专利名称：制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，包括它的表达载体的构建、原核表达和纯化工艺。
背景技术：
心脑血管疾病是严重危害人类健康的重要疾病之一，全世界每天超过一千万人死于心脑血管疾病，我国每年大约有二百六十万人死于心脑血管疾病，而且一般集中在大城市。血栓性的疾病是中老年人的高发病，今后我国将进入老龄化社会，必须对心脑血管疾病的防治提起足够的重视。全世界所需的溶栓药物的潜在市场约为20亿美元。我国国内市场上使用的溶栓药物如链激酶(SK)、尿激酶(UK)、组织性纤维溶酶原激活剂(tPA)等都存在明显不足，例如临床中会产生抗再灌注，再次出现栓塞、出血、过敏等反应。
纳豆是日本的传统食品，食用已经超过千年。纳豆激酶(Nattokinase，简称NK)是1987年日本学者须见洋行博士首先从纳豆中分离纯化出来的。纳豆激酶是纳豆菌发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶，等电点为8.7，由275个氨基酸组成，单链、不含二硫键，分子量为27kD。纳豆激酶在肠道中活性相当稳定，与其它溶栓药相比，除具有较强的溶栓作用外，还具有体内作用时间长、无毒副作用等优点，已经被用作溶栓药物。纳豆激酶能够专一溶解血栓，对纤维蛋白原没有降解活性，大量使用不会引起出血，可以预防和辅助治疗以下病症脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、血栓后遗症、血栓静脉炎、脉管炎等。服用纳豆激酶后，血中优球蛋白溶解时间(ELT)显著延长，纤维蛋白(原)降解产物(FDP)和组织型纤溶酶原激活因子(TPA)明显增加。在急性心肌梗塞患者抢救过程中，采用静脉滴注纳豆激酶，可以迅速溶解血栓，基本没有出血危险性。
目前以纳豆激酶为主要成分作为药品、功能性食品和食品添加剂或者保健品的研发工作进展的非常迅速。但是国际上主要的已经投入生产的纳豆激酶相关产品(日本大和制药“NKCP”，过敏症研究集团“纳豆激酶”，韩国维寿酶公司“维寿酶”等)都是从野生菌或者改良的野生菌发酵液中提取纯化而来的，但是其中天然NK含量非常低(一般小于10％)，使得纯化工艺复杂，产量不高，活性也很低，而且野生菌发酵过程中也容易发生突变，难以持续生产。而利用一般的基因工程的方法重组表达NK基因，会导致NK以包涵体的形式出现在表达产物当中，变性复性又会大幅度提高成本和降低NK的酶活性。所以这类生产工艺导致纳豆激酶产品很难大幅度推广。
发明内容
本发明的目的是提供了一种制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，包括构建含有前导肽序列的纳豆激酶基因(proNK)克隆，加入GST(谷胱甘肽-S-转移酶)蛋白标签和PDI(蛋白质二硫键异构酶)的分子伴侣(包括人与鼠等各种来源的同源蛋白)，从而帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，在序列中内嵌入HIS标签(六个连续的组氨酸，HIS6)和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯。
本发明的纳豆激酶可溶性重组表达工艺是通过如下技术方案实现的1)以Bacillus Subtilis Natto(纳豆枯草杆菌)菌体为模板，根据纳豆激酶全长序列设计引物，通过PCR(聚合酶链反应)的方法获得包含前导肽的全长纳豆激酶基因，称为proNK；在proNK基因的3`末端增加HIS标签序列(六个连续的组氨酸，HIS6)，再将proNK加HIS标签的基因克隆进入pGEX-6P载体(已商业化的原核表达载体)；接着利用PCR将分子伴侣PDI的全长基因克隆出来接到proNK基因的3`末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease蛋白酶(一种序列特异性的蛋白酶，简称PPase)的酶切位点序列(序列为Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，用pp表示)；这样组装成为高效表达载体pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI，简称6pNHP；相应表达出的重组蛋白为GST-pp-proNK-HIS6-pp-PDI；2)6pNHP转化大肠杆菌Rosseta(一种表达菌种)，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导重组基因的表达；同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；然后将两种菌体按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值，低温振荡使PPase将重组蛋白酶切完全，释放出proNK蛋白，从而得到高浓度的含有纳豆激酶的溶液；进行蛋白定量分析和活性测定；4)将含有纳豆激酶的溶液进行纯化处理。
