专利名称：一种微生物发酵法制备开菲尔多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵法制备开菲尔多糖的方法，涉及利用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985发酵生产一种葡萄糖与半乳糖的比例为1∶10，含有β-糖苷键、特性粘度[η]为73.86[溶液浓度为1g/100mL]的新型开菲尔多糖。
背景技术：
开菲尔(Kefiran)多糖是1967年荷兰的La.Riviere首次对开菲尔粒的结构进行研究时所发现的一种具有一定弹性的粘性多糖，并命名开菲尔粒中的这种纤维状物质为Kefiran。
开菲尔多糖作为一种重要的生理活性物质，具有抗真菌、抗细菌、降压、降血糖、抗癌和抗肿瘤等功能特性。同时开菲尔多糖具有阻止肿瘤的恶化，抑制癌细胞增殖，并且对形成干扰素β-皮甾醇和去甲肾上腺素具有促进效果，是一种很好的消炎降压及免疫激活物质。动物实验表明，开菲尔多糖可使胃液和小肠中的蛋白酶活性提高两倍以上。已有研究表明，将开菲尔多糖作为一种功能性食品组分添加到食品中，具有降低血压功效。2005年研究表明，开菲尔多糖在临床医学上用于抗菌、消炎、伤口愈合，广泛地应用于各种疾病诊治中。
最早利用发酵法生产开菲尔多糖的是Takao Mukai等，其在1989年将L.Kefiranofaciens培养在IKPL培养基中，30℃下培养3天，多糖的产量为63mg/L；1992年，Haruhiko Yokoi等报道了发酵法生产开菲尔多糖的产量达2.04g/L；1998年，Takahiro Mitsue和Yusaku Fuiio利用Lactobacillus kefiranofaciens KF-75和Torulaspora delbrueckii IFO 1626混合培养的方法将开菲尔多糖产量提高到3.7g/L；1999年T.Mitsue等研究了Lactobacillus kefiranofaciens与不同的酵母菌株混合培养对开菲尔多糖产量的影响，发现利用Lactobacillus kefiranofaciens单独发酵生产得到的多糖产量为1.8g/L，与Torulaspora delbrueckii IFO 1626(TD-1626)混合培养6天得到的产量为2.3g/L，而将Lactobacillus kefiranofaciens与Torulaspora delbrueckii IFO 1626分批混合培养7天，产量可达3.7g/L。2003年，Benjamas Cheirsilp等通过Lactobacillus kefiranofaciens和Saccharomycescerevisiae混合培养来提高开菲尔多糖的产量，经分批混合培养87h，开菲尔多糖的产量最终可达到5.41g/L；2004年，出现利用大米水解液进行发酵生产开菲尔多糖的报道，其产量为5.04g/L。
Kooiman对开菲尔多糖的化学结构的研究表明，其内部葡萄糖和半乳糖之比为1∶1，多为中性；1987年，向井孝夫的研究也证明了Kooiman得到的结论。近年来的研究表明，Kefiran除具有Kooiman所报道的结构外，还含有6-O-取代半乳糖的结构。1987年T.Toba等在对开菲尔粒中多糖组分进行的凝胶色谱分析中发现开菲尔粒中多糖有二个代表性分子量分别是4.0×106Da和1.0×106Da的峰。1990年，Haruniko yokoi也对此多糖进行凝胶过滤色谱分析，发现上清液和荚膜多糖各有二个峰，上清液多糖的二个峰分别是4.0×106Da和1.5×106Da；荚膜多糖组分的二个峰分别为4.0×106Da和1.0×106Da。目前的研究指出，开菲尔多糖是一种水溶性的中性支链多糖，分子量在1.0×106Da左右，含有几乎相等的D-葡萄糖和D-半乳糖残基，葡萄糖与半乳糖的比例为1∶1.05，其主链为由五个六碳糖组成的重复单元，并有一个或两个糖残基随机连接在重复单元上。在25℃时，Kefiran的[α]D＝+54°；特性粘度[η]为5.4±0.5[溶液浓度为1g/100mL]。
开菲尔多糖作为一种新型的活性多糖，由于其特殊的生物学特性，广泛地应用于临床医学、功能性食品添加剂的领域，也引起国外学者的普遍关注和研究。而在国内，随着人们生活水平的提高，对功能性食品的需求和要求也越来越高，必须加大对发酵法生产开菲尔多糖的研究力度，但至今未见国内对开菲尔多糖的研究报道，特别是与国外不同结构类型的开菲尔多糖的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵法制备开菲尔多糖的方法。
