专利名称：：一种细胞核移植方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，具体地说，是关于一种细胞核移植方法。技术背景体细胞核移植(somaticcellnucleartransfer,SCNT)技术已广泛用于克隆动物和转基因动物的生产，多种不同物种的克隆动物相继问世(ChesneP.,AdenotPG.，VigliettaC.,"dNatBiotechnol.2002，20:366-369;WoodsGL.，WhiteKL,Vande歷llDK.,"a/.Science2003,301:1063)。与常规的转基因动物制备方法相比，克隆技术具有独特的优势，这是由于克隆技术将筛选工作提前到了细胞水平，从而大大缩短了优种动物繁殖周期。目前，效率低下是限制该技术的瓶颈。线粒体(mitochondrion,mt)不仅是细胞浆中含量最多的细胞器，更重要的是由于线粒体的高突变率，引起不同种群间及同一种群不同个体间线粒体DNA(mtDNA)序列的差异，表现出不同的单倍型，这种差异可引起生物性状的不同，例如在奶牛中可引起产奶量及生育能力的差异(TamassiaM.,HeymanY.，LavergneY.，etal.Reproduction2003，126:629-637;Sutrno,CumminsJM.，GreeffJ.，etal.Theriogenology2002,57:1603-1610;MannenH.，KojimaT.，OyamaK.，etal.J.Anim.Sci.1998,76:36-41)。最近几年，动物繁殖领域中卵母细胞线粒体单倍型日益成为研究热点。传统的单倍型概念是指使用特定限制性内切酶酶切特定片段后产生的特定酶切片段格局。来自体外胚胎生产(IVP)和体细胞核移植的研究均说明体外胚胎的发育明显受母本mtDNA单倍型影响，并且伴有卵母细胞ATP及mtDNA拷贝数的差异(TamassiaM.,NuttinckF.，ReynierP.，etal.Biol.Reprod.2004,71:697-704;BruggerhoffK.,ZakhartchenkoV"WenigerkindH.，etal.Biol.R印rod.2002,66:367-373;HiendlederS.,PrelleK.，BruggerhoffK.，etal.Biol.Reprod.2004，70:1196-1205)。本申请人在其申请号为200410016219.7的中国发明专利申请中公开了一种同体细胞核移植方法，该方法是取同一个体的供核体细胞与去核卵母细胞进行细胞核移植，结果显示克隆囊胚在数量和质量上均有显著提高。发明人由此联想到，目前由常规核移植方法(异体核移植)得到的胚胎，由于含有不同的受体和供体mtDNA单倍型，这些单倍型可能影响重构胚的发育能力。发明人在前期的研究中发现，某些类型的卵母细胞有利于克隆胚胎的发育，可能与胞质中某些mtDNA单倍型更适合胚胎发育有关，其中核编码因子与某些mtDNA单倍型相兼容可能发挥了重要作用，从而有利于特定线粒体类型的克隆胚胎的成活。
发明内容为了验证上述推测，发明人通过PCR-RFLP技术对实验动物的线粒体DNA进行单倍型分析，将不同实验动物的线粒体DNA单倍型分为4种类型，然后利用单倍型相同的供核体细胞和受体卵母细胞进行核移植，结果发现采用单倍型相同的细胞核移植能够有效提高重构胚的发育能力。因此，本发明的目的就在于提供一种细胞核移植方法，该方法选取线粒体DNA单倍型相同的非人哺乳动物的供核体细胞和受体卵母细胞进行核移植。具体地，本发明的细胞核移植方法包括以下步骤a、选取某一线粒体DNA单倍型的非人哺乳动物，以其成皮肤成纤维细胞或卵丘细胞作为供核体细胞；b、选取线粒体DNA单倍型相同的同一种哺乳动物，以其卵母细胞作为受体细胞；c、受体卵母细胞去核；d、将供核体细胞的细胞核移入去核卵母细胞的细胞质中，使细胞核融入卵母细胞，形成重构胚。本发明的同型(线粒体DNA单倍型相同)细胞核移植方法能够有效提高重构胚的融合率、卵裂率以及囊胚率，相比异型(线粒体DNA单倍型不同)核移植，囊胚率提高了约1.5倍。