专利名称：重组共表达维生素k环氧化物还原酶亚基1以提高依赖维生素k的蛋白质表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种宿主生物体，其含有编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VK0RC1) 的重组核酸和编码依赖于维生素K的(VKD)蛋白质的重组核酸，其中重组VK0RC1和重 组VKD蛋白质在所述宿主生物体中都得到表达。本发明还涉及一种包含细胞的细胞培养系 统，该细胞含有所述重组核酸。本发明还涉及一种提高在宿主生物体中表达重组VKD蛋白 质的生产率的方法，该宿主生物体在合适的体系中进行培养。
背景技术：
维生素K环氧化物还原酶复合体(VKORC)重复利用还原形式的维生素K，该维生 素K形式是依赖于维生素K的(VKD)蛋白质翻译后Y-羧基化必需的辅助因子(Nelsestuen, G. L., Zytkovicz， T. H., & Howard, J. B. (1974) The mode of action of vitamin K Identification of gamma- carboxyglutamic acid as a component of prothrombin. J. Biol. Chem.， 249, 6347-6350)。 最近，VKORC1基因得到了鉴定，并且被Rost等于2004年进行了详细描述(Rost，S.,Fregin， A., Ivaskevicius, V.， Conzelmann, E,， Hortnagel, K.， Pelz, H. J.， Lappegard, K., Seifried， E.， Scharrer, I" Tuddenham， E. G., Muller， C. R., Strom, T. M., & Oldenburg, J. (2004) Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2. Nature, 427, 537-541)。
VKD蛋白质含有Y-羧基化谷氨酸(gla)残基，该残基表现出特异的生物化学和生理 学特性，类似于依赖于Ca的结合凝血因子带负电磷脂膜的特性(Mann, K.G.， Jenny, R. J.，& Krishnaswamy, S. (1988) Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes. Annu. Rev. Biochem., 57, 915-956) 。 VKD蛋白质包括促凝血的因子II、 VII和x，以及抗凝血的蛋白质c、 s和z。虽然限定为一种单独的己知酶促反应，但在所有 哺乳动物组织中都发现有Y-羧化酶活性(Vermeer, C. & de Boer-van den Berg MA (1985) Vitamin K-dependent carboxylase. Haematologia (Budap), 18， 71-97) 。 y-羧化酶使用还原的维生 素K作为辅助因子来催化羧基化反应。
依赖于维生素K的(VKD)谷氨酸残基，羧基化是一种必要的翻译后蛋白质的改性， 用于产生在止血、培养对照样、体内钙平衡和信号转导中发挥作用的有生物学活性的VKD
蛋白质(Furie B., Bouchard, B. A" & Furie B. C, (1999) Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid. Blood, 93, 1798-1808; Berkner K. L. (2000) The vitamin K-dependent carboxylase. J. Nutr.， 130, 1877-1880)。在这些蛋白质的Gla-结构域N端上的几 个谷氨酸残基进行羧基化改性，以能够使钙依赖性磷脂膜相互作用(StenfloJ. &SuttieJ. W. (1977) Vitamin K-dependent formation of gamma-carboxyglutamic acid. Annu. Rev. Biochem.， 46, 157-172; Suttie J. W. (1980) Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gamma-carboxyglutamic acid. CRC Crit Rev. Biochem., 8， 191-223)。这些多y-谷氨酸(Gla) 残基使得Gla结构域产生构象变化，这对于VKD蛋白质活性和与磷脂膜表面结合活性的组合 而言是必需的(Nelsestuen G. L., Broderius M., & Martin, G. (1976) Role of gamma-carboxyglutamic acid, Cation specificity of prothrombin and factor X-phospholipid binding. J. Biol. Chem., 251， 6886-6893; Zwaal R. F., Comftirius P., & Bevers E. M. (1998) Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta, 1376， 433-453)。
VKD凝血蛋白要求完全的或者接近完全的羧基化以便在有钙离子存在时结合于细 胞膜表面(Furie B. & Furie B. C. (1988) The molecular basis of blood coagulation. Cell, 53， 505-518)。如果维生素K拮抗剂抑制了Y-羧基化，正在羧基化的VKD蛋白质不能形成钙依 赖性结构，这将导致对磷脂膜的低亲和性并且活性较小(EsmonC.T.,SadowskiJ. A.,&Suttie J. W. (1975a) A new carboxylation reaction. The vitamin K-dependent incorporation of H-14-C03-into prothrombin. J. Biol. Chem., 250, 4744-4748; Esmon C. T., Suttie J. W.， & Jackson, C. M. (1975b) The ftinctional significance of vitamin K action. Difference in phospholipid binding between normal and abnormal prothrombin. J. Biol. Chem.， 250, 4095-4099; Malhotra O. P., Nesheim M. E,， & Mann K. G. (1985) The kinetics of activation of normal and gamma-carboxyglutamic acid-deficient prothrombins. J. Biol. Chem.， 260,279-287)。例如，造成 总蛋白质活性损失的原因可能归因于活化的人类蛋白质C缺少VKD蛋白质的10个Gla残基 中的任 一 个(Zhang L., Jhingan A.， & Castellino F. J. (1992) Role of individual gamma-carboxyglutamic acid residues of activated human protein C in defining its in vitro anticoagulant activity. Blood, 80， 942-952)。在血友病B病人身上发现，正在羧基化的因子IX 突变体缺少促凝血活性，这可以归因于钙诱导的构象变化的降低和结合磷脂囊泡能力的损失 ((Ware, J., Diuguid D. L.， Liebman H. A., Rabiet M. J., Kasper C. K., Furie B. C., Furie B., & Stafford, D. W. (1989) Factor IX San Dimas. Substitution of glutamine for Arg-4 in the propeptide leads to incomplete gamma-carboxylation and altered phospholipid binding properties. J. Biol.Chem.，264, 11401-11406)。
