专利名称：Ptd、hif的odd与肿瘤抑制基因的融合表达及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和药学领域，具体涉及利用基因工程技术表 达人类肿瘤抑制基因p53与转导肽和氧依赖性蛋白降解结构域的融合蛋白。
背景技术：
作为肿瘤抑制基因，p53参与负调节细胞生长，诱导细胞凋亡。 p5 3以四聚体的形式参与凋亡、细胞周期抑制、DNA损伤与修复及衰老 等过程。P53蛋白通过诱导编码三个跨膜蛋白Fas、 DR5和PERP，形成 死亡诱导信号复合物激活caspases,导致凋亡发生，形成外部凋亡信 号途径。内部凋亡信号途径与线粒体去极化和释放细胞色素c有关， 主要由Bcl-2家族蛋白完成。Bc1-2家族包括Bcl-2、Bax、Noxa、PUMA、 Bid等，它控制着线粒体细胞色素C的释放。由于p53在机体的生长、发育、分化中的重要作用，p53失活将 严重影响细胞基因组的稳定，而基因突变是p53失活的最重要机制， 人类恶性肺瘤中至少50%发生了 p53基因改变，如肺癌，食管癌， 胃癌，肝癌，结直肠癌，乳腺癌，卵巢癌等，据统计约80%为错义突 变，6%为无义突变，10°/。为缺失和插入，细胞不能合成正确的p53蛋白， 丧失原有的生物学功能。绝大多数的p53误义突变位于其DNA结合域， 可导致p53丧失与DM结合的能力，并且对常规治疗产生抵抗作用。 此外，突变的p53蛋白(mutant type p53， mt p53 )还可能获得新的 功能，如能与Daxx结合抑制Fas i秀导的凋亡途径；与醌氧化还原酶1 牢固结合，从而抑制泛素化非依赖的降解作用。p53基因突变的研究为p53基因治疗提供了基础，以p53功能为 基础的肿瘤药物研究成为多年来的研究热点。例如应用腺病毒载体
进行p53基因治疗，在动物实验和临床研究中都取得了肯定性的抗肿 瘤药效。但是使用栽体的安全性、基因表达水平的调控及其对病人毒 性作用等问题还没有完全解决。导入wt p53蛋白是在肺瘤细胞中重建 p53功能最直接的手段。p53蛋白均可进行原核表达制备，外源性补充野生型p53蛋白或 其活性调节分子，可直接发挥它们的肿瘤抑制作用。此方法避免了基 因治疗的载体安全性问题，剂量可调，也同样能达到体内表达p53基 因的抗肿瘤，增加放、化疗效果的目的。然而，p53发挥作用的部位 在细胞内，如何将p53转导进入肿瘤细胞，以及如何避免其对正常细 胞的毒性，相对延长它们在肺瘤细胞内的半衰期成为p53靶向性发挥 其抗肿瘤作用的关键。蛋白转导域(protein transduction domin, PTD )是近年来发 现的一种能高效穿过生物膜的结构域，称为转导肽。1988年Green和 Frankel首次报道了 HIV-1的反式激活蛋白TAT能够跨膜导入细胞内 部，进一步发现其aa47-57作为PTD在蛋白转导过程中发挥主要作用。 已经发现的PTD主要来源于病毒蛋白，如VP22和TAT等，被广泛地应 用于多种生物分子的转运，如抗原肽，肽核酸，反义寡核苷酸，全长 蛋白，甚至纳米粒和脂质体。转导肽可以有效地将多种生物分子转导进入靶细胞却是不容争议 的事实。原核表达的蛋白质多为变性蛋白，可以大量制备、易于纯化 和储存，而且变性的蛋白分子所具有的松散、不固定空间结构反而有 利于蛋白转导肽将其转导进入细胞。已有结果显示转导肽TAT转导变 性蛋白的效率要明显高于活性蛋白，且非活性蛋白进入细胞以后可以 通过细胞内的纠错机制而复性。利用PTD的跨膜转导特点，将原核表达PTD-P53融合蛋白转导进 入肿瘤细胞，增强或重建的P53功能即可发挥调节细胞周期、诱导肿 瘤细胞凋亡的作用。我们在细胞实验中也证实了 PTD与P53融合蛋白 可诱发肿瘤细胞凋亡。然而，PTD转运蛋白高效进入细胞的同时，缺 乏进入细胞的选择性，P53在杀伤肺瘤细胞的同时，也可能对正常细 胞造成伤害。实体瘤细胞恶性增殖与血液供应失衡的一个重要病理特征是缺 氧，临床上已有许多证据表明，在缺氧环境下肺瘤细胞发生一系列适 应性变化，同时使放射线的间接杀伤作用减弱，使之对放疗、化疗耐 受，而且使肿瘤更具有侵袭性，容易发生远处转移。缺氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1， HIF-1)是细胞适应缺氧的重要转录 因子，参与缺氧时相应靶基因的调控。可被HIF-1转录激活的把基因 均含有一个低氧反应元件(hypoxia reactive element, HRE)及Cis 作用调节序列，在人类肿瘤中可以发现这些基因产物大大增加。HIF-l 在其中的功能可分为以下几种①促进糖酵解；②促进血管生成；③ 与瘤细胞增殖有关。HIF-1属于bHLHPAS蛋白族，由HIF-la和HIF-lj3各两个亚单位 组成的杂四聚体蛋白，两个亚单位的分子量分别为120ku和91-94ku。 