细胞核和细胞质的相互作用和协调是发挥生物功能的基础，在长期的进化过程中，不同的核背景形成了与之相适应的特定单倍型的线粒体DNA。因此，利用具有相同单倍型的供核细胞和卵母细胞可有效解决核移植技术中核质间的不兼容，从而提高核移植效率。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。PCR-RFLP(polymerasechainreaction—restrictionfragmentlengthpolymorphism)是指采用PCR技术扩增目的DNA片段，然后将待检测的片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，之后将酶切后的产物进行电泳，根据DNA片段的大小来比对不同来源基因序列的差异性。本发明就是利用PCR-RFLP技术，扩增不同牛的线粒体DNA，然后进行RFLP分析，选出具有长度差异的片段，根据酶切图谱将其分为A、B、C、D四种类型。然后选择线粒体DNA单倍型相同的细胞进行核移植，结果发现细胞的融合率、卵裂率以及囊胚率都得到了显著提高。实施例l、全长线粒体DNA的扩增分别抽取不同青年牛外周血标本，肝素抗凝，酚-氯仿分离抽提DNA，以抽提的DNA为模板，分别以下列H1、H2、H3、H4四个片段为引物，扩增不同牛的线粒体DNA:HI:S:5'-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3';A:5'-GTGTAGATGCTTGCATGTAAGT-3，；H2:S:5，-TTATCCGTTGGTCTTAGGAA-3，；A:5'GCGGCATGGTAATTAAGCTC-3';H3:S:5'-TTATCACAATCCAGAACTGAC-3，；A:5，-CTAGTGAGAGTGAGGAGATATG-3，；H4:S:5'-TGTGCATGTGACACGTATCC-3';A:5，-AAGCGATTGCTTACTAGTCGG-3,;具体扩增条件如下HI:94°C预变性5min,进入循环；循环条件为94°C30s，58。C30s,72°Clmin，35个循环；最后72'C延伸10min。H2:94。C预变性5min,进入循环；循环条件为94。Clmin，56。Clmin，72°C4min，35个循环；最后72。C延伸10min。H3:94°C预变性5min，进入循环；循环条件为94°Clmin，56°Clmin，72°C4min，35个循环；最后72i:延伸10min。H4:94°C预变性5min，进入循环；循环条件为94°Clmin，56。Clmin，72°C5min,35个循环；最后72。C延伸10min。扩增完成后均进行2%琼脂糖凝胶电泳，以检测PCR产物，确保与预期一致。获得的PCR扩增产物按PCR产物纯化试剂盒(Takara)产品说明书(产品号DV807A)进行纯化。纯化的扩增产物分别以限制性内切酶进行酶切，具体如下:HI纯化片段5piHI纯化片段5piNEBbuffer42^1NEBbuffed2^BSA0.2^0.2^編II(a、b)0.2piH2012.8piH2012.6pi20^20H2纯化片段5^1H2纯化片段5piNEBbuffed2^110XM2pi争II0.2nlI0.2^H2012.8^H2Q12.8^20^20nlH3纯化片段5^10XM2plJv"II0.2piH2012.8pi20^H3纯化片段5^10XK2pl肠/fI0.2piH2012.8^20jilH4纯化片段5pl10XH2|iil0.2^1H20_12.8^20nl其中Aw7/Zl于3(TC酶切过夜，其余均在37'C酶切过夜。将酶切产物电泳(0.82%琼脂糖，120V，lh)以作进一步分析.实施例2、酶切片段的分析及线粒体DNA分类将各种酶RFLP分析中具有长度差异的片段进行汇总，结果见以下表1,表1、内切酶RFLP分析具有长度差异的片段汇总<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注+有相应酶酶切位点或具有此酶额外酶切位点;-无相应酶酶切位点或无此酶额外酶切位点。