本发明的纳豆激酶的粗纯化的工艺是通过如下技术方案实现的在高浓度的含有纳豆激酶的溶液中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为30％，静置盐析4小时或过夜，12000转/分离心20分钟；取沉淀，用10倍沉淀体积的含有10％甘油的Tris缓冲液将沉淀溶解；12000转/分离心20分钟；取上清。透析过夜，即得到高浓度的纳豆激酶粗品，可进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠变性聚丙烯酰氨凝胶电泳)分析后进行活性测定。
本发明的纳豆激酶的精纯化的工艺是通过如下技术方案实现的在高浓度的含有纳豆激酶的溶液中，直接调整PH值到10，上镍离子亲和柱(Ni-NTAHis-Bind Resin)，用10％甘油的缓冲溶液上柱，25mM咪唑洗脱杂蛋白，100mM咪唑洗脱目的蛋白。透析过夜，即得到高纯度高活性纳豆激酶的精品。进行SDS-PAGE分析和活性测定。
本发明的纳豆激酶的简化重组表达载体的制备工艺是通过如下技术方案实现的1)以Bacillus Subtilis Natto菌体为模板，根据纳豆激酶全长序列设计引物，通过PCR的方法获得包含前导肽的全长纳豆激酶基因，称为proNK；将proNK的基因克隆进入pGEX-6P载体；接着利用PCR将分子伴侣PDI的全长基因克隆出来接到proNK基因的3`末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列，这样组装成为高效表达载体pGEX-6p-proNK-pp-PDI，简称6pNP；相应表达出的重组蛋白为GST-pp-proNK-pp-PDI；2)6pNP转化大肠杆菌Rosseta，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；然后将两种菌体按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值，低温振荡使PPase将重组蛋白酶切完全，释放出proNK蛋白，从而得到高浓度的含有纳豆激酶的溶液；进行蛋白定量分析和活性测定；4)在高浓度的含有纳豆激酶的溶液中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为30％，静置盐析4小时或过夜，12000转/分离心20分钟；取沉淀，用10倍沉淀体积的含有10％甘油的Tris缓冲液将沉淀溶解；12000转/分离心20分钟；取上清；透析过夜，即得到高浓度的纳豆激酶粗品，可进行SDS-PAGE分析后进行活性测定。
PDI伴侣分子对于纳豆激酶的可溶性表达具有关键的辅助作用，而它们和proNK的相对位置是可变的；最终的重组蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，HIS6-proNK-PDI，HIS6-PDI-proNK，以及非重组蛋白的状态(PDI与proNK或NK同时混合于溶液中)均可以提高纳豆激酶的可溶性表达。
GST与PDI伴侣分子的同时存在对于纳豆激酶的可溶性表达具有关键的辅助作用，而它们和proNK的相对位置是可变的；最终的重组蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，proNK-GST-PDI，proNK-PDI-GST，PDI-GST-proNK，PDI-proNK-GST以及非重组蛋白的状态(GST以及PDI与proNK或NK三者同时混合于溶液中)均可以提高纳豆激酶的可溶性表达。
利用本发明的重组表达方案使得纳豆激酶保持可溶解的状态，比包涵体的形式更保持了蛋白酶的活性，也大幅度简化了纯化的步骤，而采用包含有前导肽的纳豆激酶形式更保持了蛋白的稳定性。这样制得的纳豆激酶纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。产物可以制作药物或者口服保健品，利于向大众推广。
图1纳豆激酶基因pGEX-6p-proNK-HIS-pp-PDI的质粒构建图谱。
图2纳豆激酶基因pGEX-6p-proNK-pp-PDI的质粒构建图谱。
图36pNHP酶切鉴定电泳图(HindIII和XhoI双酶切)。
图4显示粗提纯产物中纳豆激酶含量和纯度的SDS-PAGE结果。
图5显示精提纯产物中纳豆激酶含量和纯度的SDS-PAGE结果。
图6显示提纯产物活性的纤维蛋白平板溶圈。
图1、图2中，质粒pGEX-6p的图谱来自商业化的试剂盒，扩增的序列插入其中。
图3中，左边为碱基长度对照，右边为酶切产物的条带。在构建好的载体中间，原有的XhoI酶切位点被SalI中和掉。这样HindIII是proNK的独有酶切位点，XhoI是PDI的独有酶切位点(而且有两个)。所以用这两个酶鉴定构建载体时会放出三条带。1为载体片断，2为proNK基因位于HindIII位点之后的序列和PDI第一个XhoI位点之前的序列总长，3是PDI两个XhoI位点之间的序列。
图4中，从左至右依次是粗提纯纳豆激酶溶液；蛋白质分子量对照。
图5中，从左至右依次是精提纯纳豆激酶溶液；全菌裂解液对照；蛋白质分子量对照。
图6中，各个序号所加样品和对应溶圈面积为
*其中对照为Tris缓冲液对照
具体实施例方式
