专利名称：RNase 9蛋白及其编码序列和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质工程、基因工程和生物医药领域，具体涉及人RNase 9蛋白、其核苷酸编码序列以及它们的抗菌用途。
背景技术：
已知精子从睾丸中产生以后，并不成熟，需要在附睾管中获得运动能力和与卵子结合能力。附睾通常分为头，体， 尾三部分，从头到尾附睾上皮细胞分泌的成分各不相同，造成了一个独特的供精子成熟的微环境。附睾同睾丸相比，是理想的男性避孕靶器官，因为它不影响睾丸激素分泌。
同时许多男性不育和附睾病变相关，比如附睾感染发炎会导致附睾管堵塞，从而造成少精或无精，导致不育。
在1999年前，在人和各种动物附睾动物中有十五个附睾特异基因被克隆。为了发现更多的附睾特异基因可以用于男性避孕的靶点。已有报道用恒河猴作为动物模型，构建了一个附睾特异的cDNA文库，从中筛选出11个附睾特异新基因的全长cDNA[Liu Q等人Endocrinology，2001，1424529-4539]。
目前，在人附睾特异基因中报道有抗菌活性的有HE2、ESC42、CST11等，其中HE2，ESC42属于防卫素家族，CST11属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。
因此，本领域中仍然需要开发和提供新的来自其它蛋白家族的抗菌蛋白。
发明内容
本发明一方面提供了一种分离的蛋白RNase 9，所述蛋白包含选自以下的氨基酸序列，(a)选自序列表SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列；(b)相对于选自SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有抗菌活性的氨基酸序列；(c)相对于选自SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有抗菌活性的氨基酸序列。
在较佳的实施方案中，所述蛋白具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了一种分离的核苷酸序列或具互补序列，所还核苷酸序列编码本发明的上述蛋白。
在较佳的实施方案中，所述核苷酸序列具有选自SEQ ID NO4或5的核苷酸序列。
本发明另一方面提供了一种构建物，所述构建物含有上述核苷酸序列。在较佳的实施方案中，所述构建物还包含与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
本发明另一方面提供了一种细胞，所述细胞含有本发明上述的蛋白、核苷酸序列或构建物。
本发明另一方面提供了一种制备本发明蛋白的方法，其特征在于，该方法包括(a)在适合该蛋白表达的条件下，培养本发明上述的细胞；(b)分离出所述的蛋白。
本发明另一方面还提供了与本发明所述的蛋白特异性结合的抗体。在较佳的实施方案中，该抗体是单克隆抗体。
本发明另一方面还涉及本发明所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞在制备抗菌药物中的用途。
本发明另一方面还提供了一种抗菌药物组合物，所述组合物包含本发明所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞，以及药学上可接受的载体。
本发明的RNase 9蛋白能够在附睾内特异性表达，而且所述蛋白表现出抗菌活性，因此其可以用于治疗感染，尤其可被用于治疗泌尿生殖感染，因为它是一种天然的抗菌肽，可以预见可能具有较少的副作用。本发明的其它优点可从以下的详细描述获知。
图1显示了本发明的蛋白RNase 9的mRNA在不同猕猴组织内的特异性表达情况，其中Ca表示附睾头部；Co表示附睾体部；Cd表示附睾尾部；Te表示睾丸；Ad表示肾上腺；Sp表示脾；H表示心脏；Li表示肝；Sa表示唾液腺；Ce表示大脑；Od表示输卵管；Ov表示卵巢。
图2显示了Rnase9 mRNA的雄性激素调节。用Northern杂交分析来自所示附睾区域的总RNA(10微克/泳道)，其中Ca表示头部；Co表示体部；PCd表示尾部近端；DCd表示尾部远端。
图3显示了RNase 9的Western鉴定结果。以5ng猕猴RNase 9抗原作为阳性对照(用来获得抗血清)用SDS-PAGE对来自附睾头部、体部和尾部区域的8微克蛋白进行分析，然后用抗重组成熟猕猴RNase 9蛋白的抗血清进行免疫检测，图中C表示抗原对照；Ca表示头部；Co表示体部；Cd表示尾部。
图4显示了猕猴附睾内的免疫染色。玻片用苏木精复染。A表示头部(20倍物镜)；B表示体部(20倍物镜)；C表示尾部近端(20倍物镜)；D表示尾部远端(20倍物镜)；E表示体部对照(20倍物镜，免疫前血清)；F表示体部(40倍物镜)；G表示尾部近端(40倍物镜)；H表示尾部远端(40倍物镜)。图内的线条表示100微米。
图5显示了RNase 9的抗菌活性。
具体实施例方式
本发明人通过抑制性差减杂交技术构建了猴附睾特异的cDNA文库，通过测序，从中发现了36个附睾特异新基因的片断，进一步构建了一个猴附睾常规cDNA文库，用这些片断去筛选该文库，获得了11个附睾特异新基因的全长cDNA[Liu Q等人Endocrinology，2001，1424529-4539]。而ESC461是其中一个，申请GenBank号为AF218045(未公开)，cDNA长1071bp(SEQ ID NO5)，编码204氨基酸(SEQ ID NO2)。根据已公开的人基因组序列，根据同源性设计引物，用PCR法获得了人的对应基因序列，申请GenBank号为AY907670(未公开)，其cDNA全长1068bp(SEQ ID NO4)，编码205氨基酸(SEQ ID NO1)。由于它跟已发现的RNase A超家族具有一定的同源性(20％)，且含有保守的4对二硫键，因而命名为RNase 9。
