专利名称：一种治疗类风湿性关节炎的dna疫苗及其用途的制作方法
一种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗及其用途 发明领域本发明涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体 pcDNA3. 1 ( + )有效连接的CC0L2A1基因(SEQ ID冊1)。本发明还 涉及含有与真核表达栽体pcDNA3. l( + )有效连接的CC0L2A1基因(SEQ ID NO : l)组成的重组表达栽体。本发明还涉及所述重组核酸构建体用 于制备治疗类风湿关节炎的DM疫苗的用途，以及包含上述重组核酸 构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。本发明进一步的还涉及治疗 类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述DNA疫 苗。发明背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以'艮性侵蚀 关节炎为特征的全身性自身免疫病。近年来国外趋向于将对免疫调节 作用的药物作为治疗RA的第一线药，并对RA新的免疫治疗策略进行 了广泛的探索。大量动物实验证实，II型胶原(CII)可诱发胶原性 关节炎(CIA),出现与RA类似的病理表现。这些研究提示，CII是 诱导RA发病的主要自身抗原之一。通过给予CII抗原诱导免疫耐受， 是国际上兴起的治疗自身免疫病RA的特异性免疫疗法之一，这些免疫 耐受的机制包括主动抑制、克隆无能、克隆清除以及旁观者抑制等， 这还有可能不是其全部的机制。其中有通过口服胶原，静脉、肌肉、 皮下注射胶原等方法治疗CIA模型鼠取得很大成功，但在临床实验中 治疗效果远不如动物模型中的治疗效果，其中的限制因素主要是抗原 的用量、种类来源、性质、抗原呈递处理过程、宿主的遗传背景等。目前国际上探索免疫耐受治疗RA所采用的CII均是天然提取制备 的，很难保证产物的天然结构的完整性和抗原性，也缺乏正确的空间 构象和适当的修饰。因此，这样的免疫原缺少在构象上相关的表位，难以诱导对应于天然抗原的免疫耐受。而且，cn作为蛋白质在体内存在半衰期短，病人需要重复给药的缺点，这也限制了cn的大规模 使用。采用DNA疫苗可以成功克服上述缺陷。DNA疫苗相对于传统的免 疫策略具有的优势包括(l)免疫效果好。DNA疫苗不需要提取CII，也 不需要在体外原核或真核表达CII，也不需要对表达产物进行纯化、 加工。CII基因直接在宿主体细胞内表达和后加工，能更完整地得到 产物的天然结构和抗原性，也就是在宿主内有正确的空间结构和适当 的修饰；U)易操作性和稳定性。DM序列清楚，純化技术简便，质量 易于控制。(3)外源基因在体内存在时间较长，不断表达外源蛋白，因 此它可以持续给免疫系统提供刺激，无需重复施用蛋白质抗原；(4)能 用各种投递疫苗的方法。如直接或脂质包裹后肌肉内注射，基因皮下 枪接种，气枪肌肉接种，以气溶胶方式吸入或鼻内滴入，利用细胞内 细菌传送DM疫苗，利用病毒鼻内传递DM疫苗以及经包装后口服等。 (5)具有热稳定性，质粒的热稳定性远高于蛋白质，它不需特别的冷藏 系统，可以加工成干燥的小颗粒，便于贮藏和运输。(6)规模化生产， 成本低廉。由于其易操作性和稳定性，也决定了 D1U疫苗生产成本相 对低廉，这就为DNA疫苗在发展中国家的大规模使用铺平了道路。本发明人在大量研究基础上采用鸡的II型胶原(CCII )基因制备 所述DNA疫苗，其表达产物CCII与其它物种来源的CII相比在很多方 面具有优势(1)富含大量的硫酸软骨素A和粘蛋白，而粘蛋白中的 硫酸葡糖胺含量最高，它们有着强有力的抗炎作用和软骨修复作用； (2)CCII能有效防止蛋白酶对关节软骨的消化破坏，重新编程已被 破坏的软骨细胞和细胞因子，从而减少炎症的发生；(3)CII能促进 软骨细胞及粘蛋白的合成，增加关节滑液及透明质酸的分泌；(4)CII是强有力的抗炎剂和疼痛緩解剂；(5) cn治疗十分安全无明显毒副作用，这也是目前任何其它治疗RA药物所不能比拟的.
