专利名称：猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法，通过这种方法构建了两个新的猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的单体型，利用其与猪肉肉质性状显著相关的特性，可为猪的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。属于家畜分子生物学技术领域。
背景技术：
随着生活水平提高，人们对食物有了更高的要求。猪肉作为人膳食中重要的组成部分，是人们近年来改善的重点。既瘦又嫩，多汁味美的猪肉在市场上颇受消费者青睐。另一方面，随着养猪业对提高肉猪生长速率和饲料效率的遗传选育，使得肉猪生产水平得到了提高，但同时，猪肉品质变得粗老，适口性差，降低了消费者对肉质的满意度。猪肉品质成了当今世界养猪界专家共同关心研究的一项重大课题。
钙蛋白酶抑制蛋白基因(CAST)是影响猪肉嫩度的一个重要的候选基因，许多科研工作者都试图在钙蛋白酶抑制蛋白基因中寻找影响猪肉嫩度的SNP标记(单核苷酸多态性)位点。经文献检索和专利检索发现，Ernst(1998)等将钙蛋白酶抑制蛋白基因定位于2q2.1-2.4，并发现了3个在非编码区上的PCR-RFLP多态性位点(HinfI，MspI，RsaI)。孙立彬(2005)等也发现了2个在非编码区上的PCR-RFLP多态性位点(HinfI，TaqI)。Rothschild(2003)等在钙蛋白酶抑制蛋白基因发现了影响猪肉质性状的单体型，并申请了美国专利(WO 03/060151)。
SNP标记是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称为单体型(haplotype)。在家畜分子生物学技术领域，单体型主要作为一种标记辅助技术应用于家畜的筛选，从而指导家畜的选种和选配。
关于猪的SNP标记单体型的研究进展十分迅速，与此同时有关猪SNP标记单体型的专利争夺正逐步展开。鉴于猪SNP标记单体型数目多，还有大量未被发现，且它们有重要的理论和应用价值，因此在我国开展猪的SNP标记单体型的分析、鉴定和应用研究，开发具有我国知识产权的SNP标记单体型显得十分迫切和必要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足和实际需求，提出一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法，并通过此方法寻找新的与猪肉肉质性状显著相关的单体型，可以用于猪只的辅助选种和选配，从而降低饲养成本。
为实现这一目的，本发明提出的方法包括，提取猪的基因组DNA，钙蛋白酶抑制蛋白基因的PCR(聚合酶链式反应)扩增，扩增产物的多态性检测，单体型的构建及其与猪肉肉质性状的相关性分析，分离鉴定出两个新的猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的单体型H2121和H1211。本发明利用钙蛋白酶抑制蛋白基因的单体型与猪肉肉质性状显著相关的特性，为猪的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。
本发明提供的猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法包括如下步骤(1)采集猪耳组织，利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成100ng/μL备用。
(2)针对钙蛋白酶抑制蛋白基因的单核苷酸多态性位点200A/G、1187C/T，设计钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物1；其中，核苷酸编号基于GenBank索引号AY594692。所述的基因特异性引物具有5`-AAAGCCTACCCACGCACT-3`和5-GCAGATACACCAGTAACAGA AA-3`的序列。所述的扩增产物1长度为100～3000bp，且含有AY594692的200位和1187位。
(3)针对钙蛋白酶抑制蛋白基因的单核苷酸多态性位点998A/G、1189C/T，设计钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物2；其中，核苷酸编号基于GenBank索引号AY522920。所述的基因特异性引物具有5`-AGTGATGACAAAAAACTTGAC-3`和5`-CTCATCCTTATCCAAGAGATTC-3`的序列。所述的扩增产物2长度为100～3000bp，且含有AY522920的998位和1189位。
(4)检测扩增产物1的200位和1187位和扩增产物2的998位和1189位的多态性。