对重组因子IX而言，研究表明，在中国地鼠卵巢细胞中表达功能性因子IX会被在 较高生产水平上的羧基化能力饱和这一事实所限制(Kaufman, R. J., Wasley L. C., Furie B. C.， Furie B.， & Shoemaker C. B. (1986) Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem., 261 , 9622-9628; Derian C. K.， VanDusen W., Przysiecki, C. T.， Walsh P. N., Berkner K. L., Kaufman, R. J., & Friedman, P. A. (1989) Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases block aspartyl beta-hydroxylation of recombinant human factor IX in several mammalian expression systems. J. Biol. Chem" 264, 6615-6618)。
此外，当培养介质中有过剩的维生素K可利用时，对于人类因子IX，显示出？羧基化蛋白质的重组过量表达，导致前肽裂解受到限制并且限制以更高的分泌速率进行，羧基化， 这样生产出仅部分具有gla残基的蛋白质。这会导致具有还原活性的VKD重组蛋白质变体分 泌出来。向培养基中添加维生素K不会以高表达水平提高因子IX活性。研究显示，要得到 活性因子IX，对于细胞培养基中维生素K的需要在5ng/ml时达到饱和。低于该水平，中国 地鼠卵巢(CHO)细胞分泌的活性因子IX的量取决于维生素K浓度(Kaufman, R. J., Wasley， L. C., Furie， B. C., Furie， B.， & Shoemaker, C. B. (1986) Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem., 261， 9622-9628)。
到目前为止，低表达水平的细胞系必须进行选择才能用于生产，以便克服这些对修 饰翻译后VKD蛋白质的细胞能力的限制。弗林蛋白酶、前肽裂解酶的共表达会导致该前肽 完全裂解(Wasley, L. C., Rehemtulla， A., Bristol, J. A., & Kaufman, R. J. (1993) PACE/ftirin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway. J. Biol. Chem.， 268, 8458-8465)，但是不涉及Y-羧基化的提高。另一个方法是y-羧化酶过量表达，对 于因子IX，其不会导致蛋白质分泌提高(Rehemtulla, A.， Roth, D. A., Wasley， L. C., Kuliopulos, A.， Walsh, C. T., Furie， B., Furie, B. C., & Kaufman, R. J. (1993) In vitro and in vivo fiinctional characterization of bovine vitamin K-dependent gamma-carboxylase expressed in Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 4611-4615)。在羧基化反应期间结合于羧化酶的 因子IX分子，不能被有效地释放。可得到如下结论，在Y-羧基化位点，还原性维生素K形 式的供应是该反应的限制步骤(Hallgren， K. W., Hommema, E. L., McNaIIy, B. A., & Berkner, K. L. (2002) Carboxylase overexpression effects full carboxylation but poor release and secretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependent proteins. Biochemistry, 41, 15045-15055)。
因此，人们非常需要使表达稳定化，尤其是使宿主生物体内的VKD蛋白质重组表达 稳定化，该宿主生物体以提高的表达VKD蛋白质的分泌速率和/或活性来生产VKD蛋白质。发明内容
因此，本发明的一个目的是提供新的系统和方法，以提高经由VKORCl共表达来表 达VKD蛋白质(尤其是重组VKD蛋白质)的生产率。
本发明涉一种宿主生物体，其含有编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VKORCl)或 其功能活性衍生物的重组核酸、以及编码依赖于维生素K的(VKD)蛋白质或其功能活性衍 生物的重组核酸，其中重组VKORCl和重组VKD蛋白质在所述宿主生物体中都得到表达。
本发明进一步涉及一种细胞培养系统，其包含含有编码VKORCl或其功能活性衍生 物的重组核酸和编码VKD蛋白质或其功能活性衍生物的重组核酸的细胞，其中重组VKORCl 和重组VKD蛋白质在所述细胞中都得到表达；本发明还涉及一种通过重组共表达VKORCl 来提高在宿主生物体中表达重组VKD蛋白质或其功能活性衍生物的生产率的方法；本发明 还涉及一种在宿主生物体或细胞培养系统中重组表达VKORCl的的应用，以提高表达重组 VKD的生产率。
本发明的一个方面涉及一种宿主生物体，其含有编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VKORCl)或其功能活性衍生物的重组核酸、以及编码依赖于维生素K的(VKD)蛋白质 或其功能活性衍生物的重组核酸，其中重组VKORCl和重组VKD蛋白质在所述宿主生物体 中都得到表达。
在此使用的术语"功能活性衍生物"，是指其生物机能基本上分别与VKORCl和 VKD蛋白质相同的任何多肽。该功能活性衍生物的多肽序列可以包括氨基酸的缺失、添加和 /或取代，该氨基酸的缺失、存在和/或取代都不会对多肽活性产生任何实质性的负面影响，例 如该氨基酸位于多肽序列中对蛋白质生物活性无贡献的部分上。不改变所述多肽生物活性的 各个多肽序列上少量的氨基酸缺失、添加和/或取代，也作为功能活性衍生物包括在本申请中。