发明内容本发明人在成功获得鸡全长CII基因cDNA的基础上，选择真核表 达载体，例如pcDM3. 1或者腺病毒作为载体，成功构建治疗性疫苗用 于治疗RA。因此，本发明的一个方面，涉及一种重組核酸构建体，其含有与 表达调控序列有效连接的CC0L2A1基因(SEQIDN0: 1)。在本发明中， 所述表达调控序列用于在真核宿主细胞中实现CC0L2A1基因的有效表 达。在本发明的一个实施方案中，以鸡II型胶原(CCII)诱导的 Wistar大鼠为RA模型即CIA， 一次性尾部静脉注射20pg/kg、 200|ig/kg 、 400ng/kg三个不同剂量pcDNA-CC0L2Al基因疫苗对CIA 关节炎的治疗作用，结果表明在注射后笫5天200ng/kg组就可观察 到大鼠关节肿胀程度明显减轻，与空载体组比较有显著性差异(p<0.05)，而20pg /kg、 400网/kg两剂量组与空栽体组比较则未 观察到治疗效果(p>0. 05)。放射影象学和组织病理学检查显示，上 述实施方案中，经过200ng/kg治疗后，使关节软骨及其下面的骨小 梁结构与正常组接近，关节软骨及其下面的骨质结构得到保护，可使 炎症分数下降为对照组的50%,仅关节滑膜略有增生，与空载体组比 较具有显著性差异(代O. 05);而20pg /kg和400ng /kg两剂量组 与空栽体组比较则未观察到任何治疗效果(》0.05)。 注射后6周 CIA大鼠血清中抗CII抗体浓度水平、TNF-a浓度在200jig/kg治疗组 较空栽体组明显降低(p<0.05),而400pg /kg组则显著的升高， 20jag/kg组则无明显变化。此外，细胞因子TGF-P、 IL-10浓度水平 在200ng/kg组较空栽体组明显升高(p<0. 05 )，而20^g/kg与400pg/kg 两组则无显著性差异。脾细胞淋巴细胞增殖实验表明，200ng/kg剂量 pcDNA-CC0L2Al基因疫苗治疗組大鼠脾细胞对CII的反应能力较空栽 体组明显下降(p<0. 05 ),此结果表明，200ng/kg剂量pcDNA-CC0L2Al 基因疫苗能明显抑制CIA大鼠关节肿胀程度，降低抗CII抗体、TNF-ot水平，提高细胞因子TGF-P、 IL-10水平，降低脾细胞增殖反应能 力，对CIA大鼠关节炎有显著的治疗作用，有望在RA的基因免疫耐受 治疗中具有重要的临床应用价值。在本发明的另 一方面，涉及一种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗， 其包含前述本发明所构建的含有与表达调控序列有效连接的CC0L2A1 基因(SEQ ID NO : l)的重组核酸构建体。具体的，在本发明的一个实施方案中，将克隆的CC0L2A1基因 4837bp全长cDNA连接于真核表达载体pcDM3. 1 ( + )上，获得重组 真核表达栽体pcDM-CC0L2Al，即CC0L2A1基因疫苗。用于本发明的"基因疫苗"指用于治疗或预防人类类风湿关节炎 的基因治疗药物，这是基于鸡II型胶原的药理学活性。宿主细胞是用本发明的重组表达栽体进行遗传工程化(转导、转 化或转染)的，载体可以是一个克隆栽体或表达载体。载体可以是质 粒、病毒粒子、噬菌体等等。工程化的宿主细胞能在为适于活化启动 子、筛选转化子或表达CC0L2A1基因而改变的传统营养培养基上培养。 培养条件诸如温度、PH等与被选择的细胞原来所用的表达条件一致， 对于本领域普通技术人员来说是很明显的。本发明所述CC0L2A1全长cDNA可以存在于一系列表达载体上，这 些栽体包括染色体的、非染色体的和合成的DM序列，例如，SV40的 衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA 结合的载体、病毒DM、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及 伪狂犬病毒。不过，只要能在宿主中复制和表达目标基因，其它栽体 也可以利用。通常，为实现表达栽体中的目标序列的高效表达，其被有效地与 一个合适的表达调控序列(例如，启动子，增强子，终止子等)连在 一起，从而指导mRM的合成。下面提到的是这种启动子的代表LTR或SV40启动子、大肠杆菌 的Lac或trp启动子、噬菌体的PL启动子以及已知控制真核细胞或其病毒中基因表达的其它启动子。此外，表达栽体优选包含能提供表 型特征的一个或多个选择标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例 如真核细胞的培养可用二氢叶酸还原酶或新霉素抗性。包含上述合适的目标基因序列、合适的启动子或控制序列的载体 可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。特别值得提及的是，本发明也包括含上面概括性描述的一个或多 个序列的重组核酸构建体。该重组核酸构建体包括栽体，如质粒或病 毒载体，其中正向或反向插入了本发明的一个序列。在此实施方案的 一个优选方面，该重组核酸构建体还包含调节序列，例如启动子，它 被有效地连接到该序列上。对于本领域技术人员来说，许多栽体和启动子都是已知的，并可通过商业途径获得。