专利名称：一种严格缺氧靶向载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和药学领域。具体地讲涉及一种严格缺氣靶 向栽体及其应用。
背景技术：
临床研究表明，缺氧可引起多种心脑血管疾病.研究表明，恶性 肿瘤内存在乏氧细胞。临床上已有许多证据表明，肿癩乏氣细胞的存 在不仅使肿瘤对放化疗的抗拒性增加，而且使肿癍更具有侵袭性，容 易发生远处转移。在乏氧条件下，细胞核产生缺氧诱导因子-l(hypoxia-inducible factor-l， HIF-1 )蛋白水平升高，与靶基因 的结合活性增加，促进其转录，引起一系列细胞对缺氣的反应，现已 发现的HIF靶基因有60多种，它们都具有缺氧反应元件(hypoxia responsive element, HRE) 。 HRE由HIF1结合点(共有序列为5， TACGTGCT3，)和两侧的功能序列构成。HIF1结合点突变导致基因对 缺氣的转录反应丧失。因此，可以利用缺氧反应元件作为启动表达的 控制元件。Shibata等从血管内皮生长因子基因的5，端非翻译区序列 中克隆了 HRE，在低氣诱导下，它与CMV启动子共同调控的荧光素酶 基因表达上升500倍。氧依赖性降解区域(oxygen-dependent degradation domain, ODD)是HIF 1上控制其稳定的关鍵区域。在常 氣条件下，氧依赖的HIF1多聚羟化酶羟化ODD区Pro 564，使得肿瘤 抑制基因产物(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product, pVHL)与HIF 1亚基结合，激活pVHL介导的泛素-蛋白酶途径，最终 使其被蛋白酶降解，故蛋白半衰期小于5 min;而在缺氧条件下，由 于缺少氧原子(必需来自氧分子)而使得HIF1多聚幾化酶幾化失活， 以上的反应过程被阻断，蛋白可稳定存在。 本发明的目的，在于制备一种新型真核栽体，在其启动子上游建入HRE，控制下游基因在缺氧条件下表达，在效应基园前融入ODD，使 表达的蛋白在缺氣条件下穗定，在常氣条件下降解，以期达到严格缺 氣耙向控制的作用，为提高药物到缺氧病灶的靶向性，更好发挥治疗 作用。
发明内容
在一方面，本发明提供一种新型真核基因构建体，在其启动子上 游插入HRE，在效应基因前插入ODD，从而使该基园构建体具有严格缺氧靶向性。满足这一要求的HRE可以是血管内皮生长因子基因、红细胞生成 素基因来源的，可以是其单拷贝、可以是多拷贝，其序列可以为 TACGTGCT ( SEQ ID NO: 1)。本发明的ODD优选具有序列 ATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATAT CCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCANO: 2)或其功能性片段，翻译后的氨基酸序列为FQ ( SEQ ID NO: 3 )。本发明基因构建体中的效应基因可以是EGFP或P53基因。 另一方面，本发明提供了含有上述基因构建体的表达载体。 还在另一方面，本发明提供了所述的基因构建体在制备用于治疗 缺氧性疾病如肿瘤、心血管病的药物中的用途。还涉及含有上述基因 构建体的药物组合物，其为适于进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、 肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的刑型。
图1: pVAX-HRE-ODD构建示意困；图2: pVAX-HRE经Sma I和Bgl II双酶切鉴定，其中 M: DNA Marker,分别为100， 200, 300， 400， 500， 600bp; 图3: pVAX-HRE-ODD经Hind III和BamH I双酶切鉴定，其中 M: DNA Marker , 分别为 100， 200， 300， 400， 500， 600bp; HD: pVAX-HRE-ODD;图4: pVAX-HRE-ODD - EGFP经BamH I和Not I双酶切鉴定，其 中标签l， pVAX-BGFP; 2， pVAX-HRE-EGFP; 3， pVAX-HRE-ODD-EGFP;M， DNA Marker分别为500， 1000， 2000， 3500， 5500， 7000bp;图5: pVAX-HRE-ODD-P53经BamH I和Not I双酶切鉴定，其 中标签1，pVAX-P53; 2， pVAX-HRE-P53; 3， pVAX-HRE-ODD-P53;M， DNA Marker分别为500， 1000， 2000， 3500， 5500， 7000bp实施例本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明。