HIF-la对氧的依赖性较强，当周围环境的氧浓度下降时，HIF-la表达 增加。不缺氧时HIF-la蛋白容易降解，其半衰期小于5分钟，而缺氧 可以增加HIF-la蛋白的稳定性，HIF-la蛋白的降解阻止。亚单位 HIF-ip对氧的依赖性较弱，在HIF-1中也必不可少，因为只有在两个 亚单位聚合并且发生适应性变化后，与其要调节的下游因子或酶(如VEGF、 P53和EPO)的HRE结合，才能发挥调节作用。在研究HIF-1的降解调控时发现，HIF-la的氧依赖性蛋白降解结 构域(oxygen-dependent degradation domain, ODD)是HIF-la稳定 的重要元件，非缺氧状态时，HIF-1多聚羟化酶 (HIF-1 prolyhydroxylase, HIF PH)羟化ODD核心脯氨酸 (Pro 564 )，使 得 pVHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product)与 HIF-la亚基结合，进而多聚遍在蛋白化HIF-la,最终使其被蛋白酶降 解，而在缺氧条件下，由于缺少氧原子(必需来自氧分子)使HIFPH 失活，以上的反应过程被阻断。HIF-la的ODD含有203个氨基酸残基，Harada等发现ODD的 aa548-603可以发挥对其融合蛋白的降解调控作用，其中aa557-574
含调节融合蛋白降解所必需的最小核心成分，可使TAT-ODD-Gal在移 植了人胰癌CF/PAC-1的裸鼠瘤体内的Gal活性明显增高，而正常组织 内几乎检测不到Gal的活性，说明ODD发摔了氧诱导作用，加速了外 来蛋白在正常组织内的降解，其融合蛋白在发挥抗肿瘤作用的同时， 可最大限度地减少对正常组织的伤害。肿瘤靶向治疗是抗癌药物研究中的重要内容，本发明从肿痛细胞 的特点入手，在TAT和p53融合蛋白中引入ODD,加速融合蛋白在正 常细胞内的降解，相对延长其在肿瘤细胞内的半衰期达到P53蛋白靶 向抗肿瘤的目的。发明内容本发明旨在将具有潜在治疗作用的基因与可以转导蛋白进入细胞 的蛋白转导域、加速融合蛋白在正常组织中代谢的氣依赖性蛋白降解 结构域进行有机的融合，通过原核表达载体表达融合蛋白，经过蛋白 的純化和复性，提供一种可以进入肿瘤细胞，在正常组织中快速代谢， 而在缺氧的实体瘤组织中诱导细胞凋亡的融合蛋白，达到预防或/和治 疗肿瘤的目的。为实现上述目的，本发明提供一种蛋白转导域、氣依粮性蛋由降 解结构域和人肿瘤抑制基因的融合体。所述人肿瘤抑制基因可以是具 有对肺瘤抑制作用的基因中的任一种，其最优选基因为p53基因。在 优选的实施方案中，该融合体定义为PTD-ODD-p53，其序列为ATGTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGACGTATGAACCCATTTTCTACTCGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAA AACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGA CGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAG AGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTAA(SEQ ID NO: 1),其中残基1-36为HIV-l的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT );残基37-207为缺氧诱导因子序列；残基208-1386为p53基因序列；残基1387-1389为终止密码子序列。上述融合体编码的融合蛋白为PEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDIDNO: 2),其中残基l-12为HIV-l的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT);