分析酶切片段的差异，根据不同的个体来源，将不同牛的线粒体单倍型分为A、B、C、D四种类型，四种类型的酶切图谱如表2所示表2、线粒体单倍型酶切图谱<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3、受体卵母细胞的准备对单倍型A型青年牛进行活体取卵，具体方法见申请号为200510023510.1的中国发明专利申请。将收集液倒入拣卵杯中，用无钙镁杜氏磷酸缓冲液(DPBS，l升去离子水中含8gNaCl，0.2gKC1,1.44gNa2HP04,0.24gKH2P04，30gBSA和2000u肝素)冲洗，拣出卵母细胞复合体(cumulusoocytecomplexes,COCs)移入培养皿，在体视显微镜下对COCs进行分级，选择胞质均匀，周围卵丘细胞排列紧密，包绕三层以上的卵母细胞，放入成熟液(TCM-199(Gibco,GrandIsland,NY)外加10%胎牛血清(FBS)、lOpg/ml促黄体生成激素、l(ag/ml雌二醇和lpg/ml促卵泡生成素)中培养1530h。实施例4、供核体细胞的准备分别取经以上线粒体DNA单倍型分类的青年牛成纤维细胞或卵丘细胞，用含10%FBS的DMEM/F12(Gibco公司，产品号分别为11039-021)进行培养。1、细胞原代培养①成纤维细胞的原代培养取新生牛耳组织，置于含双抗(2%青链霉素)的0.9%生理盐水中，耳组织经碘酊和75%酒精浸泡消毒后，无菌生理盐水洗35遍，剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，37'C消化2h，加入含10%FBS的DMEM/F12培养基，37°C、5%C02、饱和湿度培养箱中原代培养，倒置显微镜下观察细胞贴壁后更换培养基继续培养。②卵丘细胞的原代培养将成熟20h小时的COCs(见实施例3)放入含0.5%透明质酸酶的无钙镁的DPBS中，消化l2min，同时用吸胚管反复吹吸，脱去外层疏松、扩展的卵丘细胞。收集这部分的卵丘细胞，尽快移入无钙镁的DPBS中，1200rpm离心5min，弃上清；加入100^10.25%胰酶吹打lmin,加入DMEM/F12+10%FBS(1体积FBS+9体积DMEM/F12培养液)终止消化，1000rpm离心5min，DMEM/F12培养液洗涤2次。用DMEM/F12+10XFBS悬浮细胞，轻轻吹打，使细胞充分吹散，接种至25cm4音养瓶(接种密度约为1X105，内含DMEM/F12+10XFBS培养液5ml)，于38.5。C，5%C02，饱和湿度的培养箱中培养。2、约35天生长汇合后，进行传代。3、取培养15代的细胞用作核移植的供核细胞。细胞生长至瓶底8090%时，将培养液换成含0.5%FBS的培养液血清饥饿23天，诱导细胞进入G0/G1期。核移植前，用0.25%胰酶消化贴壁细胞，将消化下来的细胞DMEM/F12培养液洗涤2遍后，加入适量的M199(Gibco公司，产品号12340-030)+10%FBS反复吹打成单个细胞的悬液，保存于恒温箱中待用。实施例5、细胞核移植用内径约20微米的去核针将受体卵母细胞的第一极体及其附近区域的卵核去除，然后将不同线粒体DNA单倍型的供体细胞核注入去核卵母细胞卵周隙，以2.5KV/cm—3V/cm和6—l(His的融合参数，将供核细胞核融入卵母细胞，获得克隆重构胚。融合操作后的卵移入M199中洗3遍，置于覆盖石蜡油的M199培养微滴中，于5%C02、38.5°C，饱和湿度的培养箱中培养。3060min后，在体视显微镜下检査融合情况，计算融合率，结果如表3所示。重构胚放入B2+Vero的共培养体系(分别购自法国农科院和中科院细胞所，货号分别为220015和GDC029)中，在5%C02、38.5。C，饱和湿度的培养箱中培养。每隔48h半量更换培养液。48h观察重构胚的卵裂情况，计算卵裂率，培养第7天记录囊胚的数量，计算囊胚率，结果如表3所示。