专利名称：一种融合蛋白的酵母表达载体及其基因工程产品的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。
背景技术：
猪是乙脑主要的传染源之一，它与蚊形成了“蚊、猪”的循环传播模式。同时，乙脑也是严重危害养猪业的重大疫病之一，该病引起妊娠母猪流产和死胎，公猪发生睾丸炎，仔猪因脑炎病死，直接影响猪群数量的扩大，给养猪业的持续高产发展造成了巨大的经济损失，并极大的限制了肉产品的出口创汇；在我国目前用于猪乙脑治疗的疫苗是BHK细胞上培养的弱毒苗，但是存在病毒滴度低，保持能力不佳等缺点，所以对研制乙脑基因工程疫苗的要求越来越迫切；E蛋白是毒粒表面最重要的成分，E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关，本试验选取的乙脑E蛋白主要抗原片段是根据软件分析出抗原决定簇较集中的区域。结核杆菌热休克蛋白70具有分子佐剂和载体效应，是结核杆菌的主要抗原成分之一，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生，因此用该基因与一些传染病或寄生虫病病原体的抗原基因融合表达以制备疫苗，借助它的载体分子效应和佐剂作用，以提高病原体抗原的免疫原性和疫苗的免疫预防效果。所选用的酵母表达载体含醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高，外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在，同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且有利于产物的纯化。
技术内容本发明的目的在于提供一种能增强抗原肽尤其是具有免疫保护性抗原肽的免疫原性的酵母表达载体，并且易于大规模、高效、快速生产，成本低廉。为研制一些传染病或寄生虫病防治的基因工程疫苗提供了分子佐剂。
1)以乙脑E蛋白基因为材料，通过PCR方法将E蛋白上主要抗原片段基因扩增出来，E蛋白上主要抗原片段基因位于乙脑SA14-14-2毒株基因组的946nt-2058nt，扩增乙脑E蛋白上主要抗原片段基因的上下游引物分别是p1(5’)5’GAATTCATCCTCCTGCGTTGGTC3’；p2(3’)5’GGATCCGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；PCR总体积为25μL乙脑SA14-14-2毒株基因组1μL，2.5μL 10×PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.25μL rTaq酶，10mmol dNTP，用水补足到25μL体系。PCR条件95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。
2)以人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板扩增出M.Thsp70基因，M.Thsp70基因登录号为X58406，扩增M.Thsp70的上下游引物分别是p1(5’)5’GGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；p2(3’)5’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；PCR总体积为25μL人结核杆菌H37Rv标准株的基因组1μL，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，10mmol dNTP，用水补足到25μL体系。PCR条件95℃5min；94℃1min，66℃1min，72℃3min，30个循环；72℃10min。
3)首先将E蛋白上的主要抗原片段基因用酶切位点EcoR I和BamH I连接到pBluescriptSK+质粒(Promega公司)中，然后将M.Thsp70基因用酶切位点BamH I和Xba I连接到pBluescript SK+质粒中E蛋白主要抗原片段基因的下游，因此获得将E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因融合在pBluescript SK+上的载体SK-E-hsp70，再通过EcoR I和Xba I这两个酶切位点将E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因形成的融合基因切下来，随后同样通过EcoR I和Xba I这两个酶切位点连接到毕赤酵母表达载体pPICZ α-A(Invitrogen公司，www.invitrogen.com)上，从而构建出融合酵母表达载体pPICZ α-E-hsp70；4)按照毕赤酵母表达载体pPICZ α-A说明书，该融合表达载体pPICZ α-E-hsp70线性化后，电转化酵母菌，通过甲醇诱导表达，获得融合蛋白E-hsp70即为基因工程产品。
有益效果1提高抗原性本发明应用M.Thsp70作为分子佐剂，可以增强E蛋白主要抗原片段的免疫原性，在将融合蛋白E-hsp70免疫BALB/c小鼠后，其体液免疫和细胞免疫都比单独的E蛋白主要抗原片段免疫效果好，并且无任何过敏反应，此外，若只是将E蛋白主要抗原片段与M.Thsp70进行物理性混合，M.Thsp70是不能发挥它的免疫增强作用的。