本发明可以利用聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合(PCR-RFLP)来检测扩增产物多态性。即在设计PCR扩增实验时，引物位于基因突变部位的两侧，先将目的基因扩增，使其易于检测，若突变引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶酶切扩增产物，再进行凝胶电泳观察，根据产物片段大小或数量与正常对照做出判断。若突变未能引起限制性内切酶位点改变，则通过碱基错配引入一个已知限制性内切酶位点，使得突变引起该限制性内切酶位点发生改变。并通过对纯合型的酶切位点进行DNA测序，对本发明中钙蛋白酶抑制蛋白基因的单核苷酸多态性位点的碱基序列分别为200A/G、1187C/T和998A/G、1189C/T。
(5)构建单体型，针对扩增产物的多态性用统计分析的方法共分离鉴定出4种单体型H1211，H2121，H2122，H2221。对于本领域普通技术人员来说，单体型的构建方法可以根据需要而改变只要适合检测本发明的单体型即可。
(6)通过本领域熟知的偏回归分析方法，作单体型的相关性分析，确定与肉质量性状相关的单体型，其中，单体型H2121与肌肉嫩度(meat tenderness，MT)显著正相关，单体型H1211与肌内脂肪含量(intramuscular fat，IMF)显著正相关。其中携带有上述单体型H2121的个体和单体型H1211个体的猪肉肉质性状显著优于含有其它单体型的个体。
其中所述的单体型H2121即在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为G、C、G、C。其中所述的单体型H1211即在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为A、T、A、C。
本发明的积极效果(1)发明一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法，并利用此方法在钙蛋白酶抑制蛋白基因中分离鉴定出两个单体型H2121和H1211，经文献检索和专利检索，证明为新的单体型。
(2)经将上述的单体型与PIC猪群125头非相关个体的猪肉肉质性状进行相关性分析，新分离鉴定出的两个单体型H2121和H1211与猪肉肉质性状显著相关，可以用于猪只的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。
具体实施例方式
本发明针对PIC猪群进行了深入的研究。针对钙蛋白酶抑制蛋白基因四个SNP位点组成的单体型进行分析，其中统计分析结果显示，在钙蛋白酶抑制蛋白基因的单体型H2121与反映肉质性状猪肉嫩度显著正相关(p＝0.0056)，单体型H1211与反映肉质性状的肌内脂肪含量显著正相关(p＝0.0075)。因此这两个单体型可作为检测猪肉肉质性状的特异性单体型，用于猪的标记辅助选种和选配。在此基础上完成了本发明。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例(1)采集猪耳组织，利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成100ng/μL备用。其中实验猪共125头，为PIC五系杂交商品猪，由上海农工商肉食品公司提供和饲养。在平均体重达90千克时集中屠宰。
(2)针对钙蛋白酶抑制蛋白基因的单核苷酸多态性位点200A/G、1187C/T，设计钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，进行PCR反应，其中，核苷酸编号基于GenBank索引号AY594692。引物参考猪的钙蛋白酶抑制蛋白基因蛋白编码序列(GenBank Acc №M20160)，利用Primer Premier 5.0软件自行设计引物。引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成。所述的基因特异性引物为5`-AAAGCCTACCCACGCACT-3`和5-GCAGATACACCAGTAACAGAAA-3`。PCR扩增体系的总体积均为25μL，其中基因组DNA20～40ng，10×PCR缓冲液2.5μL(2.5mmol/L)，dNTP混合液2.0μL，rTaq 1U，0.2μmol/L引物。引物1反应程序为95℃预变性5min，95℃1min，62.5℃1min，72℃1min 50s，35个循环；72℃延伸10min。得到扩增产物1为1459bp。
(3)针对钙蛋白酶抑制蛋白基因的单核苷酸多态性位点998A/G、1189C/T，设计钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，进行PCR反应，其中，核苷酸编号基于GenBank索引号AY522920。引物参考猪的钙蛋白酶抑制蛋白基因蛋白编码序列(GenBank Acc №M20160)，利用Primer Premier 5.0软件自行设计引物。引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成。所述的基因特异性引物为5`-AGTGATGACAAAAAACTTGAC-3和5`-CTCATCCTTATCCAAGAGATTC-3`。PCR扩增体系的总体积均为25μL，其中基因组DNA20～40ng，10×PCR缓冲液2.5μL(2.5mmol/L)，dNTP混合液2.0μL，rTaq 1U，0.2μmol/L引物。引物1反应程序为95℃预变性5min，95℃1min，58.5℃1min，72℃1min 50s，35个循环；72℃延伸10min。得到扩增产物2为1991bp。