下面列举几种栽体。pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44、 pXTl、 pSG (Stratagene)、 pSVK3、 pBPV、 pMSG、 pSVL (Pharmacia)。不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒 或载体也可应用。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚 期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I。合适载体和启动子 的选择应在本领域普通的技术水平之内。在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细 胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DM构建体衍生的RNA，也可以 用无细胞翻译体系产生这种蛋白质。适合于原核和真核宿主的克隆和 表达载体Sambrook等人已在《分子克隆实验指南》(第二版，冷泉港 出版社，纽约，1989 )中进行了描述.在高等真核生物中，编码本发明多肽的DNA的转录可以通过在载 体中插入一增强子序列而被提高.增强子是DM的顺式作用因子，通 常有大约10-300bp，作用于启动子，提高它的转录。例如，SV40的位 于复制起点后侧100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强 子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。哺乳类表达栽体包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必 需的核糖体结合位点、多腺普化位点、拼接供体和受体位点、转录终 止序列和5，侧翼非转录序列。衍生于SV40拼接序列的DM序列和多 腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件.
按本发明所述，将鸡II型胶原编码基因导入细胞，所述基因在这 些细胞表达后表现出药理学活性。因此，本发明的药物可有效地用于 例如类风湿关节炎的治疗。为了将本发明所述鸡II型胶原编码基因导入细胞，也可以使用病 毒载体的方法。具体的，所述方法由例如下列步骤组成，将鸡II型胶 原编码基因导入例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱渗病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒或其它RM病毒。这些病毒 中，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒优选用于本发明鸡II型胶原编 码基因的导入。其他用于导入鸡II型胶原编码基因方法的例子包括脂质体法、脂 转染法、微注射法、磷酸钙方法、电穿孔法。这些方法中，优选使用 月旨质体法。在鸡II型胶原编码基因作为基因疫苗的实际应用中，将所述鸡 II型胶原编码基因直接导入机体(体内方法)是非常有利的方法。另 外，也可以从人类中收集某种细胞，将鸡II型胶原编码基因导入体外 细胞，再将导入鸡II型胶原编码基因的细胞重新导入人体(离体方 法)。这些方法在下列文献中有所描述NIKKEI Science ， 1994年4 月，20 - 45页；GEKKAN YAKUJI ， 36 (1) ， 23-48 ( 1994 )和其中所 引的参考文献。可依据待治疗的疾病、靶器官等适当地选择这些方法， 并应用本发明的基因疫苗。当本发明所述基因疫苗采用fi^方法给药时，药物可根据待治疗 的疾病、靶器官等通过任何合适的途径给药。药物可通过静脉、动脉、 皮下、肌肉等给药或直接给药至疾病的靶器官，如肾、肝、肺、脑、 神经等。通常，直接给药至靶点可以有选择地治疗靶器官。上面描述的M方法可用于鸡II型胶原编码基因的导入，例如， 人类细胞(如淋巴细胞或造血干细胞)用常规方法收集后再用本发明 药物致敏以导入基因。然后将鸡II型胶原编码基因生产细胞返回人 体.当用体内方法施用药物时，该药物可采用多种制剂方式，包括液8
体制剂形式。 一般而言，药物优选制成一含有鸡n型胶原编码基因作 为活性组份的注射液。如果必要，常规载体可加入到药物组合物中。 可通过常规方法制备注射液，如将鸡n型胶原编码基因溶解在适当的 溶剂里(如无菌水，緩沖溶液，生理盐水等)，通过滤器过滤等方法 进行灭菌，将溶液装入灭菌容器中。该药物的制备中可用含鸡n型胶 原编码基因的病毒载体代替鸡ii型胶原编码基因本身。当使用含有包埋鸡II型胶原酶编码基因(或HVJ-脂质体)的脂质体时，药物可以是脂质体制剂的形式，如悬浮液、冷冻制剂、离心浓缩冷冻制剂等。 基因疫苗中鸡n型胶原编码基因的含量可随待治疗疾病、靶器 官、病人的年龄和体重等的变化而改变。然而，在以鸡n型胶原编码基因计算时，适宜剂量为0. OOOlmg到100mg，优选0. OOlmg到10mg。 该剂量可分为几天或几个月服用。