在下文中术语"(重组)VKORCl或其功能活性衍生物"和"(重组)VKD蛋白质 或其功能活性衍生物"也分别称为"(r) VKORCl"和"(r) VKD蛋白质"。
通过本技术领域任何已知用于生产重组核酸的方法，例如通过重组DNA技术、RNA 逆转录和/或DNA扩增技术或者经由细菌繁殖的技术，可以得到本发明的重组核酸。
本发明的宿主生物体可以源自于任何能够表达生物学活性rVKORCl和生物学活性 rVKD蛋白质的宿主生物体，包括重组宿主生物体。特别地，本发明的宿主生物体可以是真 核宿主生物体，包括多细胞生物体，其特征在于能够生产有药理学活性的rVKD蛋白。
在本发明的一种实施方式中，宿主生物体是哺乳动物细胞，例如该细胞来源于选自 由CHO细胞、HEK293细胞、NSO细胞、SP20细胞、Perc.6细胞、SkHep细胞、HepG2细 胞、BHK细胞、Hela细胞、Vero细胞和COS细胞所组成的细胞组的哺乳动物细胞株。在本 发明的具体实施例中，宿主生物体是衍生于CHO细胞或HEK293细胞的细胞。
在本发明的一种实施方式中，包含或者同时包含于本发明的宿主生物体的编码 rVKORCl的核酸或编码rVKD蛋白的核酸，经由选自由诱导表达、瞬时表达和固定表达所组 成的模式组的表达模式而得到表达。可以使用本技术领域己知的任何表达系统或者商品表达 系统，用于编码VKORC1和/或VKD蛋白质的重组核酸表达，包括使用调节系统比如合适的、 可很好控制的启动子、增强子等。
在本发明的宿主生物体的优选实施方式中，将编码VKORC1的重组核酸或编码VKD 蛋白质的重组核酸、或者将二者同时稳定地整合入本发明宿主生物体的遗传物质中。
本发明的宿主生物体可以用于提高rVKD蛋白的表达水平，该rVKD蛋白比如是血 液因子或其功能活性衍生物，优选人类促凝血的或抗凝血的血液因子或其功能活性衍生物。 在本发明的一种优选实施方式中，rVKD蛋白是药理学上可接受的人体促凝血因子，其可以 用于出血病症的治疗。
作为本发明的例子，rVKD蛋白是促凝血因子，包括因子II、因子VII、因子IX和因 子X，优选人类因子IX;或者是抗凝血因子，包括蛋白质C、蛋白质S和蛋白质Z。
根据本发明，宿主生物体含有编码VKORC1的重组核酸和编码VKD蛋白质的重组 核酸,其中rVKORCl和rVKD蛋白在所述宿主生物体中都得到表达，并且其中表达重组VKD 蛋白质的生产率有实质性的提高。
在此使用的术语"其中表达重组VKD蛋白质的生产率有实质性的提高"是指与不 进行rVKORCl共表达的宿主生物体内表达rVKD蛋白的情况相比，重组表达的VKD蛋白质 或其功能活性衍生物的数量、分泌速率、活性和/或稳定性有实质性的提高。
通过本技术领域任何已知的方法，包括例如从培养介质中分离、或者通过收获宿主 生物体，并对表达蛋白进行分析例如进行电泳分析、色层分析、或免疫吸附，可以确定表达 重组VKD蛋白质的生产率的提高。在本发明的一种优选实施方式中，经由任何已知的酶免 疫测试方法比如酶联免疫吸附测试(ELISA)，来检测rVKD蛋白的表达。作为选择之一，
通过测定活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)，可以评价rVKD蛋白的完整性和活性。
本发明的另一个方面涉及一种细胞培养系统，其包含含有编码VK0RC1的重组核酸 和编码VKD蛋白质的重组核酸的细胞，其中rVKORCl和rVKD蛋白在所述细胞中都得到表 达。
本发明的细胞培养系统可以包括任何细胞培养系统，其含有能表达生物活性 rVKORCl和生物活性rVKD蛋白的细胞。上文已列举了该细胞的合适例子。在一种优选实施 方式中，本发明的细胞培养系统是真核细胞系统，其特征在于可以生产一种或多种药理学活 性的rVKD蛋白。
在本发明的一种实施方式中，本发明的细胞培养系统包括如上限定的宿主生物体。
对本发明的细胞培养系统中用于培养细胞(包括以连续方式或分批方式培养细胞) 的培养基、试剂和培养条件没有具体限制。在本发明的一个实施方式中，细胞在无血清、或 者无血清及蛋白质的条件下进行培养。在本发明的另一种实施方式中，所采用的条件是使含 有编码VKORC1或VKD蛋白质的重组核酸的细胞选择性地增殖，例如使用选择性培养基。
已被经选择的宿主生物体细胞表达的、以及取决于所用转染/载体系统的预期rVKD 蛋白包含于细胞中，或者分泌到培养细胞用培养基中，可以使用本技术领域已知的方法将其 从细胞培养系统中分离/回收。
本发明的另一个目的在于提供一种用于提高在宿主生物体中表达的重组VKD蛋白质 的比活性的方法，其包括下述步骤(a) 提供宿主生物体；(b) 将编码VKD蛋白质或其功能活性衍生物的重组核酸插入步骤(a)所述宿主生物体；(c) 将编码VKORCl的重组核酸插入步骤(a)所述宿主生物体；以及(d) 表达步骤(b)和(c)所述重组核酸。
在本发明的一种实施方式中，将编码VKORC1或VKD蛋白质的重组核酸经由共转 染同时地插入宿主生物体中。作为选择之一，通过先后转染依次将所述重组核酸插入宿主生 物体中。
根据本发明使用的重组核酸可以容纳在适合于转染进入含有质粒和病毒载体的宿主 生物体中的任何形式和任何系统中。编码VK0RC1以及VKD蛋白质的重组核酸，可以二者 同时存在于一个载体分子中，也可以各自存在于一个载体分子中，其中两种不同的载体分子 可以相同也可以不同。重组核酸的转染取决于所用的转染系统，并且可以通过本技术领域任 何已知用于转染宿主生物体例如真核细胞的方法或者商业化方法来进行转染，包括电穿孔法、
沉淀法、或者微量注射法。
本发明的另一个方面在于提供一种用于提高在宿主生物体中表达重组VKD蛋白质的 生产率的方法，其包括下述步骤(a) 提供一种编码VKD蛋白质的重组核酸被整合入其遗传物质中的宿主生物体，所述遗 传物质优选基因组；(b) 将编码VK0RC1的重组核酸插入步骤(a)所述宿主生物体；以及(c) 表达步骤(a)和(b)所述核酸。
在本发明的一种优选实施方式中，稳定地表达编码VKD蛋白质的重组核酸。
本发明的另一个目的在于提供一种用于提高在宿主生物体中表达重组VKD蛋白质的生产率的方法，其包括下述步骤-(a) 提供一种编码VKORCl的重组核酸被整合入其基因组的宿主生物体；(b) 将编码VKD蛋白质的重组核酸插入步骤(a)所述宿主生物体；以及(c) 表达步骤(a)和(b)所述核酸。
在本发明的一种优选实施方式中，稳定地表达编码VKORCl的重组核酸。
根据本发明，如上限定的宿主生物体或如上限定的细胞培养系统，可以通过rVKORCl共表达而惊人地提高表达重组VKD蛋白质的生产率。
本发明的另一个目的在于提供一种rVKD蛋白质，该rVKD蛋白质可通过插入编码 VKORCl的重组核酸和编码所述rVKD蛋白的重组核酸、表达所述核酸、以及回收所述rVKD 蛋白来获得。
如下附图为图1显示了在用rVKORCl (1)或空载体(2)瞬时转染CHO衍生的产rFIX的细胞株后， 基于ELISA值计算的以ng/ml计的rFIX浓度(纵轴)(图1A)，和基于凝固活性(APTT) 值计算的以mU/ml计的rFIX比活性(纵轴)(图1B)。在24小时后，收集无血清的细胞 培养上清液。图2显示了在用rVKORCl (1)或空载体(2)瞬时转染CHO衍生的产rFIX的细胞株后， 基于ELISA值计算的以ng rFIX/l()6个细胞/天计的rFIX比生产力(纵轴)(图2A)，和基 于凝固活性(APTT)值计算的以mUrFIX/l()S个细胞/天计的rFIX比活性(纵轴)(图2B)。 在24小时后，收集无血清的细胞培养上清液。