表3、核质间不同单倍型组合与核移植效率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注融合率=重构胚融合数/卵母细胞总数卵裂率=培养48小时重构胚分裂数/重构胚融合数囊胚率=培养7天所得囊胚数/卵裂数根据表3的结果，分别统计相同线粒体DNA单倍型(同型)之间的核移植效率以及不同线粒体DNA单倍型之间(异型)的核移植效率，结果如表4所示。表4、不同类型核移植效率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从以上表3的数据可以看出，不同组合方式的融合率基本一致，均在35%上下，而卵裂率则以线粒体DNA单倍型A—A组合为最高，达到了82.7。％，而A—C组合效率最低，仅为70.5%;在囊胚率方面，相同单倍型之间的组合(A—A和C一C组合)效果最佳，均达到了20%以上，明显优于不同单倍型之间的组合。从表4综合比较的结果也可以非常清楚地看到，与异型核移植相比，同型核移植在融合率和卵裂率方面都明显占优，而囊胚率的优势更加突出，约为异型核移植的1.5倍。综上所述，采用线粒体DNA单倍型相同的细胞核和卵母细胞细胞质进行核移植，可以有效提高体细胞核移植的效率。采用本发明的方法可以克服现有技术中由于卵母细胞来源不清所导致的细胞核移植效率低下的问题。虽然以上仅以牛为例对本发明的方法进行了验证，但是本领域的技术人员根据说明书的内容，显然可以看出本发明的方法同样适用于其它非人哺乳动物，例如猪、羊以及老鼠等，因此，针对这些非人哺乳动物的同型核移植方法同样应当属于本发明的范围。权利要求1、一种细胞核移植方法，其特征在于，该方法是以线粒体单倍型相同的非人哺乳动物的供核体细胞和受体卵母细胞进行核移植。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，包括以下步骤-a、选取某一线粒体DNA单倍型的非人哺乳动物，以其成皮肤成纤维细胞或卵丘细胞作为供核体细胞；b、选取相同线粒体DNA单倍型的同一种哺乳动物，以其卵母细胞作为受体细胞；c、受体卵母细胞去核；d、将供核体细胞的细胞核移入去核卵母细胞的细胞质中，使细胞核融入卵母细胞，形成重构胚。3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，作为供核体细胞的成纤维细胞或卵丘细胞是经过加10%胎牛血清的DMEM/F12培养l一5代，并0.5%胎牛血清饥饿2—3天的细胞。4、如权利要求2所述的方法，其特征在于，作为受体细胞的卵母细胞通过活体取卵的方法获得。5、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核是将卵母细胞的第一极体及其附近区域的卵核去除。6、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞核融入卵母细胞的融合参数为2.5KV/cm—3V/cm,6—乖。7、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物包括牛、羊、猪和老鼠。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物为牛。9、如权利要求1一8中任一项所述的方法，其特征在于，还包括对哺乳动物的线粒体DNA进行单倍型分析的步骤。10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述单倍型分析是通过PCR—RFLP技术。全文摘要本发明公开了一种细胞核移植方法，该方法以线粒体单倍型相同的非人哺乳动物的供核体细胞和受体卵母细胞进行核移植。本发明的方法能够显著提高重构胚的融合率、卵裂率以及囊胚率，从而显著提高细胞核移植效率。文档编号C12N5/16GK101117633SQ20061002967公开日2008年2月6日申请日期2006年8月3日优先权日2006年8月3日发明者曾凡一,曾溢滔,飞焦,黄淑帧申请人:上海交通大学附属儿童医院;上海滔滔转基因工程股份有限公司