残基13-69为缺氣诱导因子依赖性蛋白降解结构域序列；残基70-462 为p53蛋白序列。本发明还将所述融合体插入表达载体中，该表达栽体是将由DM 克隆技术构建的原核表达栽体与上述融合蛋白基因表达盒相结合，构 建成一个能在原核细胞中扩增、繁殖，表达的肿瘤抑制蛋白的融合序 列。该表达栽体可以是原核表达栽体的任一种，其优选栽体为 pET28a。在一个优选实施方案中，本发明的融合体插入栽体后得到 pET-PTD-ODD-P53。本发明还涉及所述融合蛋白的表达、纯化及复性方法，包括将 编码所述融合蛋白和His标签的质粒，如pET质粒，转化宿主菌 BL21(DE3),培养在25匸~42°C，取出活化菌液，以5%~20%的比例 在新鲜培养基中培养至0D600值为0.5~2. 0，加入浓度为O. 4-lmM的 诱导剂IPTG，诱导时间为3 24h，收集诱导表达的菌体，PBS洗净，用 pH8. 5 ~ 11. 5的10mmol/L Tris緩沖液重悬菌体，振荡混匀，置冰上超 声10~ 15min破菌，然后回收包涵体。用6-IOM尿素溶解，用镍柱或层 析柱纯化包涵体。采用连续梯度法复性目的蛋白。还在另 一方面，本发明提供了所述融合蛋白用于制备治疗实体瘤 的药物中的用途。本发明特别涉及含有所述融合蛋白的药物组合物， 为选自适于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、 器官注射和胸腔、腹腔内注射的剂型。
图l: pET-PTD-ODD-P53构建示意图；图2: pET-PTD-ODD-P53经EcoR I和Sal I双酶切鉴定,其中 标签l，pET-P53; 2， pET-PTD-P53; 3， pET-PTD-ODD-P53 M， DM Marker分别为500， 1000， 2000， 3500， 5500， 7000bp; 图3: pET-PTD-ODD-P5 3表达结果，其中标签l，含pET28a菌；2 标准蛋白分子量；
图4: PTD-ODD-P5 3 Western结果，其中TOP为PTD-ODD-P53， TP为PTD-P53。实施例本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明。这些实施例只是说 明性的，不应当理解成限制本发明的范围，实施例l制备p53基因取人胎总RNA lpg，按cDNA synthesis systenll作指南依次加入 反应成分.反应总体积20pl， 421C反应15mifl后，95D灭活5min，作为 PCR棋板.以P7: GAGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTC(SEQ ID NO: 3); P4: CCGTCGACTTAGTCTGAGTCAGGC(SEQ ID NO: 4)为引物，PCR人全长p53基因，分别取栽体pET28a和p53 PCR片段，用EcoR I和Sal I进行双 醉切，371C 3h再用凝胶回收试剂盒回收，pET栽体片段与p53片段以1: 3 的比例混合，加3U的T4连接酶，161C反应16h，将反应产物转化于感受 态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR養定，阳性克隆 命名为pET-p53.将pBT-p53质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中.实施例2制备PTD-ODD-P53基因以实施例1中p53 PCR片段为模板，以P8: GAGAATTCATGTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGACGTGCTATGGAGGAGCC (SEQ ID NO: 5) ; P4为引物进行PCR，经1X电泳后凝胶回收片段 (PTD-P53).用BcoR I和Sal I双醉切片段PTD-P53， 37X: 3h后用凝胶闳收试 刑盒回收，EcoR I和Sal I双睐切的pET栽体片段与PTD-P53片段以l:3 的比例混合，加T4连接睐，161C反应16h，将反应产物转化于感受态大 麻杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定.阳性克隆命名 为pBT-PTD-P53.将pBT-PTIHP53质粒转化于感受态大场軒酋BL21中 采用重叠延伸法构建PTD-ODD-P53基因NO: 6 ) ; P2 :TCATCATCCATTGGGATATAGGGAGCTAACATCTCCAAGTCTAAAGCACGTCTACGTTG GCG(SEQ IDN0:7)等量混合，加入PCR反应体系，反应30次，经2%电泳 后凝胶回收片段(Pl+P2)。以实施例1中p53 PCR片段为模板，以P3:P4为引物进行PCR，经1%电泳后凝胶回收片段(P3+p53)。将片段(Pl+P2)与片段(P3 + p53)等量混合，以P1、 P4为引物 进行PCR,经1%电泳后凝胶回收片段(PTD-ODD-P53)。用EcoR I和Sal I双酶切片段PTD-ODD-P53， 37'C 3h后用凝胶回 收试剂盒回收。EcoR I和Sal I双酶切的pET载体片段与PTD-ODD-P53 片段以1:3的比例混合，加T4连接酶，16。C反应16h,将反应产物转化 于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定(图 1、图2)。