(4)检测扩增产物1的200位和1187位和扩增产物2的998位和1189位的多态性。
酶切反应体系20μL，在5μL扩增产物1中加入4U的限制性内切酶HinfI(华美生物公司)，37℃水浴4h。3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统(上海天能)观察并记录。
酶切反应体系20μL，在5μL扩增产物1产物中加入4U的限制性内切酶MspI(华美生物公司)，37℃水浴4h。3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统观察并记录。
酶切反应体系20μL，在5μL扩增产物2中加入4U的限制性内切酶HinfI(华美生物公司)，37℃水浴4h。3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统(上海天能)观察并记录。
酶切反应体系20μL，在5μL扩增产物2中加入1μL的限制性内切酶TaqI(TaKaRa)，65℃水浴1h。2.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统观察并记录。
对于有多态性的片段，分别选取和纯合基因型片段对应的实验猪各2头。对钙蛋白酶抑制蛋白基因的扩增产物1和扩增产物2进行克隆回收并送交上海华诺生物技术公司测序。测序结果显示，酶切突变位点均在内含子内。
扩增产物1，PCR-RFLP/HinfI两种纯合基因型的序列比较，在第200bp的位置(Acc.No.AY594692)发生突变，由A→G，导致HinfI酶切位点的消失；引物1PCR-RFLP/MspI两种纯合基因型的序列比较，在第1187bp的位置(Acc.No.AY594692)发生突变，由C→T，导致MspI酶切位点的消失。
扩增产物2，PCR-RFLP/HinfI两种纯合基因型的序列比较，在第998bp的位置(Acc.No.AY522920)发生突变，由A→G，导致HinfI酶切位点的消失；引物2PCR-RFLP/TaqI两种纯合基因型的序列比较在第1189bp的位置(Acc.No.AY522920)发生突变，由C→T，导致TaqI酶切位点的消失。
(5)单体型的构建，用本领域所熟知的PL-EM version 1.0(http//www.people.fas.harvard.edu)构建单体型。共分离鉴定出4种单体型H1211，H2121，H2122，H2221。在4-SNP-haplotype中的每一个位置的核苷酸用数字1和2来代表。例如一个动物带有单体型H1211即在GenBank索引号AY59469的200A/G位为A，1187位为C/T为T。在GenBank索引号AY522920的998A/G位为A，1189位C/T为C。
本领域普通技术人员已知，上述单体型的构建方法可以根据需要而改变只要适合检测本发明的单体型即可。
(6)单体型的相关性分析确定与肉质性状相关的单体型。测定肉质性状指标主要包括5个①宰后24h pH值(pH24)、②滴水损失(drip loss，DL)、③嫩度(meat tenderness，MT)、④肌内脂肪含量(intramuscular fat，IMF)、⑤背膘(backfat，BF)。为使胴体尽量少受破坏，肉样采集位置为个体的最后肋骨和最后腰椎间单侧背最长肌(带有皮和背膘)，采集量为800g/个体左右。各指标的测定根据陈润生(2002)所述方法进行。
根据每个个体所构建的单体型，用本领域所熟悉的偏回归分析方法进行分析。
y＝1μ+X1H1+X2H2+X3H3+X4H4+X5S+e模型中，y为个体测定肉质性状指标表型记录向量，μ为总体均数，S为性别效应向量；B为群体效应向量；M为基因型效应向量；e为随机误差向量，相互独立且服从于N(0，σ2)；1、X1、X2、X3、X4、X5为设计矩阵；其中X1、X2、X3、X4当有0，1，2个拷贝时值为-1，0，+1。统计分析采用SAS(8.02)软件进行分析。
结果CAST基因单体型对宰后24h pH值(pH24)、滴水损失(drip loss，DL)、背膘(backfat，BF)后没有显著效应。单体型H2121与肌肉嫩度(meat tenderness，MT)显著正相关(表2)，单体型H1211与肌内脂肪含量(intramuscular fat，IMF)显著正相关(表3)。
其中所述的单体型H2121即在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为G、C、G、C。其中所述的单体型H1211即在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为A、T、A、C。
表2CAST基因单体型与肌肉嫩度的偏回归分析
表3CAST基因单体型与肌内脂肪含量的偏回归分析