图1. pcDNA-CC0L2Al真核表达载体构建示意图。 图2.显示pcDNA-CC0L2A1真核表达载体的酶切分析结果。其中 泳道1为DNA标准参照物；泳道2为HindIII + EcoR酶切 pcDNA-CC0L2A1;泳道3为DNA标准参照物；泳道4为Hind III酶切 pcDNA-CC0L2Al。图3A.为15 %的SDA-PAGE电泳分析CC0L2A1基因表达的结果， 其中泳道l为20pg pcDNA3. 1;泳道2为20pg pcDNA- CC0L2A1;泳 道3为标准蛋白参照；图3B. Western-blot分析CC0L2Al基因表达的 结果，其中泳道l为20ngpcDNA3. l;泳道2为20pg pcDNA-CC0L2A1; 泳道3为标准蛋白参照。图4.显示真核表达载体pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治疗后 CIA大鼠关节炎指数的变化。图5显示pcDM-CC0L2Al用作基因疫苗治疗后，各组间CIA大鼠 后足踝关节的组织病理学改变(HE染色，40X)，箭头所示关节腔破 坏、炎性细胞浸润、血管錄形成、软骨破坏情况。图6显示pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治疗后，对CIA大鼠后足 组织病理学分数的影响，其中6A显示各组后足踝关节炎症的组织分数 情况；6B显示各组后足血管翳形成和软骨破坏分数 图7显示pcDM-CC0L2Al用作基因疫苗治疗后，对CIA大鼠后足 X光放射影象学的影响。其中箭头所示为软组织肿胀，骨关节、软骨 破坏情况以及关节间隙的清晰度。图8显示pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治疗后，对CIA大鼠后足 放射学分数的影响。图9. nCCII对CIA大鼠脾淋巴细胞增殖的影响。以下结合具体实施方式
说明本发明。统计学处理结果数据以；土s 表示，应用SPSS11. 0软件进行分析，数据两两比较采用Student t 检验，而多组之间比较则用ANOVA进行检验。实施例实施例1重组真核表达栽体pcDNA-CC0L2Al的构建公开于GenBank-accession numbers AY046949的鸡II型胶原全 长cDNA，通过PCR方法从质粒pPIC9K-CCOL2Al (本实验室构建保存) 获得。将所得编码鸡II型胶原全长cDNA，连接到测序栽体 pGEM-T-easy，测序正确后再连接到真核表达载体pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen， USA)即pcDNA-CC0L2Al。为了4吏CC0L2A1获得高表达， 在起始密码ATG 前加入了信号肽序列N0:4)和Kozak序列(GTTATGG， SEQ ID NO: 5)，并在设计引物时加入 EcoR I 与Hind III 两个酶切位点。引物 1 : 5 ， AAGCTTGTTATGGATATGCATGGA CGTCGTCCACCACGTTCCGCCGC T C -TCCTCCTC3，(SEQ ID NO: 2 );引物2: 5， GAATTCTTACAAGAA GCAGACTGGGCC3， (SEQ ID NO: 3)。具体的，所得真核表达栽体pcDNA-CC0L2Al由CMV启动子和鸡 II型胶原基因CC0L2A1组成，构建流程见图1。将真核表达栽体 pcDM-CC0L2Al经EcoR I和Hind III双酶切可见4. 3kb的CC0L2A1
及5. 4kb的pcDM3. 1两条电泳带，与插入的目的基因片断和载体大 小相一致，而用HindlII单酶切，则可见9. 7kb —条电泳带(见图2)， 由此表明，pcDNA-CC0L2Al真核表达载体构建成功。实施例2真核表达栽体pcDNA-CC0L2Al在COS-7细胞中的表达重组真核表达载体pcDNA-CC0L2Al的瞬时表达分析方法按照 LipofecUMINETM 2000试剂盒(购于GIBCOBRLR)说明，将30ngDNA 转染到C0S-7细胞(106)中，在RPMI-1640培养基中培养12h后，换 成含G418 ( 500ng/ml)的培养液筛选获得阳性克隆。扩增培养阳性克 隆收集其培养液(每天一次，连续两天)。真空干燥后，将其溶解入 0. lmol/L的冰醋酸中。取100ng蛋白上样，经15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后转到PVDF膜上，用含10% 小牛血清封闭液封闭，加入1: 1000稀释的抗CCII单抗41C醉育过夜， 尔后再用1: 2000稀释的酶标二抗IgG孵育37iCl~2h。洗膜后，将 膜浸入10ml碱性磷酸酶底物緩冲液与33pl四唑氮蓝(NBT)和5-溴-4-氟-3-吲味砩酸(BCIP)制成的显色液，室温闭光显色20min， 蒸馏水终止反应，Cold-Spring凝胶成像系统扫描显像。根据上述方法，将真核表达载体pcDNA-CCOL2Al转染到COS-7 细胞(106)中。