2可大量生产目前，在研究M.Thsp70作为分子佐剂时，一般采用原核表达载体，原核表达产物有可能形成包含体，需变性、复性以及纯化，并且原核表达载体能表达的外源蛋白分子量较低，M.Thsp70的分子量为70kD，使得能插入的抗原肽分子量受限，本发明在使用M.Thsp70作为分子佐剂时选择酵母表达载体，其优点在于能表达的外源蛋白分子量较大，可达200kD，融合蛋白易于稳定、纯化，而且能进行糖基化修饰，易于实现大量生产。
图1重组表达载体pPICZα-E，pPICZα-HSP70和pPICZα-E-HSP70的构建图2(A)E蛋白主要抗原片段的SDS-PAGE分析，(B)E蛋白主要抗原片段的Western blot分析，(C)hsp70蛋白的SDS-PAGE分析，(D)E-HSP70融合蛋白的SDS-PAGE分析和(E)E-HSP70融合蛋白的Western blot分析A:E蛋白主要抗原片段的SDS-PAGE分析，M.Marker；1，2.pPICZα-E；3.pPICZα-A；B:E蛋白主要抗原片段的Westernblot分析，M.Marker；1.pPICZα-E；Chsp70蛋白的SDS-PAGE分析，M.Marker；1.pPICZα-A；2，3.pPICZα-H70；DE-HSP70融合蛋白的SDS-PAGE分析，M.Marker；1.2.pPICZα-E-HSP70；3.pPICZα-A；EE-HSP70融合蛋白的Western blot分析，M.Marker；1.pPICZα-E-HSP70图3mIL-2的半定量RT-PCR检测结果1，2E蛋白主要抗原片段免疫组mIL-2的半定量RT-PCR结果；3，4E+HSP70免疫组mIL-2的半定量RT-PCR结果；5，6E-HSP70融合蛋白免疫组mIL-2的半定量RT-PCR结果；MMarker(DL2000)图4(A)E蛋白，E+HSP70混合蛋白和E-HSP70融合蛋白分别免疫小鼠后mIL-2产生数量的比较；(B)E蛋白，E+HSP70混合蛋白和E-HSP70融合蛋白分别免疫小鼠后淋巴细胞增殖的比较(注标注不同字母者表示差异显著，p＜0.05)具体实施例1酵母表达载体pPICZα-E，pPICZα-HSP70和pPICZα-E-HSP70的构建1)设计扩增酵母表达载体pPICZα-E中E蛋白主要抗原片段基因的引物，p1(5’)5’GAATTCATCCTCCTGCTGTTGGTC3’；p2(3’)5’TCTAGAACGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；5’端带有EcoR I位点，3’端带有Xba I位点。
以乙脑E蛋白基因为材料，通过PCR方法将E蛋白上主要抗原片段基因扩增出来，E蛋白上主要抗原片段基因位于乙脑SA14-14-2毒株基因组的946nt-2058nt，PCR总体积为25μL乙脑SA14-14-2毒株基因组1μL，2.5μL 10×PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.25μL rTaq酶，10mmol dNTP，用水补足到25μL体系。PCR条件95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。
然后将E蛋白上主要抗原片段基因连接到pMD18-T载体(TaKaRa公司)上，获得载体pMD18-T-E，再通过EcoR I和Xba I两个酶切位点将E蛋白上主要抗原片段基因从载体pMD18-T-E上切下来，这样可获得分别含有EcoR I和Xba I两个粘性末端的E蛋白主要抗原片段基因，随后将该E蛋白主要抗原片段基因通过EcoR I和Xba I两个酶切位点连接到pPICZ α-A载体上，从而获得酵母表达载体pPICZ α-E。
2)设计扩增酵母表达载体pPICZα-HSP70中M.Thsp70基因的引物，p1(5’)5’GAATTCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；p2(3’)5’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；5’端带有EcoR I位点，3’端带有Xba I位点。
以人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板扩增出M.Thsp70基因，M.Thsp70基因登录号为X58406，PCR总体积为25μL人结核杆菌H37Rv标准株的基因组1μL，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，10mmol dNTP，用水补足到25μL体系。PCR条件95℃5min；94℃1min，66℃1min，72℃3min，30个循环；72℃10min。
然后将M.Thsp70基因连接到pMD18-T载体上，获得载体pMD18-T-HSP70，再通过EcoR I和Xba I两个酶切位点将M.Thsp70基因从载体pMD18-T-HSP70上切下来，这样可获得分别含有EcoR I和Xba I两个粘性末端的M.Thsp70基因，随后将该M.Thsp70基因通过EcoR I和Xba I两个酶切位点连接到pPICZ α-A载体上，从而获得酵母表达载体pPICZ α-HSP70。
