胞是结肠或结肠直肠癌细胞。
29.权利要求20的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽由图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281组成。
30.预测哺乳动物的结肠或结肠直肠癌细胞对Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步骤得到哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞；检查所述癌细胞以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，其中所述一种或多种生物标志的表达预示所述癌细胞对Apo2L/TRAIL的凋亡诱导活性敏感。
31.在哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞中诱导凋亡的方法，包括下列步骤得到哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞；检查所述癌细胞以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及在检测所述一种或多种生物标志表达后，将所述癌细胞暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽。
32.权利要求31的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
33.权利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
34.权利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。
35.治疗哺乳动物中结肠或结肠直肠的癌症的方法，包括下列步骤得到所述哺乳动物结肠或结肠直肠癌细胞样品；检查所述癌细胞样品以检测选自岩藻糖基转移酶3、岩藻糖基转移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一种或多种生物标志的表达，及在检测所述一种或多种生物标志表达后，对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
36.权利要求35的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
37.权利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接于聚乙二醇分子。
38.权利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括图1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。
全文摘要
提供了检查哺乳动物组织或细胞样品中一种或多种生物标志的方法和测定法。根据所公开的方法和测定法，检测到一种或多种这样的生物标志的表达预示或表明所述组织或细胞样品将对凋亡诱导剂例如Apo2L/TRAIL和抗DR5激动剂抗体敏感。可被检查的特定生物标志包括岩藻糖基转移酶，特别是岩藻糖基转移酶3(FUT3)和/或岩藻糖基转移酶6(FUT6)，例如唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原。还提供了试剂盒和制品。
文档编号C12Q1/68GK101035912SQ200580034126
公开日2007年9月12日 申请日期2005年8月3日 优先权日2004年8月6日
发明者克劳斯·W·瓦格纳 申请人:健泰科生物技术公司