经G418筛选后，培养阳性克隆，收获、浓缩、真空干 燥培养液，然后再溶解在0.1 mol/L的乙酸中。产物经15%SDS-PAGE 电泳检测，结果如图3所示，在大约143kD左右处有一电泳条带，与 质粒pcDM-CC0L2Al基因表达的CCII蛋白相对应，而仅转染pcDM3. 1 空栽体的细胞培养液中则没有特异性条带出现。Western-Blot分析证 明，在约143kD左右亦可见到特异性反应条带。由此证明重组真核表 达栽体pcDNA-CC0L2Al在C0S-7细胞中能够有效表达CCII多肽链a亚 单位，而且是分泌型表达。实施例3真核表达载体pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗对CIA大 鼠关节指数的影响选择雌性Wistar大鼠(190+ 15g)用于动物实验，其购于北京军 事医学科学院动物中心，饲养在动物中心清洁级环境中， 1。 CIA大鼠的诱发17]: 雌性Wistar大鼠70只，随机取8只作正常 对照，其余大鼠均用于建立CIA模型。具体建模方法是将鸡II型 胶原(SIGMA公司)用0. Olmmol/L的冰醋酸溶解后，配成4mg/ml的 溶液，加等体积完全福氏佐剂(CFA)，使终浓度为2mg/ml。以0. lml /只在尾根部和背部多点注射， 一周后从腹部注射0. lml /只加强免疫 一次。加强免疫后一周，CIA发病率为73% ( 45/62 )。2。核酸免疫随机抽取40只CIA关节炎大鼠分成5组(每组 8只)，各组之间的关节指数经统计学处理差异无显著性.5组分别为 ①空栽体注射组；②20ng/kg基因疫苗治疗组；(D200|ig/kg基因疫苗 治疗组；④400^ig/kg基因疫苗治疗组；⑤关节炎组(空白对照)。空 载体和治疗栽体都分别溶解在200nl PBS緩冲液中，关节炎组也注射 同样量的PBS，均采取尾静脉注射方法。分别从CIA大鼠尾静脉注射20pg/kg、 200|ng/kg 、 400ng/kg真 核表达栽体pcDM-CCOL2Al作为基因疫苗，同时设200ng/kg的 pcDNA3. 1空栽体组和不给药的关节炎组作对照。四肢关节肿胀评估""四肢关节肿胀程度按0~4级评分0.无 肿胀；1.趾关节稍肿；2.小趾关节和足趾胂胀；3.踝关节以下足 爪肿胀；4.包括踝关节在内的全部足爪肿胀。每一CIA关节炎大鼠的 关节分数为四肢关节炎分数之和，最大可达16分。给药后连续一个月观察大鼠关节变化并打分即可获得关节炎指 数，结果详见图4。由此可见，空载体组和20pg/kg基因疫苗组间治 疗效果无区别，而200^g/kg基因疫苗组与空栽体组间疗效则有显著 性差异"P〈0.05)，相反400jLig/kg的高剂量组中关节炎指数却有升 高。实施例4真核表达栽体pcDNA-CC0L2A1用作基因疫苗对CIA大鼠 后足组织病理学的作用
组织病理学检查按规定处死实验大鼠，取后足炎性踝关节作标 本，以10%曱醛溶液固定、脱钓、脱水、切片、HE染色，观察炎性关 节组织的病理改变。根据炎症程度对滑膜炎症、血管翳和软骨破坏进 行评分。评分标准如下滑膜下炎症，0分正常、l分局灶性炎症 细胞浸润、2分弥漫性炎症细胞增生；血管翳和软骨破坏，0分正 常、l分血管發覆盖软骨，但无软骨破坏、2分有血管錄和软骨破 坏。pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治疗各组间CIA大鼠后足踝关节的 组织病理学改变及其评分结果见图5和图6,由图5可见，注射 200ng/kg pcDNA3. l对照组，大鼠后足有明显的血管發形成，滑膜增 生和大量淋巴细胞浸润，关节软骨变薄且失去完整性，几乎观察不到 完整的骨小梁，骨髄腔部为分布有大量破骨细胞。20ng /kg、 400ng /kg 治疗组与关节炎对照组表现类似。而200ng /kg治疗组关节软骨及其 下的骨小梁结构与正常组接近，但关节滑膜有一定程度的增生。由此 表明在所选择的20网/kg、 200网/kg 、 400ng /kg 3种基因疫苗治 疗剂量中，200网/kg剂量组对CIA大鼠后足踝关节的炎症以及软骨 和骨的破坏的抑制作用最为明显，可使炎症分数下降为对照组的50% (*P<0. 05)。实施例5真核表达载体pcDNA-CC0L2A1用作基因疫苗对CIA大鼠 后足作用的放射影象学结果影象学检查腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，对大鼠后肢行侧位X 线检查，由一位不了解此项目研究具体内容的放射科人员对全部关节 炎后足X线进行放射学评分。具体标准0分无损害表现、l分轻 度的骨质疏松和骨膨胀表现、2分关节间隙减小、3分明显的骨与 关节软骨损害并伴随关节间隙减小、4分关节结构消失、骨赘形成 和钓化。pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗治疗各组间CIA大鼠后足踝关节X 光放射学表现及评分结果详见图7和图8.在关节炎组可见，软組织