本发明的技术方案是利用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985发酵菌株，经种子培养后，接种于发酵培养基中，静置培养4天，采用工业级的麦芽汁和国产酵母粉为原料发酵生产分子量数量级为1.5×105Da；葡萄糖与半乳糖的比率为1∶10；β-型吡喃多糖中含有β-糖苷键；特性粘度[η]为73.86[溶液浓度为1g/100mL]的新型开菲尔多糖。
(1)菌株乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985，购自日本大阪大学生物工程学院，见参考文献Modelling and optimization of environmental conditions forkefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens.Applied microbiology andBiotechnology，2001，57639-646。
(2)培养基种子培养基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，乙酸钠5，磷酸二氢钾2，柠檬酸三铵2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·5H2O 0.05，Tween 80l，pH 5.5。
基本发酵培养基(g/L)胰蛋白胨20，酵母膏10，牛肉膏20，磷酸二氢钾2，乙酸钠5，MnSO4·5H2O 0.28，柠檬酸三铵4，MgSO4·7H2O 0.58，CaCl2·2H2O0.74，Tween 80l。
改进发酵培养基在质量浓度为10％的麦芽汁中添加以g/L计的酵母粉100，KH2PO44，MgSO4·7H2O 1，MnSO4·5H2O 0.2。
(3)摇瓶培养将30℃下厌氧培养48h的种子以10％的接种量分别转接到基本发酵培养基和本发明提出的改进发酵培养基中，25℃下静置培养4天，进行对比。
(4)细胞干重的测定取一定量的菌悬液置于10ml容量瓶中，加入去离子水定容至10ml，摇匀，用UNICE 2000型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值，利用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
(5)开菲尔多糖含量的测定采用蒽酮-硫酸比色法取适量发酵液于3000rpm离心30min。取2ml上清液，加入等体积-20℃的无水乙醇混匀，3000rpm离心15min，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗数次，洗去残糖，将沉淀溶于去离子水中，3000rpm离心10min得上清液。将上清液稀释后，用蒽酮-硫酸比色法测吸光值，根据葡萄糖标准曲线和换算系数(0.9)计算出多糖的浓度。
(6)Kefiran的制备与提取L.kefiranofaciens JCM 6985菌25℃静置发酵4天，发酵液于4000rpm下离心30min，除去菌体及沉淀，离心得到的上清液经旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/5，取出冷却后加入相等体积的-20℃的无水乙醇，待产生沉淀后，离心收集沉淀物，将沉淀溶于一定量的蒸馏水中，于4000rpm下离心10min，除去不溶物，得上清液，此过程重复3次，所得沉淀经真空干燥后研磨成粉末，即为胞外多糖粗品。
(7)多糖分子量的测定高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)仪器Waters 600高效液相色谱仪(配2410示差折光检测器和M32工作站)色谱条件色谱柱UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2流动相0.1mol/L硝酸钠流速0.9ml/min柱温45℃样品制备样品溶解于流动相中，用微孔过滤膜过滤后供进样。
分子量校正曲线所用标准品Dextran T-2000(Mw2000000)Dextran T-580(Mw580000)Dextran T-190(Mw188000)Dextran T-70(Mw70,000)
Dextran T-10 (Mw10,000)Dextran T-5 (Mw4600)Maltopentaose(Mw828)(8)单糖组分分析A完全水解取一定量的多糖溶液加适量2mol/L H2SO4，封管，100℃，水解10h，BaCO3中和，离心，取上清液备用。