3)设计扩增酵母表达载体pPICZ α-E-HSP70中E蛋白主要抗原片段基因的引物，5’端引物为5’GAATTCATCCTCCTGCTGTTGGTC3’；3’端引物为5’GGATCCGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；5’端带有EcoR I位点，3’端带有BamH I位点。
以乙脑E蛋白基因为材料，通过PCR方法将酵母表达载体pPICZ α-E-HSP70中E蛋白上主要抗原片段基因扩增出来，PCR总体积为25μL乙脑SA14-14-2毒株基因组1μL，2.5μL 10×PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.25μL rTaq酶，10mmol dNTP，用水补足到25μL体系。PCR条件95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。
4)设计扩增酵母表达载体pPICZα-E-HSP70中M.Thsp70基因的引物，
p1(5’)5’GGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；p2(3’)5’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；5’端带有BamH I位点，3’端带有Xba I位点。
以人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板扩增出酵母表达载体pPICZα-E-HSP70中M.Thsp70基因，PCR总体积为25μL人结核杆菌H37Rv标准株的基因组1μL，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，10mmol dNTP，用水补足到25μL体系。PCR条件95℃5min；94℃1min，66℃1min，72℃3min，30个循环；72℃10min。
首先将E蛋白上的主要抗原片段基因用酶切位点EcoR I和BamH I连接到pBluescript SK+质粒(Promega公司)中，然后将M.Thsp70基因用酶切位点BamH I和Xba I连接到pBluescript SK+质粒中E蛋白主要抗原片段基因的下游，因此获得将E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因融合在pBluescript SK+上的载体SK-E-hsp70，再通过EcoR I和Xba I这两个酶切位点将E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因形成的融合基因切下来，随后同样通过EcoR I和Xba I这两个酶切位点连接到毕赤酵母表达载体pPICZα-A(Invitrogen公司，www.invitrogen.com)上，从而构建出融合酵母表达载体pPICZα-E-hsp70。
图1为酵母表达载体pPICZα-E，pPICZα-HSP70和pPICZα-E-HSP70的构建，这三种载体构建完毕后，质粒中外源基因的序列测定由上海博亚生物公司完成。
2酵母载体的表达将酵母表达载体pPICZα-E，pPICZα-HSP70，pPICZα-E-HSP70和pPICZα-A线性化后电穿孔转化，用PCR鉴定重组子，检测引物为p1(5’)5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’(5’Pichia primer)；p2(3’)5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’(3’Pichia primer)。
PCR总体积为25μL重组子基因组1μg，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的检测引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，20mmol dNTP，用水补足到25μL体系。PCR条件95℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃4min，30个循环；72℃10min。阳性重组子经甲醇诱导后，pPICZα-E表达出44kD和50kD两种糖基化程度不同的E蛋白主要抗原片段，表达量较高，约为290mg/L，pPICZα-HSP70表达的HSP70蛋白分子量为70kD，表达量为178mg/L，pPICZα-E-HSP70表达出114kD的E-HSP70融合蛋白，表达量为33mg/L，经Western blot分析，E蛋白主要抗原片段和E-HSP70融合蛋白均具有针对乙脑的抗原性(图2)。
3蛋白质的制备由于本试验中，酵母表达的外源蛋白较纯，自体蛋白极少而且不需考虑LPS的影响，所以在免疫小鼠之前，将表达的蛋白用PBS进行透析，在GeneQuant pro RNA/DNACalculator定量后就可直接进行免疫。