肿胀，骨关节边缘模糊，软骨破坏。而在所选择的三种治疗剂量组中，只有200pg/kg治疗组治疗效果最明显(*代0.05)，可使软组织肿胀 减轻，关节间隙清晰。而20pg/kg和400pg/kg治疗组的关节软骨表 面和骨密度与关节炎组比较变化不明显。此外，20pg/kg治疗组的放 射学分数与空载体组类似，而400pg/kg治疗组的放射学分数却稍有升高。实施例6真核表达载体pcDNA-CC0L2Al用作基因疫苗对CIA大鼠 脾脏淋巴细胞增殖的影响制备脾淋巴细胞悬液按规程处死受试大鼠，无菌条件下取其脾 脏，置于RPMI1640培养液中，100目不锈钢网研磨过滤，洗涤2次 后配成2 x io7ml悬液加入96孔板。用100jig/ml的nCCII剌激72小 时后收集培养液，用ELISA试剂盒检测培养液中细胞因子水平浓度 的变化。淋巴细胞增殖试验常规制备的大鼠脾细胞经0. 83。/。NH4CL处理 石皮坏红细胞，洗涤配成2 x 106/ml悬液，按每孔lOOjil加入96孔板。 淋巴细胞分成两組(1)加PHA作试验阳性对照，浓度为0、 1、 10、 50、 100、 25(Hig/ml; ( 2 )加nCCII作试验组，浓度为25、 50、 100、 250、 50(Hig/ml，刺激培养72h，采用MTT比色法测定ABS570nm值。结果各实验组CIA大鼠脾脏淋巴细胞分别用不同浓度的nCCII 和PHA进行刺激，采用上述MTT法测定其各自的增殖反应，结果如图 9所示，200ng/kg基因疫苗组的脾淋巴细胞增殖能力明显下降，与空 栽体组比较有统计学意义(P<0. 05) ; 400ng/kg基因疫苗组脾淋巴细 胞增殖能力较空栽体组却有升高现象；其余3组差别不明显(P>0. 05 )。 而各实验组在仅加入PHA刺激时其淋巴细胞都发生增殖，但各组之间 差别无统计学意义(P>0. 05)，结果见图10。实施例7真核表达载体pcDM-CC0L2A1用作基因疫苗施用后CIA
大鼠血清中抗CII抗体水平的变化血清中抗n型胶原抗体的检测质粒注射两周后，从尾部静脉 取血，离心后储藏-20iC备用。本实验采用商用的ELISA试剂盒(Rats IgG Anti-Type II Collage"ntibody Assay Kit, Chondrex， USA)。结果CIA大鼠注射pcDNA-CC0L2A1作为基因疫苗后6周，尾部 取血分离血清，通过ELISA试剂盒检测血清中抗CII抗体浓度的变化， 结果详见表1.由此可见200ng/kg基因疫苗组的抗CII抗体水平明显 低于空载体组(P<0. 05)，而20ng/kg基因疫苗组与空载体组相比变 化不大(P〉0. 05)，但400ng/kg基因疫苗组却显著升高(P<0. 05).表1. pcDNA-CC0L2A1作为基因疫苗免疫6周后CIA大鼠血清中 抗CII浓度(n-8， ；土s)______基因质粒剂量D(490nm)吸收光密度关节炎组1. 365 ± 0. 133空栽体对照组(100ug )1. 367 ± 0, 21820pg/kg pc瓶-CC0L2Al1.492 ±0.134200叫/kg pcDNA-CC0L2Al0. 674 ± 0. 046*400叫/kg pcDM-CC0L2Al2. 744 ± 0. 600注血清1:1000稀释，与空栽体组比较，*P<0. 05实施例8真核表达载体pcDNA-CC0L2A1用作基因疫苗施用后CIA 大鼠血清和脾细胞培养液中细胞因子的变化血清和脾细胞培养液中TGF-P 1、 ，-oc、 IL-IO、 IL-4的检测: 均采用双抗夹心ELISA试剂盒(R&D Systems, Inc)。为了探讨pcDNA-CCOL2A1作为基因疫苗治疗CIA大鼠的相关机制， 我们采用ELISA检测了 pcDNA-CC0L2Al基因疫苗治疗前后CIA大鼠血 清和脾细胞培养液中几种相关细胞因子水平的变化.结果表明，在注 射pcDNA-CC0L2Al基因疫苗后6周，200pg/kg基因疫苗组CIA大鼠 血清中的TGF-p水平明显增高(P<0.05) ， TNF-ot浓度则显著降低
(P<0. 05)，而20pg/kg和400ng/kg基因疫苗組以及空载体组间则 无显著变化(P>0. 05);此外在各实验组CIA大鼠血清中我们均没能 检测到IL-10和IL-4，结果详见表2。表3显示pcDNA-CC0L2Al基因疫苗治疗6周后CIA大鼠脾脏2 x 106/ml经100pg/ml的nCCII刺激72小时后培养液中这几种细胞因 子浓度的变化。结果表明，200网/kg基因疫苗组CU脾细胞培养液 中的TGF-p和IL-10水平明显增高(P<0. 05) ， TNF-ct浓度显著降低(P<0. 05)，而IL-4的浓度在各组之间无明显变化(P>0. 05);而上 述细胞因子在20ng/kg和400ng/kg基因疫苗组以及空栽体组间则无 显著变化(P>0. 05)。表2. pcDNA-CC0L2Al基因^苗免疫6周后CIA大鼠血清中细胞因子浓度的变化(n=8，基因质粒剂量TNF-oc,pg/ml TGF-p，pg/ml IL-10，pg/迈l IL-4, pg/ml关节炎組66.0± 23.020.6 ±1.700空栽体对照组(100ug )66. 5 ± 18. 9 20. 