B高效液相色谱(HPLC)仪器Waters 600高效液相色谱仪(配2410示差折光检测器和M32工作站)色谱条件色谱柱Sugarpakl，6.5mmid×300mm流动相纯水检测器灵敏度4柱温85℃流速0.4ml/min进样体积10μL(9)多糖的红外光谱分析将干燥的多糖用KBr压片法做红外光谱分析。
(10)特性粘度的测定以水为溶剂，配置1％的开菲尔多糖溶液，采用乌氏粘度计于25℃测定多糖溶液的特性粘度。包括相对粘度ηrelt/t0(t样品流出时间，t0溶剂流出时间)增比粘度ηspηrel-1比浓粘度ηredηsp/C特性粘度[η]以ηred为纵坐标，C为横坐标，外推至C为0时的ηred，即截距。根据比浓粘度ηred＝ηsp/C与浓度C的关系式Huggins公式ηsp/C＝[η]+k[η]2C，ηsp/C与C呈线性关系，但ηsp/C与C的线性关系必须在一定的浓度范围内，超过浓度限度时线性关系遭到破坏，曲线向上弯曲，因为随浓度的增加，聚合物分子链间的距离逐渐缩短，分子间作用力加强，所以在测定多糖EPSII的特性粘度时，选择的糖浓度为1％。
本发明的有益效果Kefiran是一种重要的多糖，在临床上的用途广泛。开菲尔多糖的结构对其功能影响很大，如多糖的抗肿瘤活性是由于β-糖苷键的存在。本发明方法对提高Kefiran多糖的产量，实现Kefiran工业化生产，同时为Kefiran作为食品添加剂得到大规模应用奠定基础。无论从理论还是从实践角度来看，实现发酵法生产Kefiran的产业化，不仅能填补我国在这一研究领域的空白，对我国医药工业、临床医学和食品工业均具有重大的社会效益和经济效益。通过发酵培养的结果比较可以看出，改变发酵培养基组成成分能有效地提高Kefiran的产量，并且能改变Kefiran的结构，生产出具有抗肿瘤活性的β-糖苷键的Kefiran多糖。在其它培养条件相同的情况下，使用麦芽汁和酵母膏使得Kefiran多糖的产量提高近一倍，结构与已见报道的Kefiran多糖不同。
图1标准葡聚糖的出峰时间和分子量对数值的关系图出峰时间同分子量之间的对应方程为Log Mol Wt＝13.1-0.471T具体实施方式
对比例1 按照说明书中所描述的发酵条件，采用基本发酵培养基，摇瓶发酵的实验结果细胞干重6g/L，Kefiran多糖含量为0.85g/L，发酵周期为5天。
对比例2 按照说明书中所描述的发酵条件，采用基本发酵培养基，摇瓶发酵的实验结果细胞干重为8g/L，Kefiran多糖含量为1.96g/L，发酵周期为4天。
实施例1 按照说明书中所描述的发酵条件，采用本发明改进的发酵培养基，发酵培养的实验结果细胞干重为24.6g/L，Kefiran多糖含量为2.6g/L，发酵周期为4天。
实施例2 按照说明书中所描述的发酵条件，采用本发明改进的发酵培养基。发酵培养的实验结果开菲尔多糖的分子量为1.5×105Da；葡萄糖与半乳糖的比率为1∶10；β-型吡喃多糖中含有β-糖苷键；特性粘度[η]为73.86[1g/100ml]。
权利要求
1.一种微生物发酵法制备开菲尔多糖的方法，其特征是采用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985为发酵菌株，经种子培养后，接种于发酵培养基中，静置培养4天，得到分子量数量级为1.5×105Da；葡萄糖与半乳糖的比率为1∶10；β-型吡喃多糖中含有β-糖苷键；1g/100ml溶液的特性粘度[η]为73.86的开菲尔多糖；发酵条件为菌株乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985；种子培养基，以g/L计葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，乙酸钠5，磷酸二氢钾2，柠檬酸三铵2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·5H2O 0.05，Tween 80 1，pH 5.5，培养条件30℃下厌氧培养48h；发酵培养基在质量浓度为10％的麦芽汁中添加以g/L计的酵母粉100，KH2PO44，MgSO4·7H2O 1，MnSO4·5H2O 0.2；培养条件将种子培养液以10％的接种量转接到发酵培养基中，25℃下静置培养4天。
全文摘要
一种微生物发酵法制备开菲尔多糖的方法，涉及发酵法制备开菲尔多糖的技术领域。本发明采用乳酸菌(Lactobacillus kefiranofaciens)JCM6985为发酵菌株，经种子培养后，接种于经改进的发酵培养基中进行静置培养，得到一种分子量数量级为1.5×10
文档编号C12R1/225GK1884570SQ20061004060
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者王淼, 毕洁 申请人:江南大学