具体而言，本发明首先提供了一种分离的蛋白RNase 9，所述蛋白包含选自以下的氨基酸序列，(a)选自序列表SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列；(b)相对于选自SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有抗菌活性的氨基酸序列；(c)相对于选自SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有抗菌活性的氨基酸序列。
在本发明中，术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
术语“包含”指该蛋白中除了含有所示的氨基酸序列外，还可含有其它对于该蛋白的生物活性或功能没有实质影响的氨基酸残基。如本领域技术人员所周知的，该蛋白还可与其它基因或基因片段形成融合蛋白。适用于本发明的所述其它基因没有特别限制，几乎所有的基因、基因片断或多聚核苷酸都可用于本发明。代表性的例子包括(但并不限于)谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)等。
在较佳的实施方案中，所述蛋白基本上由选自上述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列组成。在更佳的实施方案中，所述蛋白具有选自上述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列。
术语“蛋白(质)”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。本发明所述的RNase 9蛋白包括了具有序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人源RNase 9蛋白，以及具有序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列的猴RNase 9蛋白。然而，本发明定义内还包括与所述RNase 9具有进化相关性的其它物种的RNase 9蛋白。
本发明的蛋白还包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了蛋白的片段或衍生物，条件是该片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。在较佳的实施方案中，所述片段具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
上述变异形式还包括上述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
本发明的蛋白多肽还包括与其相同(同源)或基本上相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。
在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“相同性百分数”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一(或本领域技术人员可获得的其他算法)或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列相同，或具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸。术语“基本上相同”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列具有至少60％、较佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或氨基酸残基相同性。这样的“基本上相同的”序列通常被认为是同源的。为了比较序列和确定同源性，通常将一个序列作为参比序列与测试序列比较。当用序列对比算法时，将测试和参比序列输入计算机内，指定亚序列坐标，如果需要，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。序列比较的最优序列排列对比可采用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)852444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)来进行。
本发明所用的术语“(所希望的)生物活性”指该RNase 9蛋白的抗菌活性。
本发明另一方面还涉及编码本发明上述蛋白的核苷酸序列，以及含有所述核苷酸序列以及任选的与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列的构建物。所述核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。本发明还涉及了上述核苷酸序列或其片段的互补序列，这样的反义序列可用于抑制细胞内RNase 9蛋白的表达。
本发明的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠(overlapping)扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本文所用的术语“可操作连接”是指核苷酸序列与包括指导转录起始、翻译起始、转录终止和翻译终止的调控序列之间的连接。“构建物”是指包含编码本发明的寡肽、短肽、多肽或蛋白的核苷酸序列以及指导其转录起始、翻译起始、转录终止和翻译终止的调控序列的载体或质粒。“载体”指本领域熟知的原核或真核克隆和表达质粒、病毒载体(噬菌体、植物病毒、昆虫病毒、哺乳动物病毒)或其他载体。此外，载体包含一个或多个选择性标记基因，以用于选择转化或转染的宿主细胞的表型，如真核细胞使用的新霉素抗性，大肠杆菌使用的四环素或氨苄青霉素抗性等。