4 ±1.60020pg/kg pcDNA-CC0L2Al61. 8 ± 15. 2 22. 2 ±1.500200ng/kg pcDNA- CC0L2A115.1±11.1* 49.3±2.2*00400pg/kg pcDM- CC0L2A171. 5 ±33. 2 24. 8 ±1.700注血清1: 500稀释，与空栽体组比较，*P<0. 05表3. pcDNA-CCOL2Al基因疫苗免疫6周后CIA大鼠脾细胞培养液 中细胞因子浓度的变化(n=8， ^s)基因质粒刑量TNF-<x，pg/ml TGF-P，pg/迈1 IL-10，pg/mlIL-4， pg/ml关节炎组58. 7 ±22.119.6±2. 6140. 7 ±38. 511. 0±2. 5空栽体对照組(100ug )56. 3 ±19. 820. 3±1.9138. 6 ±20. 610. 8 ±3.120叫/kg pcDM-CCOL2Al50. 8 ±12. 221.6±1.8130. 8 ±33. 210. 6 ±2.12(%g/kg pcDNA- CC0L2A114. 0±9.1*40. 3±5.1*210. 6 ±31.1*12. 2 ±3. 3400pg/kg pcDNA- CC0L2A162. 5 ±27, 223.7±1.6120. 9 ±25. 511. 7 ±3. 3
注脾细胞通过lOt^g/ml的nCCII刺激72小时后收集培养液 与空载体组比较，*P<0. 05 序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院附属医院 <120> —种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗及其用途 <130> IDC060059 <勝5<170〉 Patentln version 3.3<210> 1<211〉 4844〈212〉 DNA<213〉 artificial<220〉<223〉 cDNA <400〉 1gttatggata tgcatggacg tcgtccacca cgccgcccgc cccgctccgc cgctctcctc accgcgcagg accgcgacct ccgacaacct gatattaaag atgttgtagg accccgaggg cagggacagc g鄉ggaccg tggcgagaag agggatggag犯cccggcac ccctggaaac ggcccccccg gacttggtgg aaactttgcg gcgggtggag CgC卿tggg tgtC3tgC3gccccctggcc ccactggcgc acctggtcccggcgaacccg gcgctgctgg tccgatgggtcccggtgacg atggtgagac aggcaaacccccccagggcg ctcgtggctt ccctgggeictcgttccgccg ctctcctcct catgcacggc 60ctcctcctcc tccttctcac ggccgccgca 120ggcccca,agg gacagaaggg agaacccgga 180cctccaggac cacagggccc agc鄉agag 240gggg卿鄉gtgctcctgg cccccgtggg 300ccaggccccc ccggtccccc cggacctcct 360gcgc卿tgg cgggcggctt cgeitg柳eig 420ggacccatgg gccctatggg accccgcggc 480cagggatttc卿gcaaccc cggtgagccc 540ccccggggac ctccgggacc acctgggaaa 600ggca组ctg gtgaacgtgg cccccccggc 660cctggtctcc ccggagtgaa gggccaccga 720 ggctaccccg gtttggatgg tgccaaagga gaggcggggg ctcctggagc ca柳gtgaa 780tctggttcac cgggtgagaa cggctccccc ggccccatgg gaccccgtgg gctgcccgga 840gagcgaggac gtcccggccc ctccggcgcc gccggtgctc gtggcaatga cggtctccct 900ggccctgctg gaccccctgg acccgtcggc cctgccggag cccccggctt ccccggagcc 960cccggttcaa鄉gtg卿c cggccccact ggtgcacggg gtcccgaggg tgccc卿ga 1020ccccgcggcg犯tccggcac ccccggctct cccggccccg ctggcgcacc cggtaaccca 1080gggactgatg gcatccccgg tgccaagggc tcggcgggtg ccccgggcat tgcaggcgct 1140ccaggattcc ccggcccacg cggccccccc ggaccccaag gtgccaccgg accactggga 