图3显示了在用rVKORC3 (1)或空载体(2)瞬时转染HEK293衍生的产rFIX的细胞 株后，基于ELISA值计算的以ng/ml计的rFIX浓度(纵轴)(图3A)，和基于凝固活性(APTT) 值计算的以mU/ml计的rFIX比活性(纵轴)(图3B)。在24小时后，收集无血清的细胞 培养上清液。图4显示了在用rVKORC4 (1)或空载体(2)瞬时转染HEK29 3衍生的产rFIX的细胞 株后，基于ELISA值计算的以ngrFIX/l(^个细胞沃计的rFIX比生产力(纵轴)(图4A)， 和基于凝固活性(APTT)值计算的以mU rFIX/l(^个细胞沃计的rFIX比活性(纵轴)(图 4B)。在24小时后，收集无血清的细胞培养上清液。图5显示了在用rVKORC5 (1)或空载体(2)瞬时转染CHO衍生的产rFIX的细胞株后 以％计的rFIX比凝固活性值(图5A)、以及在用rVKORCl (1)或空载体(2)瞬时转染 HEK293衍生的产rFIX的细胞株后以。/。计的rFIX比凝固活性值(图5B)。图6显示了在CHO衍生的稳定表达rFVII的细胞株中rVKORCl的瞬时表达。用编码 VKORC1的载体或作为对照的不含VKORCl的相同载体("空载体")瞬时转染该细胞株。 重复进行转染，并且连续地使用5种不同的维生素Kl浓度。图中显示了培养上清液中相应 于维生素K浓度的rFVII的生产率和rFVII活性测定结果。(图6A)是基于ELISA测量值的 生产率值。(图6B)是基于凝固活性测量值的生产率值。(图6C)基于用ELISA测定的每 吗下FVII凝固单位而计算的FVII比活性。图7显示了在CHO衍生的稳定表达rFVII的细胞株以及HEK293衍生的稳定表达rFVII 的细胞株中rVKORCl的瞬时表达。用编码rVKORCl的载体或作为对照的不含rVKORCl的 相同载体("空载体")瞬时转染这些细胞株。重复进行转染。基于ELISA和培养上清液中 FVII及FVIIa凝固性的rFVn生产率和rFVn活性的测量结果如图所示。A)是CHO衍生的 细胞株。B)是HEK293衍生的细胞株。图8显示了在CHO-DHFR-寄主细胞中稳定的rFVII和rVKORC双顺反子共表达。通过 随MTX含量提高的基因共扩增产生所选克隆的rFVII生产率。用编码DHFR'的选择性质粒共 转染两种不同的编码人类rFVII的表达载体。图8A)是用引起rFVII和rVKORCl双顺反子 共表达的载体构建体转染的83个克隆。图8B)是用编码rFVII的载体共转染的133个克隆。图9显示了在用亚克隆和基因扩增进行稳定的转染后所产生的产rFVII的CHO衍生克隆 的生产率和比活性值，包括rFVII单独表达或者rFVII与rVKORCl进行双顺反子共表达的情 况。基于分泌的rFVII的ELISA测试和FVII凝固性测试，对133个未进行共表达的克隆和 83个与rVKORCl共表达的克隆进行了 rFVII生产率和比凝固活性的对比。图10显示了分离于CHO衍生细胞株的mRNA水平的基因表达Northern印迹分析实施例。 泳道l:非CHO-DHFR'转染的细胞株；泳道2: rFVII克隆；泳道3和4:如在实施例4中描 述的依次用rFVII和rVKORCl编码质粒载体转染的两种克隆。泳道5至7:用编码双顺反子 mRNA的单一载体转染的克隆，该mRNA具有如实施例3中描述的经IRES偶联的rFVII和 rVKORCl序歹iJ。区域A、 B和C显示了在与三种不同探针杂交后产生的相同印迹。A)用于 人VK0RC1的探针。B)用于人FVII的探针。C)用于地鼠GAPDH的探针。图中给出了识 别的mRNA的指示和大小。图11显示了稳定转染的CHO衍生细胞克隆和HEK293衍生细胞克隆的rFVII表达水平，这些克隆在用rVKORCl编码质粒或者对照样质粒对产rFVn的细胞株进行第二次转染后分离出来。该对照样是空的宿主载体。生产率值是基于分泌的rFVII的ELISA测试而计算出来的。图11A)是CHO衍生细胞克隆。图11B)是HEK293衍生细胞克隆。图12显示了稳定转染的CHO衍生细胞克隆和HEK293衍生细胞克隆相对于比活性值的rFVII表达水平，这些克隆在用rVKORCl编码质粒或者对照样质粒对产rFVII的细胞株进行第二次转染后分离出来。该对照样是空的宿主载体。生产率值是基于分泌的rFVII的ELISA测试而计算出来的。通过ELISA测定，以FVII凝固性单位每figFVII计算出比活性值。图12A)显示的是CHO衍生细胞克隆，图12B)为HEK293衍生细胞克隆。
具体实施方式
以下用实施例进一步阐明本发明，但并不是对本发明作任何限制。实施例实施例1:在产rFIX的HEK293衍生细胞株和CHO衍生细胞株中瞬时转染并且共表达 的rVKORCl
通过适当的转染方法，将含有人类因子IX (FIX)、编码受强病毒性启动子调控的 DNA序列的表达质粒导入哺乳动物寄主细胞株，使得该细胞具有稳定地整合入其基因组的导 入序列，从而实现重组因子IX (rFIX)的表达。通过传递足够的抗性基因，也使该质粒具有 对可选择的标记药剂的抗性。就CHO细胞而言，因为缺乏核苷酸从头合成路径的酶，其仅能 在培养基中含有核苷酸前体时生长，而这种酶的表达需要二氢叶酸还原酶(DHFR)。这使 得通过逐渐提高氨甲蝶呤(MTX)浓度能够进行FIX基因的共扩增，由此导致在细胞基因组 内编码DHFR和rFIX基因拷贝数都会增加。为此目的，CHO衍生细胞克隆也得在缺乏核苷 酸和核苷酸前体的选择性培养基中进行培养。
为鉴别产人rFIX的细胞，在转染并且向培养基添加选择性药剂后，将细胞悬液进行 稀释，使得能够分离出单细胞衍生克隆。在分离后，培养这些细胞克隆以进行融合，使得能 够通过酶联免疫吸附测试(ELISA)技术测量细胞培养上清液的rFIX含量。为此目的，细胞 得在缺少任何培养促进性胎牛血清或其组分的条件下进行培养，以确保通过细胞分泌的rFIX 来进行鉴别。为确保全功能的rFIX蛋白质，加入维生素K。在24小时后收获上清液，并且 通过rFIX专一性ELISA技术进行分析。另外，通过测定活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)，可以评价蛋白质的完整性和活性。
使用己被选择用于rFIX表达的细胞株，通过瞬时表达技术来完成rVKORCl的共表 达。在不进一步进行克隆选择的条件下，将包含rVKORCl cDNA的表达质粒转染入这些细 胞。从完整的转染细胞池收集上清液，并且将rFIX含量和活性与阴性对照进行对比，使之标 准化为rFIX比分泌速率，来评价rVKORCl活性效果。材料和方法表达载体
根据标准的克隆技术来克隆表达载体。简言之，通过将含有鼠DHFR的载体 pAdD26SV(A)-3 (Scahill, S. J., Devos, R., Van der, H. J., & Fiers, W. (1983) Expression and characterization of the product of a human immune interferon cDNA gene in Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80,4654-4658; vector is a gift by Dr. Hauser, GBF Germany) 的Pstl 1.5 kbp片段插入提供有SV40增强子、早期启动子和内含子的pSVI3载体(Clontech 公司，PaloAlto， Ca)，来产生pSV-DHFR，其中pSV卩载体的P-半乳糖苷酶基因已通过Notl 消化而去除，并且已插入多接头。该载体也已用于通过EcoRI/Hindlll片段与phpAPr-l-卩gal 的EcoRI/Hindlll片段进行交换，来产生含人肌动蛋白启动子和内含子的phact,其中 phpAPr-l-|3gal也是Dr. Hauser的赠品。