在本发明中，使用本领域的技术人员熟知的方法将包含编码本发明的蛋白的核苷酸序列插入到载体中。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、体内重组技术等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。
上述载体可用于转化或转染适当的原核和真核细胞，以使其能够表达所编码的本发明的蛋白。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如昆虫细胞和哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌、毕赤酵母、果蝇S2或Sf9细胞、哺乳动物CHO、COS、293细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体介导等。
因此，本发明另一方面还提供了含有本发明上述的蛋白、核苷酸序列或构建物的细胞。
本发明的蛋白在细胞内表达。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种方法分离和纯化表达产物。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、声波破菌、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还包括可用作探针和引物的核酸分子，该分子通常具有RNase 9蛋白编码序列中的约8-100个，较佳地约15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码RNase 9蛋白的核酸分子。
本发明还包括对RNase 9蛋白或其片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于RNase 9基因产物或片段。较佳地，指那些能与RNase 9基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制RNase 9蛋白的分子，也包括那些并不影响RNase 9蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的RNase 9基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的RNase 9基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达RNase 9或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
发明人通过研究进一步发现，该蛋白是附睾特异表达的，且在附睾体部表达最高(图1)，且它的表达在附睾尾部受雄激素调控(图2)。发明人在大肠杆菌中表达了猴RNase9蛋白，用其免疫兔子，获得了其多抗血清。发明人用Western blot在附睾体部检测到一条26kd条带(图3)，由于大于预测条带，提示它可能有糖基化存在。经用该抗体做免疫组化试验，发明人发现该蛋白在附睾体部主细胞表达，在附睾尾部部分主细胞表达(图4)。另外，该蛋白还表现出具有很好的抗菌活性，且其可能具有独特的抗菌机制。
因此，本发明还涉及上述蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞在制备抗菌药物中的用途，以及含有所述蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞的药物组合物。该药物组合物将包含治疗有效量的本发明的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞。本文所用的术语“有效量或治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减轻，例如导致体温降低。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
另外，所述蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞还可以与合适的药学上可接受的载体联用。术语“药学上可接受的载体(或赋形剂)”指用于治疗剂(例如多肽、基因或其它治疗剂)给药的载体或赋形剂，其应当与本发明的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或赋形剂或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。另外，在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，通常可将药物组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。本发明的药物组合物可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。为了提高用药效果，本发明的蛋白也可以与其他药物共同使用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1 RNase 9的克隆睾-睾丸差减文库用美国CLONTECH公司的PCR-select cDNA Subtraction kit构建，猴附睾常规cDNA文库用美国Stratagene公司的ZAP cDNA synthesis kit构建。