4免疫小鼠分为三组，每组10只；用2.2μg(50pmol)E蛋白主要抗原片段，2.2μg(50pmol)的E蛋白主要抗原片段和3.5μg(50pmol)的hsp70混合(命名为E+HSP70蛋白组)，5.7μg(50pmol)E-HSP70融合蛋白进行腹膜内注射，三周后第二次免疫。
5细胞免疫因子mIL-2的半定量RT-PCR检测结果每只小鼠取相同量的mRNA进行逆转录(反应体系相同)，取等量的RT产物进行PCR，用同体积的PCR产物进行核酸琼脂糖电泳，以了解这三组IL-2mRNA水平的差异。经分析，β-actin的量大致相同，表明试验结果可靠(图3)，免疫E蛋白主要抗原片段组中IL-2灰度值的平均值为1.375±0.0212b，E+HSP70蛋白组中IL-2灰度值的平均值为1.01±0.0141b，免疫E-HSP70融合蛋白组中IL-2灰度值的平均值为2.23±0.212a，E-HSP70融合蛋白组IL-2灰度值的平均值与其它两组差异显著，而E蛋白主要抗原片段组和E+HSP70蛋白组两者之间差异不显著(P＜0.05)，这一结果表明E-HSP70蛋白引起的IL-2含量高于其它两组(图4A)。
6四甲基偶氮唑蓝法(MTT)免疫E蛋白主要抗原片段的小鼠组OD570平均值为0.32±0.068b，E+HSP70蛋白组为0.35±0.042b，E-HSP70融合蛋白组为0.55±0.0812a，这三组经统计学分析，E蛋白主要抗原片段组和E+HSP70混合蛋白组差异不显著，而这两组均与E-HSP70融合蛋白组差异显著(P＜0.05)，这一结果表明E-HSP70蛋白组淋巴细胞增殖强于其它两组(图4B)。
7酶联免疫吸附试验(ELISA)结果经测定，E蛋白主要抗原片段组产生的抗E蛋白主要抗原片段的抗体滴度为103.2，E+HSP70蛋白组产生的抗E蛋白主要抗原片段的抗体滴度为103.2，E-HSP70蛋白组产生的抗E蛋白主要抗原片段的抗体滴度为103.5，这一结果表明E-HSP70蛋白组引起的体液免疫效果比其它两组的效果好。
权利要求
1.一种融合蛋白的酵母表达载体，是通过以下方法获得的1)设计引物上游引物p15’GAATTCATCCTCCTGCTGTTGGTC3’；下游引物p25’GGATCCGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；以乙脑E蛋白基因为模板，通过PCR方法扩增获得乙脑E蛋白上主要抗原片段基因，E蛋白上主要抗原片段基因位于乙脑SA14-14-2毒株基因组的946nt-2058nt；2)设计引物上游引物p15’GGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；下游引物p25’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；以人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板，PCR方法扩增出M.T hsp70基因，M.T hsp70基因登录号为X58406；3)首先将E蛋白上主要抗原片段基因用酶切位点EcoR I和BamH I连接到pBluescript SK+质粒中，然后将M.T hsp70基因用酶切位点BamH I和Xba I连接到pBluescript SK+质粒中E蛋白主要抗原片段基因的下游，因此获得将E蛋白主要抗原片段基因和M.T hsp70基因融合在pBluescript SK+上的载体SK-E-hsp70，再通过EcoR I和Xba I这两个酶切位点将E蛋白主要抗原片段基因和M.T hsp70基因形成的融合基因切下来，随后同样通过EcoRI和Xba I这两个酶切位点连接到毕赤酵母表达载体pPICZα-A上，从而构建成功融合酵母表达载体pPICZα-E-hsp70。
2.权利要求1所述一种融合蛋白的酵母表达载体的基因工程产品，其特征在于按照毕赤酵母表达载体pPICZα-A使用说明书，将融合表达载体pPICZα-E-hsp70线性化后，电转化酵母菌，通过甲醇诱导表达，获得融合蛋白E-hsp70，即为所获得的基因工程产品。
全文摘要
本发明涉及一种融合蛋白的酵母表达载体及其基因工程产品，属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。分别以乙脑E蛋白基因和人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板扩增出E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因，先将这两个基因以一个酶切位点BamHI连接的方式克隆入pBluescript SK+质粒中，最后将该融合基因克隆入pPICZ α－A中，构建酵母表达载体pPICZ α－E－hsp70，按照说明书，该融合表达载体pPICZ α－E－hsp70线性化后，电转化酵母菌，通过甲醇诱导表达，从而获得融合蛋白E－hsp70，来开发研制相关的基因工程产品。
文档编号C12N1/19GK1869239SQ20061004076
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者陈溥言, 葛菲菲, 邱亚峰, 曹瑞兵, 周斌 申请人:南京农业大学