实施例一纳豆激酶基因表达载体的构建及表达1)取Bacillus Subtilis Natto的冻存菌株1ul接种于5mILB培养基中，37℃，250rpm/min摇动培养基16小时(不可过长，防止形成芽孢)。菌液1∶20稀释，然后取1ul作为PCR模板。设计合成PCR引物，用于扩增proNK基因，PCR引物的5`，3`末端含有限制性内切酶位点；上游引物NKs5`-3` CAT AGATCT GCCGGAAAAAGCAG下游引物NKHISa5`-3`AGA GAATTC GTGATGATGATGATGATG TAATTGTG CAGCTGC引物稀释成50pmol/ul待用。然后利用热启动PCR的方法将proNK-HIS6基因克隆出来PCR反应体系50ulddH2O 40ul10*PCR BUFFER5uldNTP 1ul模板 1ul上/下游引物1ulpfu酶1ulPCR反应条件94℃ 8min94℃ 30s65℃ 30s72℃ 2min40s20循环94℃ 30s55℃ 30s72℃ 2min40s20循环72℃ 10min反应结束之后，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测为与1.1kb左右位置处的一条亮带即为目的基因(proNK-HIS6)的大小。
2)凝胶回收目的基因，用限制性内切酶BamHI和EcoRI将其切成粘性末端，同样处理pGEX-6p载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pGEX-6p-proNK-HIS6载体。
设计PDI的引物，包含酶切位点上游引物PDI-PPs5`-3`TA GAATTC CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC ATGCTGCGCCGCGC下游引物PDI-PPa5`-3`CT GTCGAC CAGTTCATCTTTCACAGPCR反应条件(Tag酶)94℃8min94℃30s65℃30s72℃1min30循环72℃10min琼脂糖凝胶电泳检测PDI条带位于700bp左右，胶回收目的基因，用EcoRl和SalI将基因酶切成粘性末端，接入用EcoRI和XhoI酶切后的pGEX-6p-proNK-HIS6载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI高效表达载体(简写为6pNHP)。
3)将正确的6pNHP质粒转化大肠杆菌Rosseta，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1∶5000加入IPTG储液，30℃培养4-6小时(时间延长会显著提高产量)，离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，同样操作挑选单斑克隆，在5mlLB培养基培养过夜，然后1∶100转接，摇瓶培养37℃至OD为0.6，按照1∶1000加入IPTG储液，30℃培养6小时，离心收集菌体，取适当与6pNHP菌体混合(菌体质量比值约为1∶50)。
4)配制适合保存酶活的缓冲体系Tris6.057g/LNaCl2.925g/LEDTA0.186g/L甘油50ml/L用缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌(可选)，用冰水混合物环境下超声破菌(2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃)，12000rpm/min离心20min，收集上清液。再次调整PH为7.0左右，振荡反应约4h(冰上操作有助于提高产物活性，需要延长作用时间至10h左右，加入DTT有助于优化反应)。这样重组蛋白基本被PPase酶切完全，释放出proNK蛋白。ProNK蛋白自剪切释放出高活性的NK蛋白。此时所得溶液为高浓度的含有纳豆激酶的溶液。
5)表达产物的鉴定首先利用SDS-PAGE鉴定表达产物的浓度样品处理液SDS 1g，Glycerol 5mL，溴酚蓝(BPB)固体痕量，二硫苏糖醇(DDT)2.5mL，B液25mL，加去离子水至50mL取酶切后纳豆激酶溶液10ul，加入2ul样品处理液，至沸水浴5分钟。点样量为5ul/孔。标准蛋白分子量同样处理。用考马氏亮蓝R-250染色。
表达产物的纤溶活性鉴定配制含有纤维蛋白原和凝血酶原的侧活平板，以及用作参比的尿激酶活性梯度溶液(100u，200u，300u，400u，500u)。通过测量溶圈直径可知表达产物活性。
实施例二纳豆激酶原液制备纳豆激酶粗品在含有高浓度纳豆激酶的溶液中，在搅拌的过程中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为30％，静置盐析4小时或冰浴中过夜，12000转/分离心20分钟；取沉淀，用10倍沉淀体积的含有10％甘油的Tris缓冲液将沉淀溶解；12000转/分离心20分钟；取上清。在Tris缓冲液中透析过夜，即得到高浓度的纳豆激酶粗品，可进行SDS-PAGE分析后进行活性测定，活性约为62000u/ml。
实施例三纳豆激酶原液制备纳豆溶液精品在高浓度的含有纳豆激酶的溶液中，迅速调整其PH值到10(注意防止纳豆激酶在其等电点8.7附近聚沉)。配制上柱缓冲液MCAC-0 MCAC-100020mM Tris盐酸PH10.020mM Tris盐酸PH10.00.5M NaCl 0.5M NaCl