从差减文库测序分析发现ESC-461片段，用该片断去筛选附睾常规cDNA文库，获得了含有1071bp插入的克隆。根据猴序列与人基因组的同源性，设计引物(两个前向引物hF1(5′-GCTCTACCTCTTGGACTT-3′；SEQ ID NO6) 和hF2(5′-GGGTGGCAGAACATTACT-3′；SEQ ID NO7)及一个逆向引物。用Takara公司的反转录酶体系和LA-Taq，用hF1和hR1两个引物将大部分人RNase9(包括编码区)。进一步用3′RACE方法，将人RNase9的3′末端获得。以猴RNase9质粒为模板，用逆向引物5′GCGGCCGC CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GGG CGG TAT GAC AAA GAC3′(SEQID NO8)和前向引物5′GGCC ATG GAT GTG CAG TTT CAA GAG GTG GAT3′(SEQ ID NO9)PCR法扩增出RNase9的成熟蛋白(SEQ ID NO3)的编码序列，将其插入来自美国Novagen公司的pET-28a表达载体，进一步转入BL21-codon plus-RIL表达宿主菌，将该蛋白表达。
实施例2 RNase 9的鉴定各组织RNA根据《分子克隆》用CsCl离心法制备，转膜和杂交根据《分子克隆》进行。雄激素调控实验做法如下三只不同的猴子同时处理，一只猴子做假手术，另两只猴子去除睾丸，其中一只猴子睾丸摘除后立即注射睾酮外源补充雄激素，三只动物六天后取出附睾抽RNA分析。将编码猴Rnase 9从ASN83到C末端的序列用PCR法扩增，插入pET-28a载体中，表达纯化后免疫兔子，获得效价大于10万的多抗血清。将所抽提的猴附睾蛋白通过半干法转到Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用PIERCE公司的化学发光试剂盒检测。用于免疫组化的猴组织用Bouin’s溶液(75ml饱和苦味酸，5ml冰醋酸，25ml 37％甲醛)固定，石蜡包埋，用华美公司的ABC试剂盒DAB显色。
通过Northern blot试验发现，该RNase 9蛋白是附睾特异表达的，且在附睾体部表达最高(图1)，且它的表达在附睾尾部受雄激素调控(图2)。在大肠杆菌中表达了猴RNase9蛋白，用其免疫兔子，获得了其多抗血清。发明人用Western blot在附睾体部检测到一条26kd条带(图3)，由于大于预测条带，提示它可能有糖基化存在。经用该抗体做免疫组化试验，发现该蛋白在附睾体部主细胞表达，在附睾尾部部分主细胞表达(图4)。
实施例3 RNase 9的抗菌活性试验1)声波破菌在含卡那霉素50微克/毫升、氯霉素33微克/毫升的表达培养基LB中，以37℃生长温度、37℃诱导温度以250-300rpm培养实施例1获得的BL21-codon plus-RIL 5小时。4℃下放置10分钟，收集菌体5000克。
将菌体重悬于含溶菌酶0.1mg/ml的裂解缓冲液(50mM Tris HCl pH 8.0、25％蔗糖(W/V)、1mM EDTA)中至至少1ml/g湿菌体，在冰上放置30分钟。反复冻融3次，冰浴，超声破菌。加1体积的洗涤剂缓冲液(0.2M NaCl，1％脱氧胆酸(w/v)，1％NP-40(V/V))至裂解液中，室温混匀1小时，15000g离心10分钟，冷却至4℃，弃上清。然后将沉淀物重悬于Triton X-100/EDTA(1％triton X-100(V/V)，1mM EDTA)，12000g下离心10分钟，冷却至4℃，弃上清。重复上步骤多次直至沉淀上不再有果酱样的沉淀。
沉淀用1M尿素洗3-5次，离心同上，SDS-PAGE电泳检查上清直到没有可溶蛋白存在。沉淀保存-20℃。
2)蛋白复性将包涵体溶于8mM尿素、50mM Tris HCl，pH8.0、2mM EDTANa中，室温振摇2小时。4℃下、12000g离心30分钟。取上清，用bradford法测蛋白浓度。
取适量蛋白质尿素溶液，逐滴加入复性液(10mM trisHCl，0.5M Arg·HCl，2.5mM还原谷胱甘肽，0.6mM氧化谷胱甘肽，0.05mM EDTA，pH8.0)，磁力搅拌子轻搅。蛋白终浓度控制小于50ug/ml，4℃静置24-48小时。
3)蛋白浓缩和过柱纯化复性后的蛋白溶液12000g 30分钟，4℃离心，上清对双蒸水连续透析两次，体积比1∶100，4℃下放置24小时。透析后的蛋白溶液-70℃冷冻，真空干燥。
冻干的蛋白重溶于适量的磷酸缓冲液，12000g离心15分钟。离心上清过G-25或G-50脱去盐和小分子，层析柱用pH 7.4的磷酸缓冲液平衡，用磷酸缓冲液过柱，用Bradford法测蛋白浓度，用SDS-PAGE检查。
4)抗菌活性检测将大肠杆菌K12D31在LB培养基中37℃ 250rpm培养至对数期，菌液4℃ 5000g离心10分钟。去上清，菌体重悬于冰冷的10mM磷酸缓冲液。菌液4℃ 5000g离心10分钟，去上清，菌体重悬于冰冷的10mM磷酸缓冲液。
测OD600nm，根据公式计算CFUS/ML＝OD600nm×2.5×108以磷酸缓冲液稀释菌液至5～8×105cfus/ml，100ul菌液加等体积适当浓度的RNASE9溶液混匀，37℃培养2-3小时。混匀，以磷酸缓冲液作系列10倍梯度稀释，各梯度取100ul菌液涂LB平板，37℃培养过夜。取50-400克隆之间的平板计数，根据稀释度计算菌落数。结果显示在下表1中(以100ul磷酸缓冲液作为对照，各样品的菌落数与对照的菌落数之比为存活率)。
表130ug/ml50ug/ml 100ug/ml 150ug/ml200ug/ml101.0％69.7％ 26.0％1.50％ 0.