通过EeoRI消化pFIX-bluescript，产生包含具有alal48 多态性的野生型人FIX cDNA的phact-FIX (McGraw, R. A" Davis, L. M.， Noyes， C, M.， Lundblad, R. L.， Roberts, H. R., Graham, J. B., & Stafford, D. W. (1985) Evidence for a prevalent dimorphism in the activation peptide of human coagulation factor IX. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 2847-2851)，其中pFIX-bluescript是通过将来自于任意的最初人类肝脏cDNA文库的人 体FIX插入pBluescript (Stratagene公司，La JoIIa， CA)、并且将所得片段插入用EcoRI部 分消化的phact而产生的。
载体pCMV-FIX-neo是通过将载体pFIX-bluescript的EcoRI片段插入pCMV卩 (Clontech公司)而产生的，其中(3-gal cDNA已经去除。在该载体内，通过经由PCR的位
点专一突变，将ala密码子交换为thr密码子，使天然多态性alal48变化为thrl48。再将该PCR 产品再次插入相同的载体中。将该载体的EcoRI片段克隆入pcDNA3.1 (Invitrogen公司， Carlsbad, Ca)。得到pCMV-FIX-neo。
通过使用载体pCEP4-VKORCl产生载体pCMV-VKORCl-EDHpro (Prof. Oldenburg 友好提供，其描述参见Rost et al., 2004)作为PCR模板，。将含有rVKORCl cDNA的PCR 产品克隆入pCMV-EDHpro载体((Herlitschka， S. E., Falkner, F. G.， Schlokat, U., & Dorner, F. (1996) Overexpression of human prothrombin in permanent cell lines using a dominant selection/amplification ftision marker. Protein Expr. Purif., 8, 358- 364)。 细胞培养和转染
从哥伦比亚大学(纽约，纽约州)得到CHO DUKX/DXB11细胞，并且在补充有5 % 胎牛血清(PAA， Linz，奥地利)、脱氧腺苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷(皆购自Sigma公司， St Louis, MO)和L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)以及青霉素/链霉素(Invitrogen公司)的 DMEM/Ham's F12 (1:1)混合物(Invitrogen公司)中进行培养。将NEK293细胞(ATCCNo. CRL-1573)在补充有5 %胎牛血清和L-谷氨酰胺及青霉素/链霉素的DMEM/Ham's F12 (1:1) 混合物中进行培养。为进行稳定的转染，使用磷酸钙共沉淀方法。通过用线性化质粒phact-FIX 和pSV-DHFR共转染，并且通过在补充有5 %透析的FBS (PAA)的不含次黄嘌呤、甘氨酸 和胸腺嘧啶核苷的DMEM/Ham's F12( 1:1 )混合物(Invitrogen公司)中进行筛选，形成CHOrFIX 细胞。为进行基因扩增，从10 nM至200 nM逐步增加浓度地加入MTX(Ebewe公司，Unterach， 奥地利)。用线性化质粒pCMV-FIX-neo转染NEK293细胞，并且在含有500 pg/ml G418 (Invitrogen公司)的培养基中进行筛选。通过手工或使用流式细胞术细胞分类技术而进行限 制性稀释克隆技术，分离出细胞克隆。
通过将生长培养基换成补充有10 pg/ml维生素Kl (Sigma公司)的无血清培养基， 检测分泌入细胞培养上清液的FIX。收集上清液，并且通过ELISA和凝固性测试(活化的部 分促凝血酶原激酶时间，APTT)来测定FIX浓度。为计算比分泌速率，使用CASY细胞计 数器(Scharfe Systems公司，Reutlingen，德国)计算细胞数量。
为进行瞬时共表达实验，使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)处理非线 性化质粒pCMV-VKORCl-EDHPro。不含rVKORCl cDNA的相同载体用作阴性对照。 分析方法
使用稀释为1:40000的兔抗人FIX多克隆抗体(Accurate Chemical公司，Westbury，纽约州)作为最初抗体，并且使用羊抗人FIX多克隆抗体-辣根过氧化物酶偶联物作为检测抗
体，进行ELISA。使用来源于人血浆的FIX (Enzyme Research Laboratories, S Lafayette, In) 作为标准。使用STA Compact的自动血凝度计(Diagnostica Stago公司，Asnieres,法国)， 通过将FIX样品稀释入FIX不足的血浆来测定APTT。所有用于凝固的试剂皆购自位于奥地 利维也纳的巴克斯特公司。 结果
对两种稳定的产rFIX细胞株，即CHO-衍生细胞株和HEK293衍生细胞株，用携带 有编码人VKORC1的cDNA的表达载体pCMV-VKORCl-EDHpro进行瞬时转染处理。使用 空载体pCMV-EDHpro和稳定表达rFIX的细胞株作为对照。在瞬时转染后，将细胞留在含血 清培养基中过夜。用PBS洗涤细胞，并且在无血清培养基中培养24小时，然后收获上清液。 通过免疫化学和测定抗原水平或凝固活性的凝血诊断方法，监测FIX表达和其在培养基中的 分泌情况。基于单位细胞数量和24小时的产品浓度(图1至图4)，计算出分泌速率，以估 计其对细胞生产率的影响。
与空载体对照样相比，HEK293细胞表达rFIX的比分泌速率显示出平均增加2.7倍， 并且在rVKORCl转染后，rFIX浓度增加2.9倍。这些值皆基于APTT测量值。而ELISA测 试值显示出浓度增加2.0倍，并且比生产率增加1.8倍。
对于CHO衍生的产rFIX细胞株，研究发现ELISA-滴度增加了 1.5倍，并且基于比 分泌速率的ELISA增加了 1.2倍。经APTT计算的分泌速率提高1.4倍，而经APTT测定的 FIX浓度提高1.7倍。
从这些值可以得出结论，当含有rVKORCl时，两种不同的细胞类型都可以达到更高 的rFIX产品浓度，这主要是因为其具有更高的细胞rFIX比分泌速率。完全？羧基化rFIX分 子的较高分泌速率的一个原因，可能是用于翻译后修饰的细胞质量控制机制(Lin， P. J.， Straight, D. L.， & Stafford, D. W. (2004) Binding of the factor IX gamma-carboxyglutamic acid domain to the vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase active site induces an allosteric effect that may ensure processive carboxylation and regulate the release of carboxylated product. J. Biol. Chem., 279， 6560-6566)。对于两种细胞株，APTT值比ELISA值增加得较高，也表明 了其较好的FIX凝固活性。