10％(v/v)甘油(可调整至20％)10％(v/v)甘油1M咪唑用MCAC-0溶液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)柱材，然后把柱材和纳豆激酶溶液共育，室温(冰上更佳)轻摇30min。然后上柱，分别用MCAC-0和MCAC-50洗脱杂蛋白，最后用MCAC150洗脱目的蛋白。将所得产物透析过夜，即得到高纯度的纳豆激酶精品。进行SDS-PAGE分析和活性检测，活性约为39000u/ml。产物可以用于进一步制作成成品。
实施例四简化重组表达载体制备纳豆激酶粗品按照实施例一和例二的方法制备纳豆激酶粗品，区别在于设计proNK的引物时，在下游引物末端去掉HIS标签序列，具体流程为1)取Bacillus Subtilis Natto的冻存菌株1ul接种于5mlLB培养基中，37℃，250rpm/min摇动培养基16小时(不可过长，防止形成芽孢)。菌液1∶20稀释，然后取1ul作为PCR模板。设计合成PCR引物，用于扩增proNK基因，PCR引物的5`、3`末端含有限制性内切酶位点上游引物NKs5`-3`CAT AGATCT GCCGGAAAAAGCAG下游引物NKa5`-3`TGA GAATTC TAATTGTGCAGCTGCTTGTAC引物稀释成50pmol/ul待用。然后利用热启动PCR的方法将proNK基因克隆出来PCR反应体系50ulddH2O 40ul10*PCR BUFFER 5uldNTP1ul模板 1ul上/下游引物 1ulpfu酶 1ulPCR反应条件94℃8min94℃30s65℃30s72℃2min40s20循环94℃30s55℃30s
72℃2min40s20循环72℃10min反应结束之后，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测为与1.1kb左右位置处的一条亮带即为目的基因(proNK)的大小。
2)凝胶回收目的基因，用限制性内切酶BamHI和EcoRI将其切成粘性末端，同样处理pGEX-6p载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pGEX-6p-proNK载体。
设计PDI的引物，包含酶切位点上游引物PDI-PPs5`-3`TA GAATTC CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC ATGCTGCGCCGCGC下游引物PDI-PPa5`-3`CT GTCGAC CAGTTCATCTTTCACAGPCR反应条件(Tag酶)94℃8min94℃30s65℃30s72℃1min30循环72℃10min琼脂糖凝胶电泳检测PDI条带位于700bp左右，胶回收目的基因，用EcoRI和SalI将基因酶切成粘性末端，接入用EcoRI和XhoI酶切后的pGEX-6p-proNK载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pGEX-6p-proNK-pp-PDI高效表达载体(简写为6pNP)。
3)将正确的6pNP质粒转化大肠杆菌Rosseta，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1∶5000加入IPTG储液，30℃培养4-6小时(时间延长会显著提高产量)，离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，同样操作挑选单斑克隆，在5mlLB培养基培养过夜，然后1∶100转接，摇瓶培养37℃至OD为0.6，按照1∶1000加入IPTG储液，30℃培养6小时，离心收集菌体，取适当与6pNP菌体混合(菌体质量比值约为1∶50)。
4)配制适合保存酶活的缓冲体系Tris6.057g/LNaCl2.925g/LEDTA0.186g/L甘油50ml/L用缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌(可选)，用冰水混合物环境下超声破菌(2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃)，12000rpm/min离心20min，收集上清液。再次调整PH为7.0左右，振荡反应约4h(冰上操作有助于提高产物活性，需要延长作用时间至10h左右，加入DTT有助于优化反应)。这样重组蛋白基本被PPase酶切完全，释放出proNK蛋白。ProNK蛋白自剪切释放出高活性的NK蛋白。此时所得溶液为高浓度的含有纳豆激酶的溶液。
5)在含有高浓度纳豆激酶的溶液中，在搅拌的过程中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为30％，静置盐析4小时或冰浴中过夜，12000转/分离心20分钟；取沉淀，用10倍沉淀体积的含有10％甘油的Tris缓冲液将沉淀溶解；12000转/分离心20分钟；取上清。在Tris缓冲液中透析过夜，即得到高浓度的纳豆激酶粗品，可进行SDS-PAGE分析后进行活性测定，活性约为60000u/ml。