82.4％ 92.4％ 43.1％1.05％ 0.
87.9％ 79.9％ 67.0％5.59％ 0.
根据上表可以看出，本发明的RNase 9蛋白具有抗菌活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>RNase 9蛋白及其编码序列和用途<130>058371Z1<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>205<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Met Arg Thr Leu Ile Thr Thr His Pro Leu Pro Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Pro Gln Gln Leu Leu Gln Leu Val Gln Phe Gln Glu Val Asp Thr Asp20 25 30Phe Asp Phe Pro Glu Glu Asp Lys Lys Glu Glu Phe Glu Glu Cys Leu35 40 45Glu Lys Phe Phe Ser Thr Gly Pro Ala Arg Pro Pro Thr Lys Glu Lys50 55 60Val Lys Arg Arg Val Leu Ile Glu Pro Gly Met Pro Leu Asn His Ile65 70 75 80Glu Tyr Cys Asn His Glu Ile Met Gly Lys Asn Val Tyr Tyr Lys His85 90 95Arg Trp Val Ala Glu His Tyr Phe Leu Leu Met Gln Tyr Asp Glu Leu100 105 110Gln Lys Ile Cys Tyr Asn Arg Phe Val Pro Cys Lys Asn Gly Ile Arg115 120 125Lys Cys Asn Arg Ser Lys Gly Leu Val Glu Gly Val Tyr Cys Asn Leu130 135 140Thr Glu Ala Phe Glu Ile Pro Ala Cys Lys Tyr Glu Ser Leu Tyr Arg145 150 155 160Lys Gly Tyr Val Leu Ile Thr Cys Ser Trp Gln Asn Glu Met Gln Lys165 170 175
Arg Ile Pro His Thr Ile Asn Asp Leu Val Glu Pro Pro Glu His Arg180 185 190Ser Phe Leu Ser Glu Asp Gly Val Phe Val Ile Ser Pro195 200 205<210>2<211>204<212>PRT<213>恒河猴(Rhesus)<400>2Met Met Arg Thr Pro Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Gln Gln Leu Leu Gln Pro Val Gln Phe Gln Glu Val Asp Thr Gly20 25 30Phe Asp Ser Pro Asp Asp Asp Met Glu Glu Phe Glu Glu Tyr Leu Glu35 40 45Glu Phe His Arg Thr Gly Pro Thr Arg Pro Pro Thr Lys Glu Asn Val50 55 60Lys Arg Arg Val Ile Ile Glu Pro Gly Met Pro Leu Tyr Asp Arg Glu65 70 75 80Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Met Arg Lys Asn Val Tyr His Lys Gln Arg85 90 95Cys Val Thr Glu His Tyr Phe Leu Leu Met Gln Tyr Asp Glu Leu Glu100 105 110Lys Ile Cys Tyr Asn Arg Ile Val Pro Cys Lys Asn Gly Val Arg Lys115 120 125Cys Asn Arg Ser Lys Gly Leu Val Glu Gly Val Tyr Cys Asn Leu Thr130 135 140Glu Ala Tyr Glu Ile Pro Trp Cys Arg Tyr Lys Ser Phe Tyr Arg Arg145 150 155 160Gly Tyr Val Leu Ile Thr Cys Ala Trp Gln Asn Glu Ile His Lys Leu165 170 175Ile Pro His Thr Ile Asn Asp Leu Val Glu Pro Pro Lys His Arg Ser180 185 190Phe Leu Asn Glu Asp Gly Val Phe Val Ile Pro Pro195 200