rVKORCl对在HEK293衍生细胞中rFIX共表达的影响比对在CHO细胞中rFIX共 表达的影响更强，这可被解释为前者有更高的细胞性rFIX生产率。在VKORCl瞬时转染前， 关于APTT值，293衍生克隆的生产率比CHO克隆的生产率高3.5倍，但关于ELISA值则高5倍。这表明，因为生产率更高，293衍生细胞的翻译后加工程度较低。因此，当通过rVKORCI 共表达来恢复Y-羧基化能力时，在该细胞株上发现有更高收率的活性rFIX同种型。实施例2:在CHO和HEK293衍生的哺乳动物细胞株中瞬时共表达重组人VK0RC1， 稳定生产重组人凝血因子VII (rFVII)
通过在产人重组凝血因子VII (rFVII)的细胞中瞬时共表达，可以研究rVKORCl对 rFVII活性和/或分泌速率的任何影响。这样，大部分产rFVII的细胞群也会短时间共表达 VK0RC1。在该期间内，可以对分泌的rFVII进行取样、表征并且与用空载体对照样并行转 染的相同细胞株所分泌的rFVII相比较。
通过转染质粒载体含有人类rFVII cDNA并且经筛选抗性基因、随后筛选生产性克隆， 可以实现在哺乳动物细胞中稳定表达rFVII。实施例1中所述的相同寄主细胞株可以用于rFVII 的稳定表达。必需进行类似的基因筛选和基因扩增步骤、以及生产性克隆株的筛选。
然后，按与实施例1中描述的同样方法，将携带人VK0RC1 cDNA的表达载体进行 瞬时转染，以实现重组VK0RC1 (rVKORCl)共表达。材料和方法表达载体
通过用来自适当的来源比如牛痘表达载体pselp/huFVII (Himly等，1998)的PCR分 离出人FVIIcDNA作为模板，可以构建包含人rFVII遗传信息的表达载体。可以将PCR产物 经限制性酶切位点插入哺乳动物表达载体，该载体提供有强病毒性启动子比如来自巨细胞病 毒(CMV)的启动子、以及附加的抗生素筛选标记物比如新霉素或潮霉素抗性基因，例如是 pcDNA3.1/hyg+或pcDNA3,l/neo+ (Invitrogen公司，Carlsbad, Ca)。
为在CHO-DHFIT表达系统中稳定表达基因，可以使用附加的质粒比如在实施例1中 描述的pSV-DHFR,以便能够筛选含DHFR-的细胞克隆并且进行MTX基因扩增。
如在实施例1中描述的载体pCMV-VKORCl-EDHpro可以用于rVKORCl瞬时表达。 细胞培养和转染
可以使用在实施例1中描述的相同细胞株和培养方案。为形成稳定的转染子，可以 使用磷酸钙共沉淀方法。在转染之前，质粒得通过限制性内切酶消化进行线性化。含有FVII cDNA的哺乳动物表达载体可以用于CHO或HEK293寄主细胞株的稳定转染。CHO DUKX DXB11细胞必须用pSV-DHFR共转染。如果潮霉素B用作选择试剂，其在培养基中的浓度 应当为100 pg/ml以筛选出HEK293衍生转染子，而对于CHO转染子则为250 ng/ml。如果
新霉素抗性用作筛选标记，则对于每种细胞类型，应调节G418浓度，如同实施例1中的描 述。
瞬时转染方案包括如在实施例1中描述的LipofectamineTM 2000试剂的应用。为了能 够将细胞瞬时表达rVKORCl与合适的阴性对照进行对比，应将载体pCMV-VKORCl-EDHpro 和不含VK0RC1 cDNA序列的相同载体并行地进行重复若干次的转染，优选在6孔板上进行。 以每孔相等的细胞密度分配从相同群落衍生的细胞。进行融合时，所有的转染同时进行。
通过将生长培养基换成补充有浓度变化范围为0.1到10 pg/ml的维生素Kl的无血清 培养基，可以检测分泌入细胞培养上清液的rFVII。在24小时后，可以收集上清液。并且可 以通过下述适当的方法测定rFVII浓度。为计算rFVII比分泌速率，例如应通过使用CASY 细胞计数器(Scharfe Systems公司，Reutlingen，德国)或者台盼蓝排除法对细胞进行计数。 分析测试方法
对于筛选产rFVII的克隆株，并且分析FVII活性与抗原水平的关系，下述测试方法 是适当的
按凝固性测试方法比如测量凝血酶原凝固时间(PT)、或者根据欧洲药典(欧洲药 典5， 2005)按显色分析方法比如测量凝固因子Xa (FXa)产生量，可以测定FVII活性，其 中通过FXa的显色底物转化量对FXa产生量进行定量。通过ELISA测试，使用适当的配对 抗体，例如经亲和纯化的稀释至1:3000以用于捕获的羊抗人FVII多克隆抗血清(Affinity Biologicals公司，Ancaster, Canada)、和用于检测的羊抗人FVII多克隆抗体-辣根过氧化物 酶偶联物(Cedarlane公司，Ontario,加拿大；稀释至1:2000)，接着添加适当的用于光度计 检测的显色试剂，可以测定FVII抗原水平。
对于所有的测试方法，应将源于血浆的FVII制品用作标准材料，该制品的测试是根 据FVII的国际标准测试法97/592。通过计算被测抗原对活性值的比率，并且将这些值相互对 比或者与血浆或其FVII制品的值进行比较，可以估算出有关的比凝固活性。
可以使用下述测试方法估算作为分泌的总rFVII —部分的FVIIa水平:Staclc^测试方 法(Diagnostica Stago公司，Asnieres，法国)适于选择性地测定FVIIa凝血酶原凝固时间 (Morrissey等，1993)。应根据FVIIa的国际标准测试法89/688来测试FVIIa水平。 结果
用编码VKORC1的表达载体pCMV-VKORCl-EDHpro对稳定地产rFVII的CHO衍 生细胞株进行瞬时转染。作为对照，可以使用不含编码VKORC1的cDNA的空载体 pCMV-EDHpro。以每孔"106个细胞的细胞浓度将细胞接种于6孔板。当完成融合时，重复
进行瞬时转染步骤。在孵育过夜后，细胞在不含任何维生素K1的无血清培养基中进行孵育， 以便耗尽由FBS提供的细胞内部蓄积的维生素K1。在24小时后，把培养基换成含有从0到 5 lig/ml的多种浓度范围维生素Kl的无血清培养基。收集上清液用于进一步分析。通过ELISA 测量和单级凝固性测试方法测得的rFVII抗原和活性浓度值，每24小时确定一次生产率。以 FVII凝固单位每吗抗原计算FVII比凝固活性。可以使用Staclot⑧测试方法来估计rFVIIa自 动活化为rFVIIa的程度。这些实验结果如图6A、 6B和6C所示。
在用两种载体构建体瞬时转染后，通过ELISA (图6A)和FVII凝固性实验(图6B) 测定rFVII表达水平。细胞株并没有大量产生rFVIIa,因此rFVII活性可能与rFVII生产率相 关。
培养基不含维生素Kl时，不论有和没有进行rVKORCl共表达，所产rFVII的细胞 生产率和比活性都明显较低。通过凝固和ELISA两种方法测量，发现在rVKORCl共表达情 况下，rFVII生产率恢复至O.l pg/ml ,比用空载体转染作为对照时高4倍。不管维生素Kl 浓度如何，rVKORCl共表达提高了加入细胞培养基中的维生素Kl利用率。 一般来讲，在所 有的维生素Kl浓度下进行rVKORCl共表达，通过两种不同的方法测定的rFVII生产率比对 照样高4倍。以凝固单位每吗所产rFVII来表示的比活性仅在0 pg/ml维生素Kl时显示出 明显较低的值，并且不论有和没有rVKORCl都未显示出显著差异。