proNK基因的核苷酸序列gccggaaaaagcagtacagaaaagaaatacattgtcggatttaagcagacaatgagtgccatgagttccgccaagaaaaaggatgttatttctgaaaaaggcggaaaggttcaaaagcaatttaagtatgttaacgcggccgcagcaacattggatgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagatccgagcgttgcatatgtggaagaagatcatattgcacatgaatatgcgcaatctgttccttatggcatttctcaaattaaagcgccggctcttcactctcaaggctacacaggctctaacgtaaaagtagctgttatcgacagcggaattgactcttctcatcctgacttaaacgtcagaggcggagcaagcttcgttccttctgaaacaaacccataccaggacggcagttctcacggtacgcatgtcgccggtacgattgccgctcttaataactcaatcggtgttctgggcgtagcgccaagcgcatcattatatgcagtaaaagtgcttgattcaacaggaagcggccaatatagctggattattaacggcattgagtgggccatttccaacaatatggatgttatcaacatgagccttggcggacctactggttctacagcgctgaaaacagtagttgataaagcggtttccagcggtatcgtcgttgctgccgcagccggaaacgaaggttcatccggaagcacaagcacagtcggctaccctgcaaaatatccttctactattgcagtaggtgcggtaaacagcagcgaccaaagagcttcattctccagcgtaggttctgagcttgatgtaatggcccctggcgtgtccatccaaagcacacttcctggaggcacttacggcgcttataacggaacgtccatggcgactcctcacgttgccggagcagcagcgctaattctttctaagcacccgacttggacaaacgcgcaagtccgtgatcgtttagaaagcactgcaacatatcttggaaactctttctactatggaaaagggttaatcaacgtacaagcagctgcacaataaproNK蛋白的氨基酸序列AGKSSTEKKYIVGFKQTMSAMSSAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVNAAAATLDEKAVKELKKDPSVAYVEEDHIAHEYAQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLGGPTGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSTSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSDQRASFSSVGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAAULSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAHPDI基因的核苷酸序列atgctgcgccgcgctctgctgtgcctgccgtggcccgccctggtgcgcgccgacgcccccgaggaggaggaccacgtcttggtgctgcggaaaagcaacttcgcggaggcgctggcggcccacaagtacccgccggtggagttccatgccccctggtgtggccactgcaaggctctggcccctgagtatgccaaagccgctgggaagctgaaggcagaaggttccgagatcaggttggccaaggtggacgccacggaggagtctgacctagcccagcagtacggcgtgcgcggctatcccaccatcaagttcttcaggaatggagacacggcttcccccaaggaatatacagctggcagagaggctgatgacatcgtgaactggctgaagaagcgcacgggcccggctgccaccaccctgcctgacggcgcagctgcagagtccttggtggagtccagcgaggtggccgtcatcggcttcttcaaggacgtggagtcggactctgccaagcagtttttgcaggcagcagaggccatcgatgacataccatttgggatcacttccaacagtgacgtgttctccaaataccagctcgacaaagatggggttgtcctctttaagaagtttgatgaaggccggaacaactttgaaggggaggtcaccaaggagaacctgctggactttatcaaacacaaccagctgccccttgtcatcgagttcaccgagcagacagccccgaagatttttggaggtgaaatcaagactcacatcctgctgttcttgcccaagagtgtgtctgactatgacggcaaactgagcaacttcaaaacagcagccgagagcttcaagggcaagatcctgttcatcttcatcgacagcgaccacaccgacaaccagcgcatcctcgagttctttggcctgaagaaggaagagtgcccggccgtgcgcctcatcaccttggaggaggagatgaccaagtacaagcccgaatcggaggagctgacggcagagaggatcacagagttctgccaccgcttcctggagggcaaaatcaagccccacctgatgagccaggagctgccggaggactgggacaagcagcctgtcaaggtgcttgttgggaagaactttgaagacgtggcttttgatgagaaaaaaaacgtctttgtggagttctatgccccatggtgtggtcactgcaaacagttggctcccatttgggataaactgggagagacgtacaaggaccatgagaacatcgtcatcgccaagatggactcgactgccaacgaggtggaggccgtcaaagtgcacggcttccccacactcgggttctttcctgccagtgccgacaggacggtcattgattacaacggggaacgcacgctggatggttttaagaaattcctagagagcggtggccaagatggggcaggggatgttgacgacctcgaggacctcgaagaagcagaggagccagacatggaggaagacgatgaccagaaagctgtgaaagatgaactgtaaPDI蛋白的氨基酸序列MLRRALLCLPWXALVRADAPEEEDHVLVLRKSNFAEALAAHKYPPVEFHAPWCGHCKALAPEYAKAAGKLKAEGSEIRLAKVDATEESDLAQQYGVRGYPTIKFFRNGDTASPKEYTAGREADDIVNWLKKRTGPAATTLPDGAAAESLVESSEVAVIGFFKDVESDSAKQFLQAAEAIDDIPFGITSNSDVFSKYQLDKDGVVLFKKFDEGRNNFEGEVTKENLLDFIKHNQLPLVIEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQELPEDWDKQPVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVFVEFYAPWCGHCKQLAPIWDKLGETYKDHENIVIAKMDSTANEVEAVKVHGFPTLGFFPASADRTTVIDYNGERTLDGFKKFLESGGQDGAGDVDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAVKDEL
权利要求
1.一种制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，其特征在于构建含有前导肽序列的纳豆激酶基因克隆，加入GST蛋白标签和PDI的分子伴侣帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，在序列中内嵌入HIS标签和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯，以及生物活性的鉴定，具体方法为1)以Bacillus Subtilis Natto菌体为模板，根据纳豆激酶(Nattokinase，简称NK)全长序列设计引物，通过PCR的方法获得包含前导肽的全长纳豆激酶基因，称为proNK；在proNK基因的3′末端增加HIS标签序列(六个连续的组氨酸，HIS6)，再将proNK加HIS标签的基因克隆进入pGEX-6P载体；接着利用PCR将分子伴侣PDI的全长基因克隆出来接到proNK基因的3′末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶切位点序列(序列用pp表示)，这样组装成为高效表达载体pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI，简称6pNHP；相应表达出的重组蛋白为GST-pp-proNK-HIS6-pp-PDI；2)6pNHP转化大肠杆菌Rosseta，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；然后将两种菌体按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值，低温振荡使PPase将重组蛋白酶切完全，释放出proNK蛋白，从而得到高浓度的含有纳豆激酶的溶液；进行蛋白定量分析和活性测定；4)将含有纳豆激酶的溶液进行纯化处理。
2.如权利要求1所述的制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，其特征在于在高浓度的含有纳豆激酶的溶液中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为30％，静置盐析4小时或过夜，12000转/分离心20分钟；取沉淀，用10倍沉淀体积的含有10％甘油的Tris缓冲液将沉淀溶解；12000转/分离心20分钟；取上清；透析过夜，即得到高浓度的纳豆激酶粗品，可进行SDS-PAGE分析后进行活性测定。