阳性克隆命名为pET-PTD-0DD-P53,其中PTD-ODD-P53的序 列如SEQ ID N0:1所示。将pET-PTD-ODD-P53质粒转化于感受态大肠 杆菌BL21中。实施例3.制备PTD-ODD-P53融合蛋白1. PTD-ODD-P53的表达分别挑取转化pET-PTD-ODD-P53的阳性菌落置LB培养液中(含卡拉 霉素60 g/ml)活化，再按5-20%接种于2YT培养液中，培养至OD600为 0. 5 ~ 2. 0时，加入O. 4 ~ lmM IPTG诱导表达(图3 )。收集诱导表达3 ~ 24h的菌体,PBS洗净。2. PTD-ODD-P53的Western鉴定经诱导表达获得的融合蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分 析表明沉淀中有目的蛋白，其分子量与理论值相符。经Western印迹， 用P53单克隆抗体鉴定分析为PTD-ODD-P53(图4)。测序表明其具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
3. 包涵体洗涤用磷酸緩冲液(pH7.6)重悬，超声破菌，41C 10000 rp姐离心， 沉淀部分用O. 5-4M尿素，100咖ol/L NaC1，20 m咖l/L Tris-HCl (pH 8. 0)洗涤4iC过夜。4. 包涵体溶解及复性以10000转/分离心15分钟，收集沉淀，用6-10旭ol/L尿素(溶于 20咖ol/L三羟甲基胺基甲烷緩沖液pH 8. 0-12. 0 )溶解，緩慢加入等体 积复性液(含20画1/L Tris ， lmmol/L EDTA， 0. lmmol/L GSH; 0. 01mol/L GSSG ) ， 12000转/分离心15分钟，取上清装入 8000-12000透析袋，置4-12X:中采用连续梯度透析法透析至复性液， 用生理盐水透析3次。实施例4. PTD-0DD-P53活性测定 1) PTD-ODD-P53过细胞膜试验将实施例3获得的PTD-ODD-P5 3融合蛋白加入SW480中，2h后以抗 P53单克隆抗体为一抗做免疫组织化学检测，对照組分别用PTD-P53、 P53加入SW480中，结果表明，PTD-ODD-P53、 PTD-P53能进入细胞内， 并以细胞核中分布为主。还研究了常氧条件下PTD-ODD-P53对细胞的影响，乏氣条件下 PTD-ODD-P53对细胞的影响，以及PTD-0DD-P5 3对荷瘤动物的影响。发明效果利用基因工程、蛋白质纯化等手段，制备出具有穿膜活性、在缺 氣环境中稳定及其他生物学活性的多重活性肽，并指导制备出具有药 用价值的生物栽体药物，PTD-ODD-P53在体外缺氧环境可以抑制肿瘤细 胞生长，在体内可以抑制移植瘤在小鼠体内的生长，延长小鼠的存活 时间。用于人类多种实体瘤的治疗，具有重要的医学研究及临床使用 价值。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 <120> PTD、 HIF的ODD与肿痼神制基因的融合表达及其应用 <160> 8<210> 1<211> 1389<212> DNA<213>基因融合体PTD~ODD-p53的序列<400〉 1ATGTACGGCCGTMAAAGAGACGCCAACGTAGACGTATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCMGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGMACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAMACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCMTGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGMGCTCCCAGMTGCCAGAGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGMATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGMGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTAA 1389<210> 2<211> 462<212>氨基酸序列<213〉 PTD-0DD-p53编码的融合蛋白〈400> 2MYGRKKRRQR RRMNPFSTQD TDLDLEMLAP YIPMDDDFQL RSFDQLSPLE SSSASPESAS PQSTVTVFQM EEPQSDPSVE PPLSQETFSD LWKLLPENNV LSPLPSQAMD DLMLSPDDIE