这些实施例只是说 明性的，不应当理解成限制本发明的范围。实施例1构建pVAX-HRE栽体委托生物公司合成HRE基因，其DNA序列如下，两端分别含SmaI 和Bgl II酶切位点CCCGGGCTGCAGGAATTCGATGCACGCGTCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAA CCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCTCGAGA CTTGACGCGTCCGGGTACCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTG CAGCCGGGTATCTGGCGTACGTGCTGCAGCTCGAGACTTGACGCGTCCGGGTAGCTGGC GTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTG CTGCAGCTCGAGATCT ( SEQ ID NO: 4 )。分别取栽体pVAX和HRE片段，用Sam I和Bgl II进行双酶切， 分别经1%和2%的凝胶电泳，用凝胶回收试刑盒回收备片段。将pVAX 栽体片段与HRE片段以1: 3的比例混合，加T4连接酶，16t:反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的癣落，提 质粒酶切鉴定(图l、图2).阳性克隆命名为pVAX-肌E。实施例2.构建pVAX-HRE-0DD栽体委托生物公司合成ODD基因，其DNA序列如下，两端分別含Hiiid III和BamH I酶切位点AAGCTTATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAG CTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCA TTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATT CCAGGATCC ( SEQ ID NO: 5 )。分别取栽体pVAX-HRE和ODD片段，用Hind III和BamH I进行双 酶切，分别经1%和2%的凝胶电泳，用凝胶回收试刑盒回收各片段，将 pVAX-HRE栽体片段与ODD片段以1: 3的比例混合，加T4连接酶，16 C反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成 功的菌落，提质粒酶切鉴定(图3)。阳性克隆命名为pVAX-HRE-ODD。实施例3.构建pVAX-HRE-ODD-EGFP栽体以 pEGFP-Nl 为模板， EGFP-P1: 5 ， GCAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3， (SEQ ID NO: 6) ; EGFP-P2: 5， GCAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA3， (SEQ ID NO: 7 )为引物,进 行PCR反应30个循环，经1%凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收EGFP 的PCR片段。分别取栽体pVAX、 pVAX-HRE、 pVAX-肌E-ODD和EGFP的PCR片段， 用BamH I和Not I进行双酶切，经1%凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒 分别回收pVAX、 pVAX-HRE、 pVAX-HRE-ODD和EGFP片段。分别将pVAX、 pVAX-亂pVAX-HRE-ODD载体片段与EGFP片段按1: 3的比例混合， 加T4连接酶，16TC反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a 中，挑取转化成功的菌落，提质粒酶切鉴定(图4)。阳性克隆分别 命名为pVAX-EGFP、 pVAX-HRE-EGFP 、 pVAX-HRE-ODD-EGFP。
实施例4.构建pVAX-HRE-0DD-P53栽体本人已构建成功pET28a-P53质粒(插入了 P53基罔的pET28a质 粒)，P53基因两端分别舍BamH I和Not I酶切位点，将pET28a-P53质粒经BamH I和Not I酶双酶切，经1%凝胶电泳， 用凝胶回收试剂盒回收P53片段。分别将pVAX、 pVAX-HRB、 pVAX-HRE-ODD栽体片段与P53片段按1: 3的比例混合，加T4连接酶， 16t:反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化 成功的菌落，提质粒酶切筌定(图5)。阳性克隆分别命名为pVAX-P53、 pVAX-HRE-P53、 pVAX-HRB-ODD-P53。实施例5. pVAX-HRE-ODD-EGFP栽体在常氧及缺氣细胞中的表达 1. pVAX-HRE-ODD-BGFP栽体在常氧状态下在细胞中的表达 转染前一天，用不含抗性培养液调SW480细胞至l-4xl05/ml， 24 孔板种0. 5ml/孔，转染时细胞长至90-95%满；用不含血清培养液分别 稀释pVAX、 pVAX-EGFP、 pVAX-HRE-EGFP、 pVAX-HRE-0DD-EGFP质粒至 160jig/ml，轻轻混匀;将Lipofectamine 2000(Lipo)混匀后，按1: 24 比例用无血清培养液稀释，"分钟内完成下一步；将稀释后质粒分别 与Lipo等量混匀，室温放置25分钟，24孔板中每孔加入100m 1混 合物，前后晃动培养板至混匀；37"C培养4-6小时后换液，18-48小 时后荧光镜下观察EGFP荧光(图6 )。结果显示pVAX质粒转染后SW480细胞无荧光，pVAX-EGFP转染 的细胞荧光最强最多，pVAX-HRE-EGFP转染的细胞有荧光，但较 pVAX-EGFP转染的细胞少，pVAX-HRE-ODD-EGFP转染的细胞无荧光。另外还研究了 pVAX-HRE-ODD-EGFP栽体在缺氧状态下在细胞中的 表达。实施例6. pVAX-肌E-ODD-P53栽体在常氧及缺氣状态卞对细胞的影响
以与实施例5类似的方法研究了 pVAX-HRE-ODD-P53栽体在常氣 状态下对细胞的影响，以及pVAX-肌E-ODD-P53栽体在缺氣状态下对细 胞的影响，发明效果利用基因工程手段构建出新的真核表达栽体，将缺氣反应元件构 建在真核表达栽体启动子上游，控制下游基因在缺氣条件下表达；在 表达蛋白的N-端融合氣依赖性降解区域，使表达蛋白在常氣条件下快 速降解，在缺氣组织中稳定存在。将具有不同功能的表达蛋白基因构 建在栽体中，使其发挥严格缺氧靶向作用。P53基因及其它肿瘸杀伤 基因构建入栽体可用于多种缺氣肿瘸的治疗；其他保护性基因构建入 栽体可用于各种缺血、缺氧性疾病的防治，具有重要的医学研究及临 床使用价值。
序列表<110〉中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 <120> —种严格缺氧靶向载体及其应用<藤8<210〉 1<211〉 8<212> 醒<213〉冊E核心序列<400> 1TACGTGCT 8<210〉 2 <211〉 171 <212> DNA <213〉 0DD序列 <400> 2ATGAACCCAT TTTCTACTCA GGACACAGAT CCAATGGATG ATGACTTCCA GTTACGTTCC TCCGCAAGCC CTGAAAGCGC AAGTCCTCAATTAGACTTGG AGATGTTAGC TCCCTATATC TTCGATCAGT TGTCACCATT AGAAAGCAGT AGCACAGTTA CAGTATTCCA G 171<210〉 3<211> 57<212〉氨基酸序列<213> ODD的氨基酸序列<400> 3MNPFSTQDTD LDLEMLAPYI PMDDDFQLRS FDQLSPLESS SASPESASPQ STVTVFQ 57<210> 4 <211〉 307 <212〉 DNA<213>两侧带酶切位点的HRE <400> 4CCCGGGCTGC AGGAATTCGA TGCACGCGTC TAGCTGGCGT ACGTGCTGCA GCCGGGTAGC GCGTCCGGGT ACCTGGCGTA CGTGCTGCAG GTATCTGGCG TACGTGCTGC AGCTCGAGAC TGCAGCCGGG TAGCTGGCGT ACGTGCTGCA GAGATCTCGGGTAGCTG GCGTACGTGC TGGCGTACGT GCTGCAGCTC CCGGGTAGCT GGCGTACGTG TTGACGCGTC CGGGTAGCTG GCCGGGTAGC TGGCGTACGTTGCAACCGGG GAGACTTGAC CTGCAGCCGG GCGTACGTGC GCTGCAGCTC307<210> 5 <211> 182 <212〉 