根据上述研究，发明了一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法，并通过这种方法构建了两个新的猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的单体型这一发明在猪种选育和品种改良上具有潜在的应用价值。通过对钙蛋白酶抑制蛋白基因四个位点进行基因型定型，若发现某个个体携带H2121或H1211单体型，则该个体与携带其它单体型的个体相比期望有更优的肉质性状。剧此，育种工作者可以指导猪只的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。可见，钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型在猪的标记辅助选种和选配中有重要的应用前景。
权利要求
1.一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法，其特征在于包括如下步骤1)采集猪耳组织，利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA；2)针对钙蛋白酶抑制蛋白基因的单核苷酸多态性位点200A/G、1187C/T，设计钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物1；其中，核苷酸编号基于GenBank索引号AY594692，所述的基因特异性引物具有5`-AAAGCCTACCCACGCACT-3`和5-GCAGATACACCAGTAACAGAAA-3`的序列，所述的扩增产物1长度为100～3000bp，且含有AY594692的200位和1187位；3)针对钙蛋白酶抑制蛋白基因的单核苷酸多态性位点998A/G、1189C/T，设计钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，进行PCR反应，得到扩增产物2；其中，核苷酸编号基于GenBank索引号AY522920，所述的基因特异性引物具有5`-AGTGATGACAAAAAACTTGAC-3`和5`-CTCATCCTTATCCAAGAGATTC-3`的序列，所述的扩增产物2长度为100～3000bp，且含有AY522920的998位和1189位；4)检测扩增产物1的200位和1187位和扩增产物2的998位和1189位的多态性；5)构建单体型，针对扩增产物的多态性用统计分析的方法共分离鉴定出4种单体型H1211，H2121，H2122，H2221；6)通过偏回归分析方法确定与肉质量性状相关的单体型，其中，单体型H2121与肌肉嫩度显著正相关，单体型H1211与肌内脂肪含量显著正相关，携带有上述单体型H2121的个体和单体型H1211个体的猪肉肉质性状显著优于含有其它单体型的个体；其中所述的单体型H2121在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为G、C、G、C；所述的单体型H1211即在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为A、T、A、C。
2.一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型H2121，其特征在于该单体型在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为G、C、G、C。
3.一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型H1211，其特征在于该单体型在GenBank索引号AY59469的200A/G、1187C/T和GenBank索引号AY522920的998A/G、1189C/T位点的单核苷酸分别为A、T、A、C。
4.一种权利要求2或3的猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的应用，其特征在于应用于猪的标记辅助选种和选配。
全文摘要
本发明涉及一种猪钙蛋白酶抑制蛋白基因单体型的分离鉴定方法，属于家畜分子生物学技术领域。其步骤包括，提取猪的基因组DNA，钙蛋白酶抑制蛋白基因的PCR扩增，扩增产物的多态性检测，单体型的构建及其与猪肉肉质性状的相关性分析。本发明的特征是分离鉴定出两个新的猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的单体型H2121和H1211。本发明利用钙蛋白酶抑制蛋白基因的单体型与猪肉肉质性状显著相关的特性，为猪的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。
文档编号C12N15/10GK1904065SQ20061002888
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月13日 优先权日2006年7月13日
发明者潘玉春, 王起山, 孙立彬, 李婧, 白春艳 申请人:上海交通大学