3.如权利要求1所述的制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，其特征在于在高浓度的含有纳豆激酶的溶液中，调整PH值到10，然后上镍离子亲和柱(Ni-NTAHis-Bind Resin)，用10％甘油的缓冲溶液上柱，25mM咪唑洗脱杂蛋白，100mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到高纯度高活性纳豆激酶的精品；进行SDS-PAGE分析和活性测定。
4.如权利要求1或2所述的制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，其特征在于构建含有前导肽序列的纳豆激酶基因克隆，加入GST蛋白标签和PDI的分子伴侣帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，在序列中内嵌入蛋白酶切位点帮助目的蛋白提纯，以及生物活性的鉴定；HIS标签对于粗纯化纳豆激酶溶液不是必须的，这样就可以简化序列构建方案，具体方法为1)以Bacillus Subtilis Natto菌体为模板，根据纳豆激酶全长序列设计引物，通过PCR的方法获得包含前导肽的全长纳豆激酶基因，称为proNK；将proNK的基因克隆进入pGEX-6P载体；接着利用PCR将分子伴侣PDI的全长基因克隆出来接到proNK基因的3′末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶切位点序列(序列用pp表示)，这样组装成为高效表达载体pGEX-6p-proNK-pp-PDI，简称6pNP；相应表达出的重组蛋白为GST-pp-proNK-pp-PDI；2)6pNP转化大肠杆菌Rosseta，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；然后将两种菌体按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值，低温振荡使PPase将重组蛋白酶切完全，释放出proNK蛋白，从而得到高浓度的含有纳豆激酶的溶液；进行蛋白定量分析和活性测定；4)在高浓度的含有纳豆激酶的溶液中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为30％，静置盐析4小时或过夜，12000转/分离心20分钟；取沉淀，用10倍沉淀体积的含有10％甘油的Tris缓冲液将沉淀溶解；12000转/分离心20分钟；取上清；透析过夜，即得到高浓度的纳豆激酶粗品，可进行SDS-PAGE分析后进行活性测定。
5.如权利要求1所述的制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，其特征在于PDI伴侣分子对于纳豆激酶的可溶性表达具有关键的辅助作用，而它们和proNK的相对位置是可变的；最终的重组蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，HIS6-proNK-PDI，HIS6-PDI-proNK，以及非重组蛋白的状态(PDI与proNK或NK同时混合于溶液中)均可以提高纳豆激酶的可溶性表达。
6.如权利要求1所述的制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，其特征在于GST与PDI伴侣分子的同时存在对于纳豆激酶的可溶性表达具有关键的辅助作用，而它们和proNK的相对位置是可变的；最终的重组蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，proNK-GST-PDI，proNK-PDI-GST，PDI-GST-proNK，PDI-proNK-GST以及非重组蛋白的状态(GST以及PDI与proNK或NK三者同时混合于溶液中)均可以提高纳豆激酶的可溶性表达。
全文摘要
一种制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法，特别是涉及纳豆激酶表达载体的构建、表达和纯化工艺，解决了一般的基因工程重组表达的方法导致纳豆激酶以包涵体的形式出现在表达产物当中的问题。本发明方法包括表达全长的带有前导肽的纳豆激酶基因以提高活性，加入重要的分子伴侣PDI帮助蛋白正确折叠、利用GST标签提高蛋白可溶性、利用硫酸铵沉淀法快速提纯产品、加入HIS蛋白标签帮助产物进一步纯化等等。这样的纳豆激酶产品纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。产物可以制作药物或者口服保健品，利于向大众推广，成为新一代的溶栓产品。
文档编号C12N9/12GK1995343SQ20061016805
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者李慧洁, 杨秀桃 申请人:李慧洁, 杨秀桃