腿 <213〉两侧带酶切位点的ODD <400〉 5AAGCTTATGA ACCCATTTTC TACTCAGGAC TATATCCCAA TGGATGATGA CTTCCAGTTA AGCAGTTCCG CAAGCCCTGA MGCGCAAGT CCACAGATTTAG ACTTGGAGAT GTTAGCTCCC CGTTCCTTCG ATCAGTTGTC ACCATTAGAA CCTCAMGCA CAGTTACAGT ATTCCAGGAT<210> 6<211> 29<212> 隱<213〉 引物EGFP-Pl<400〉 6GCAGGATCCA TGGTGAGCAA GGGCGAGGA 29<210> <211〉 <212> <213> <400〉731 腿引物EGFP-P2 7GCAGCGGCCG CTTACTTGTA CAGCTCGTCC A 31<210> 8 <211〉 316 〈212〉 DNA <213> HRE的序列 <400> 8TAACATMCC CGGGCTGCAG GAATTCGATG CACGCGTCCG GGTAGCTGGC GTACGTGCTG CAACCGGGTA GCTGGCGTAC GTGCTGCAGC CGGGTAGCTG GCGTACGTGC TGCAGCTCGA GACTTGACGC GTCCGGGTAC CTGGCGTACG TGCTGCAGCC GGGTAGCTGG CGTACGTGCT GCAGCCGGGT ATCTGGCGTA CGTGCTGCAG CTCGAGACTT GACGCGTCCG GGTAGCTGGC GTACGTGCTG CAGCCGGGTA GCTGGCGTAC GTGCTGCAGC CGGGTAGCTG GCGTACGTGC TGCAGCTCGA GATCTG 31权利要求
1、一种基因构建体，其含有缺氧反应元件(HRE)、缺氧诱导因子(HIF-1)的氧依赖性蛋白降解结构域ODD和效应基因，HRE、ODD和效应基因的相互位置关系为HRE-启动子-ODD-效应基因。
2、 权利要求l的基因构建体，其中所述缺氧反应元件的核心序列 来自血管内皮生长因子基因或红细胞生成素基因。
3、 权利要求l的基因构建体，其中缺氣反应元件是羊拷贝或多拷贝的。
4、 权利要求l的基因构建体，其中缺氧诱导困子的氧依賴性蛋白部分序列片断。
5、 权利要求l的基因构建体，其中所述效应基因为任何具有生物 活性的基因。
6、 权利要求l的基因构建体，其中HRE具有序列SEQ ID NO: 8: TAACATAACCCGGGCTGCAGGAATTCGATGCACGCGTCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGC AACCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCTCGAGA CTTGACGCGTCCGGGTACCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCA GCCGGGTATCTGGCGTACGTGCTGCAGCTCGAGACTTGACGCGTCCGGGTAGCTGGCGTAC GTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAG CTCGAGATCTG。
7 、权利要求1的基因构建体，其中所述ODD具有序列SEQ ID NO: 2 。
8、 一种表达载体，其含有权利要求l-7中任一项的基因构建体。
9、 权利要求8的表达栽体，其为真核表达栽体、或质粒或病毒。
10、 权利要求l-9中任一项的基因构建体或表达栽体在制备用于 治疗缺氧型肺瘤或缺血、缺氧疾病的药物中的用途。
11、 一种药物组合物，含有权利要求l-7任一项的基因构建体或权 利要求8-9任一项的表达栽体，优选为适于进行静脉注射、动脉注射、瘤 内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的刑型。
全文摘要
本发明提供一种新型真核基因构建体，在其启动子上游插入HRE，在效应基因前插入ODD，从而使该基因构建体具有严格缺氧靶向性。本发明还提供含有所述基因构建体的载体。本发明另外涉及含有所述基因构建体的药物组合物。
文档编号C12N15/12GK101117637SQ20061011012
公开日2008年2月6日 申请日期2006年7月31日 优先权日2006年7月31日
发明者吴少平, 孙曼霁, 武军华, 王玉霞, 贾培媛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所