QWFTEDPGPD EAPRMPEAAP RVAPAPAAPT PAAPAPAPSW PLSSSVPSQK TYQGSYGFRL GFLHSGTAKS VTCTYSPALN KMFCQLAKTC PVQLWVDSTP PPGTRVRAMA IYKQSQHMTE WRRCP冊ER CSDSDGLAPP QHLIRVEGNL RVEYLDDRNT F朋SVVVPYE PPEVGSDCTT IHYNYMCNSS CMGG隨RPI LTIITLEDSS GNLLGRNSFE VRVCACPGRD RRTEEENLRK KGEPHHELPP GSTKRALPNN TSSSPQPKKK PLDGEYFTLQ IRGRERFEMF RELNEALELK DAQAGKEPGG SRAHSSHLKS KKGQSTSRHK KLMFKTEGPD SD 462<210> 3 <211〉 25 <212〉 DNA <213〉 引物P7 <400> 3GAGAATTCAT GGAGGAGCCG CAGTC 25<210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> 引物P4 < 4CCGTCGACTT AGTCTGAGTC AGGC 24<210>5<211>58<212>DNA<213>引物P8<400>5GAGAATTCAT GTACGGCCGT AAAAAGAGAC GCCAACGTAG ACGTGCTATG GAGGAGCC 58<210〉 6<211> 43<212> 薩<213> 引物Pl<400> 6GAGAATTCAT GTACGGCCGT AAAAAGAGAC GCCAACGTAG ACG 43 188<210〉 7<211> 62<212> DNA<213> 引物P2<400〉 7TCATCATCCA TTGGGATATA GGGAGCTAAC ATCTCCAAGT CTAAAGCACG TCTACGTTGGCG 62<210〉8<211>46<212〉隠<213>引物P3<婦8TCCCAATGGA TGATGACTTC CAGTTAGCTA TGGAGGAGCC GCAGTC 4权利要求
1、一种基因融合体，其由蛋白转导域(PTD)、缺氧诱导因子(HIF-1)的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)、人肿瘤抑制基因组成。
2、 如权利要求l的基因融合体，其中PTD选自HIV-1反式激活蛋白中 的蛋白转导区(TAT)、果蝇触角蛋白同源结构域和单纯疱疹病毒VP22蛋 白的蛋白转导序列。
3、 如权利要求l的基因融合体，其中ODD可以是氧依赖性蛋白降解 结构域的全长序列或其中的任何一部分序列片断。
4、 如权利要求l的基因融合体，其中人肿瘤抑制基因为p53。
5、 如权利要求l的基因融合体，其具有SEQ ID N0:1的序列。
6、 由权利要求1-5中任一项的基因融合体编码的融合蛋白。
7、 权利要求6的融合蛋白，其具有SEQ ID NO: 2的序列。
8、 一种基因构建体，其含有权利要求1-5中任一项的基因融合体， 以及表达载体。
9、 权利要求8的基因构建体，其中所述表达载体为原核表达载体， 优选pET28a。
10、 权利要求8或9的基因构建体，其中基因融合体的上游为真核细 月包启动子、原核细胞启动子或病毒启动子。
11、 权利要求6或7的融合蛋白在制备治疗各种恶性实体肿瘤的药 物中的用途。
12、 权利要求6或7的融合蛋白在制备预防肿瘤的转移和手术切除 后的肿瘤再生的药物中的用途。
13、 一种药物组合物，含有权利要求6或7的融合蛋白，优选为适 于进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注 射和胸腔、腹腔内注射的剂型。
全文摘要
本发明提供蛋白转导域(PTD)、缺氧诱导因子(HIF)的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)和人肿瘤抑制基因的融合体，其表达产物为一个重组融合蛋白。该重组融合蛋白可以抑制肿瘤细胞的生长，在正常细胞中快速代谢，在肿瘤细胞中代谢缓慢，发挥抗肿瘤作用。本发明还提供所述重组融合蛋白的生产方法。
文档编号C12N15/85GK101117635SQ20061011012
公开日2008年2月6日 申请日期2006年7月31日 优先权日2006年7月31日
发明者吴少平, 孙曼霁, 武军华, 王玉霞, 贾培媛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所