在类似实验中，rVKORCl瞬时共表达后，将CHO衍生细胞株和HEK293衍生细胞 株稳定表达rFVII的情况与两种对照样转染情况相比较时，可以发现生产率明显较高(图7)。 该实验中，使用0.5 ng/ml的维生素Kl。对于CHO-rFVII细胞，通过凝固性和ELISA测定可 以发现，rVKORCl共表达的rFVII表达水平相比对照样要高出2.5倍。 [It074] 由此可得出结论，对于rFVII生产率，当该反应所需的维生素K还原形式不能足量 得到时，Y-羧基化是速率限定步骤。 一种假定的细胞控制机理是，在内部细胞中保留rFVII 分子不完全Y-羧基化(Lin等，2004) 。 rVKORCl瞬时共表达，通过更好地提供确保完全？ 羧基化的维生素K还原形式，在较宽的维生素Kl浓度范围内提高了 rFVII生产率。
这些发现再次证明与前述文献一致，即Y-羧化酶共表达会导致在哺乳动物细胞中重 组人因子IX生产率降低(Hallgren等，2002)。在细胞代谢内，迄今VK0RC1仅有的已知 功能是将维生素K的2,3环氧化物还原为Y-羧基化反应所必需的氢醌形式。甚至哺乳动物细 胞株本身也具有全功能的Y-羧基化手段，由此可得出结论，rVKORCl共表达保证了预期的完 全，羧基化的rFVII蛋白质品质。 实施例3:在非病毒性基因转染后，在CHO衍生细胞株中进行稳定的rVKORCl和rFVII 双顺反子共表达
在形成稳定的产rFVII哺乳动物细胞株范围内，可以使用双顺反子表达系统，以利用 rVKORCl共表达对Y-羧基化的任何影响。采用这样一种系统，在供给单一表达载体后，可以 实现在真核细胞中同时表达两种蛋白质。此外，由相同的mRNA分子同时地翻译出两种蛋白 质。这能够通过将在编码两种转基因的cDNA之间、术语称作内部核糖体进入序列(IRES) 的病毒性遗传因子导入表达载体构建体而实现(Mountford and Smith, 1995)。在己稳定地 整合入寄主细胞染色体的DNA载体构建体转录为mRNA后，两种核糖体可以与加工的mRNA 结合起来，导致同时延伸了两种多肽链。
需要构建载体，以提供用于哺乳动物表达的因子例如强病毒性启动子、聚腺苷酸化 信号和能够进行克隆筛选的抗性基因。将两种编码预期蛋白质的cDNA克隆入中间具有IRES 序列的载体。
以将rFVII表达与双顺反子rFVII和rVKORCl共表达相比较，可以构建出精确地衍 生于仅携带rFVII cDNA的相同宿主载体的对照表达载体。这两种载体可以平行地转染进入相 同的寄主细胞株，例如CHO-DHFR-细胞株CHODUXKDXBll。该细胞株提供了通过基因扩 增来增强蛋白质表达水平的机会。这可以通过携带有DHFR基因的质粒共转染、以及通过如 实施例1所述在亚培养期间提高药剂MTX水平来实现。通过在该表达系统和共扩增系统中 将共表达载体与单顺反子rFVII载体相比较，可以观察到，在存在或缺少作为辅助蛋白质的 rVKORCl时，基因扩增对rFVII表达水平及活性的影响。如实施例2所述，可以实现产rFVII 的克隆株的筛选和产生的rFVII的表征。为避免克隆专一性偏差，当比较两种表达系统时， 应表征大量的通过相同方法筛选的克隆株。材料和方法表达载体
通过标准的克隆技术，可以构建出如实施例2所述衍生于相同宿主载体的质粒载体 构建体。载体pCMV-rFVII的构建体可以按照实施例2中所述方法来形成，可以按如下方法 构建出同型载体pCMV-rFVII-IRES- VK0RC1:经由在实施例2中所用的来自相同来源的PCR 可以扩增出人FVIIcDNA。可以由源载体pIRES2-EGFP (Clontech公司，PaloAlto， CA)分 离出IRES因子，并且可以由如在实施例1中描述的相同源载体(pCEP4-VKORCl)克隆出 VKORClcDNA。可以将所有三个因子克隆入用于构建pCMV-rFVII (参见实施例2)的相同 宿主载体。更详细地，可以将FVII cDNA的PCR产物与附加的Kozak序列和EcoRI限制性
酶切位点一起克隆入中间载体(例如pBluescript; Stratagene公司，LaJoIIa， Ca)，以便能够 经适当的限制性酶切位点进行裂解。可以将含有FVII cDNA的中间载体的HindlII/BamHI片 段克隆入pcDNA3.1/Hyg+(Invitrogen公司)。该中间构建体可以用BamHI和Xhol消化，以 便在一个连接反应中能够将源于pIRES2-EGFP (含有IRES)的BamHI/BstXI片段与具有 VK0RC1 cDNA的PCR产物(由模板pCEP4-VKORCl得到)和BstXI及Xhol位点一起在 5'和3'端同时地插入，以得到pCMV-rFVII-IRES-VKORCl 。
为了能够在CHO-DHFR-表达系统中表达和扩增基因，可以使用如在实施例1中描述 的第二次筛选的质粒pSV-DHFR。 细胞培养和转染
可以使用如在实施例1中描述的CHO-DHFR—寄主细胞株和相同的材料以及转染和培 养方案，用于产生并筛选预期的产rFVII的克隆株。相似地，可以用MTX完成基因扩增。 分析测试方法
为表征rFVII克隆株和上清液或者rFVII活性和浓度，并且为测定细胞比生产率，可 以使用与实施例2中所述相同的测试方法。相似地，需要监测FVIIa活性。 Northern印迹
该技术可用于尤其在mRNA水平上检测导入基因的转录情况，并且用于检査正确的 mRNA大小。从细胞群分离并制备的总细胞RNA可以在琼脂糖凝胶上进行分离并且印迹到 尼龙薄膜上。经过与DIG标记探针杂交，并且在结合于杂交探针后用碱性磷酸酶标记的抗 DIG抗体(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)显色，通过在X光片上进行化学发光，可以检测特定 的RNA序列。应将耙mRNA水平(rVKORCl和rFVII)与持家基因(例如地鼠甘油醛磷酸 脱氢酶(GAPDH))相比较。 结果
可以形成衍生于CHO-DHFR-表达系统的稳定的细胞克隆，并且通过ELISA和凝血酶 原-时间(PT)凝固技术来测试其rFVII生产率。可以通过磷酸钙共沉淀技术，用筛选的质粒 pSV-DHFR共转染表达质粒pCMV-rFVII-IRES-VKORCl或pCMV-rFVII，并且通过对缺乏次 黄嘌呤、甘氨酸和胸腺嘧啶核苷的选择性培养基的露光和对抗生素筛选的露光，可以得到克 隆株。在有限制地稀释克隆后，筛选出源于单细胞的克隆，并且用增加的MTX浓度进行若 干次亚培养，从而完成基因扩增。每个亚克隆步骤中，使克隆受到浓度高达320 nM的MTX 的作用。在全部亚克隆过程中，总共扩展了 133个来源于pCMV-rFVII转染的克隆和83个来 源于用rVKORCl共表达构建体转染的克隆，并且详细地进行表征。对于细胞培养上清液，
可以通过由ELISA测定rFVII浓度，并且通过平行地进行PT凝固性测试，测定了 rFVII和 rFVIIa活性。表征时考虑到仅克隆不到10 %的rFVII活化为FVIIa，从而人为地避免较高的 FVII比凝固值(数据未显示)。以ng每l(^个细胞每24小时为单位，由ELISA浓度值计算 出表达水平。以凝固单位每pg为单位，计算出FVII比凝固活性。