1200cccaaaggac agacgggcga acccggcatc gcaggcttca agggcgagca aggaccgaag 1260ggcg卿cgg gccccgcagg acccca鄉t gcccccgggc cggctggtga gg"ggc犯g 1320agaggagctc gtggtgaacc tggtgccgcc ggccctgtgg gcccccccgg agaaaggggc 1380gctcctggca accgtggatt ccccgggcag gacgggctgg ccggacccaa gggtgctcca 1440ggtgaacgcg gccccgctgg tctcgccggt cccaaaggtg ccaccggtga ccccggacgt 1500cccggagagc ccgggctgcc cggagcgagg ggtctcaccg gccgccccgg cgatgcggga 1560cctc犯ggca aagtcggccc犯ctggtgct cctggcgeigg atggccgccc cggccccccc 1620ggacctcagg gtgctcgtgg gcagcctggt gtgatgggtt tccccggtcc caaaggcgct 1680aatggtgagc ctggaaaagc tggagagaaa ggactgcccg gcgccccagg gctgcggggt 1740ctgcctggca aggatgggga gacgggagct gccggccccc ctggacccgc tggtcctgtg 1800ggtgagagag g卿gcaagg agcccccggt ccttccggct tccagggact gcccggacca 1,ccaggtcccc ctgggg卿g cggcaaaccc gg柳ccagg gtgttcctgg ag犯gccggt 1920gcccccggtc UgUggtxc cagaggtgaa cgtggattcc ccggtgaacg cggctctccc 1980ggtgcccaag ggctgcaggg tccccgtggg ctccccggaa cgcccggcac tgacggaccc 2040
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1.一种重组核酸构建体，其含有与表达调控序列有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO1)。
2. 权利要求1的重组核酸构建体，其中所述表达调控序列选自CMV 立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR 和小鼠金属硫蛋白I。
3. —种重组表达栽体，其含有与选自pcDM3.1 ( + ) 、 pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44、 pXTl、 pSG、 pSVK3、 pBPV、 pMSG、 pSVL和腺病毒的 真核表达载体有效连接的CC0L2A1基因(SEQ ID NO : 1 )。
4. 一种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗，其包含权利要求l所述 的重组核酸构建体。
5. 权利要求1所述的重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎 的DNA疫苗的用途。
6. —种治疗类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效 量的权利要求1所述的重组核酸构建体或权利要求4所述的DNA疫苗，
全文摘要
本发明涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体pcDNA3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO1)。本发明还涉及含有与真核表达载体pcDNA3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因组成的重组表达载体。本发明还涉及所述重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎的DNA疫苗的用途，以及包含上述重组核酸构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。本发明进一步的还涉及治疗类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述DNA疫苗。
文档编号C12N15/11GK101130091SQ20061011139
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者奚永志, 宋新强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院附属医院