<210>3<211>181<212>PRT<213>恒河猴(Rhesus)<400>3Val Gln Phe Gln Glu Val Asp Thr Asp Phe Asp Ser Pro Asp Asp Asp1 5 10 15Met Glu Glu Phe Glu Glu Tyr Leu Glu Glu Phe His Arg Thr Gly Pro20 25 30Thr Arg Pro Pro Thr Lys Glu Asn Val Lys Arg Arg Val Ile Ile Glu35 40 45Pro Gly Met Pro Leu Tyr Asp Arg Glu Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Met50 55 60Arg Lys Asn Val Tyr His Lys Gln Arg Cys Val Thr Glu His Tyr Phe65 70 75 80Leu Leu Met Gln Tyr Asp Glu Leu Glu Lys Ile Cys Tyr Asn Arg Phe85 90 95Val Pro Cys Lys Asn Gly Val Arg Lys Cys Asn Arg Ser Lys Gly Leu100 105 110Val Glu Gly Val Tyr Cys Asn Leu Thr Glu Ala Tyr Glu Ile Pro Trp115 120 125Cys Arg Tyr Lys Ser Phe Tyr Arg Arg Gly Tyr Val Leu Ile Thr Cys130 135 140Ala Trp Gln Asn Glu Ile His Lys Leu Ile Pro His Thr Ile Asn Asp145 150 155 160Leu Val Glu Pro Pro Lys His Arg Ser Phe Leu Asn Glu Asp Gly Val165 170 175Phe Val Ile Pro Pro180<210>4<211>1068<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4gctctacctc ttggacttcc aacttctgtg agtcaacata gtgcctcttg catttaagtg 60tctgcaggaa aaatgatgag aactctcatc accacacacc cactgcccct gcttctattg120
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<221>misc_feature<223>引物<400>9gcggccgcct agtgatggtg atggtgatgg ggcggtatga caaagac 4权利要求
1.一种分离的蛋白RNase 9，其特征在于，所述蛋白包含选自以下的氨基酸序列，(a)选自序列表SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列；(b)相对于选自SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有抗菌活性的氨基酸序列；(c)相对于选自SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有抗菌活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
3.一种分离的核苷酸序列或其互补序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码权利要求1所述的蛋白。
4.根据权利要求3所述的分离的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列具有选自SEQ ID NO4或5的核苷酸序列。
5.一种构建物，其特征在于，所述构建物含有权利要求3所述的核苷酸序列。
6.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的核苷酸序列或权利要求5所述的构建物。
7.一种制备权利要求1所述的蛋白的方法，其特征在于，该方法包括(a)在适合权利要求1所述的蛋白表达的条件下，培养权利要求6所述的细胞；(b)分离出权利要求1所述的蛋白。
8.一种抗体，其特征在于，它与权利要求1所述的蛋白特异性结合。
9.权利要求1所述的分离的蛋白、权利要求3所述的分离的核苷酸序列、权利要求5所述的构建物或权利要求6所述的细胞在制备抗菌药物中的用途。
10.一种抗菌药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的分离的蛋白、权利要求3所述的分离的核苷酸序列、权利要求5所述的构建物或权利要求6所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及了一种蛋白RNase 9，所述蛋白包含选自SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列，本发明还涉及所述蛋白的核苷酸序列、构建物、制备方法、组合物和应用。所述蛋白具有抗菌活性，能够用于治疗感染，尤其是泌尿生殖感染。
文档编号C12N15/12GK101016333SQ200610023799
公开日2007年8月15日 申请日期2006年2月9日 优先权日2006年2月9日
发明者张永莲, 刁华, 刘强 申请人:中国科学院上海生命科学研究院