图中8，基于ELISA的测试，分别画出仅表达rFVII的克隆的比生产率值对MTX浓 度的曲线(图8A)，以及rFVII-rVKORCl共表达的克隆比生产率值对MTX浓度的曲线(图 8B)。两种细胞株的MTX水平与表达水平的关系是很明显的。在无MTX时，仅表达rFVII 的克隆的表达水平与起始克隆相当或稍高。特别地，当MTX增加到低的开始水平20 40nM 时，伴随rFVII-rVKORCl共表达克隆表达水平增加的较陡模式清楚显示图8A和图8B中。 在MTX为80 nM时，所有的rFVII-rVKORCl共表达克隆表达出比初始克隆多2~80倍的 rFVII，反之对于仅表达rFVII的克隆，发现有些克隆的表达水平仍类似于初始克隆。从20 nM 往上，发现在所有的MTX水平中，rFVII-rVKORCl生产性克隆比仅表达rFVII的克隆更好。 由图可见，在基因扩增后，特别是在MTX增加的初始过程中，较好的产rFVII克隆的表达水 平比rVKORCl共表达克隆高两倍。
关于FVII比凝固活性，可以画出所有这些克隆的计算值对生产率的曲线，以便比较 蛋白质功能性。在图9中，两种细胞株的比较显示，在类似的生产率下，其活性值大约相等， 两种细胞株的活性值在生产率较高时呈总体下降趋势。当发现rFVII-rVKORCl共表达生产细 胞株的生产率超过两倍时，活性值在超出4吗每106个细胞每天的范围就不能进行比较。在 rFVII-rVKORCl克隆中高于该表达水平，可以维持一个恒定的、类似于源于血浆的FVII活性 值—2U每昭(Moor等，1995)。
特别地，如果没有VK0RC1特异的分析方法可利用，则通过Northern印迹技术可以 显示含有IRES因子的载体构建体的功能性和功能性基因组整合情况，其中IRES因子会导致 含有rFVII和rVKORCl编码序列的单个双顺反子mRNA的转录。
图10显示了 Northern印迹实施例，在细胞溶解后分离CHO衍生转染子或对照细胞 的总mRNA，并且在电泳分离后印迹到尼龙薄膜上。该薄膜己经依序用对人VKORCl专一、 对人FVII专一、对参照基因地鼠GAPDH专一的DIG标记的DNA探针杂交三次。用DIG特 异性标记抗体检测探针。该样品是未转染CHO-DHFR.细胞、 一种仅表达rFVII的CHO衍 生克隆、按照在实施例3中描述的方法先后用rFVII和rVKORCl编码载体转染的两种克隆、 以及三种带有双顺反子rFVII和rVKORCl共表达的克隆。可以用所有的三种探针检测用于 rFVII-IRES-rVKORCl构建体的大小约为2.4 kb的mRNA转录产物、用于rFVII构建体的1.4 kb的转录产物、用于rVKORCl mRNA的0.5 kb的转录产物、以及用于GAPDH对照样mRNA 的1.0 kb转录产物。在所有的克隆中都可以找到GAPDH，反之rVKORCl和rFVII根据转染 质粒载体而存在于各个细胞株中。
总之，稳定的双顺反子rVKORCl共表达对哺乳动物细胞中rFVII生产率具有增强效 果，特别在实施基因扩增时。在进行rVKORCl共表达的基因转移后，高产rFVII的克隆的产 率会更高。在相同的MTX浓度水平下，使用一半数目的所筛选的克隆，可以实现高出两倍 的表达水平。在较高的细胞蛋白质分泌水平下，可以维持蛋白质活性。两种效果可作如下解 释提供足够的Y-羧基化反应所需维生素K还原形式，该反应需要在较高蛋白质分泌水平下 以高转换率发生，以确保完全羧基化的蛋白质的及时释放。实施例4:在CHO或HEK293哺乳动物细胞中先后进行两种非病毒性转染后稳定的rFVII 和rVKORCl共表达
为证实rVKORCl作为辅助蛋白质对在哺乳动物细胞培养中重组表达rFVII的影响， 另一个方法可用于实现rVKORCl与rFVII—起共表达。在第二次转染后，可以使用一策略， 以筛选显示出稳定的rFVII和rVKORCl共表达的克隆。在稳定转染后已被筛选用于rFVII表 达的克隆，可以用另一种编码人VKORCl的质粒载体进行第二次转染。可以导入第二种抗性 标记物，以确保通过对另一种抗生素的抗性而进行筛选步骤。作为适当的对照样，可以平行 地将不含VKORCl cDNA的相同载体转染入相同的细胞群。在用两种抗生素在一个克隆步骤 内进行同时筛选、并且按照实施例2和3中描述的方法进行表征后，可以从这些转染细胞中 分离出稳定的克隆。这些新分离的克隆对比将能够总结出rVKORCl共表达对rFVII生产率和 活性的影响。材料和方法表达载体
为形成产rFVII的克隆，可以使用与实施例2中所述相同的表达载体和rFVII cDNA 来源。至于CHO-DHFR.系统，可以使用附加的筛选质粒pSV-DHFR。
为实现第二次转染后的rVKORCl共表达，可以采用编码人VKORC1的载体和与用 于第一次转染时不同的抗生素筛选标记。通过将用实施例1中描述的相同模板得到的PCR产 物插入pcDNA3.1基载体(Invitrogen公司)，可以构建该载体。这种情况下，应将不含插入 物的相同pcDNA3.1载体进行二次对照转染。作为选择之一，可以把如实施例1中描述的载 体pCMV-VKORCl-EDHpro作为表达载体用于相同的转染。作为对照质粒，可以使用空载体 pCMV-EDHpro (参见实施例l)。 细胞培养和转染
可以使用与实施例1中相同的CHO和HEK293细胞株，以形成稳定的产rFVII的细 胞株。因此可以采用其所有的细胞培养基、转染和培养方案。为实现在这些细胞株中稳定的 rVKORCl共表达，可以进行使用磷酸钙共沉淀法的第二次转染。有必要进行另一种使用附加 抗生素筛选药剂的克隆步骤，以便得到rFVII和rVKORCl共表达的克隆。 分析测试方法
可以使用与如实施例2和3所述浓度和活性测量相同的测试方法，以检验rFVII表达。 通过在实施例3中描述的Northern印迹技术，可以在mRNA水平上显示rVKORCl转录情况。 结果
为显示rVKORCl辅助蛋白质对rFVII表达的影响，可以使用先后两轮转染以及克隆 步骤的方法。在第一轮中，在稳定转染和抗生素筛选后，通过适当的筛选技术，可以分离出 表达rFVII的细胞克隆。可以将这些克隆中的一种进行增殖，并且用编码人VKORCl的质粒 或空的对照质粒进行第二次转染。可以导入另一种筛选标记物。而且，在向培养基添加第二 种抗生素筛选药剂以确保耗尽未转染的细胞后，通过适当的技术，可以筛选出用于表达rFVII 的克隆。可以比较来源于rVKORCl或对照样转染的克隆的rFVII生产率或活性。空的对照载 体确保了在相同的对rFVII表达有影响的培养条件下、特别是进行双重抗生素筛选时的克隆 的对比。
典型地，从所有来源于成功转染的细胞的克隆中，根据它们的rFVII生产率筛选出少 量克隆，并且进行增殖以用于进一步表征。该表征包括，通过抗原ELISA技术并且通过rFVII 和rFVIIa凝固活性测量来测定分泌的rFVII浓度。通过对如图10中所示的二个CHO衍生克 隆的泳道3和4进行Northern印迹技术，可以在mRNA水平上检验rVKORCl和rFVII的共表达。
图11中，显示了在来源于产rFVII的CHO衍生细胞株(图11A)和HEK293衍生细 胞株(图11B)的rVKORCl 二次转染或对照样转染的所选克隆范围内培养上清液中基于 ELISA滴度的比生产率值。由图可见，对于两种细胞类型，rVKORCl转染衍生的克隆比来 源于对照样转染衍生的的克隆产生了更多的rFVII。在两种情况中，rVKORCl克隆株的所有 生产率的中值皆高出大约两倍。
在图12A和12B中，显示了来源于两种细胞类型二次转染后的克隆以FVII凝固单位 每微克ELISA为单位的rFVII比凝固活性。对于比活性计算，将不予考虑大量的rFVII活化 为rFVIIa的克隆，该活化可以通过FVIIa比凝固性测试方法测量。可以选择一个10 %的FVIIa 凝固单位每FVII凝固单位的数量值，以排除那些产生大量rFVII活化为rFVIIa的克隆。因此 图1 2中所示克隆数比图11中少。
FVII凝固比活性差异可能与表达水平相关，而与rVKORCl共表达并不相关。然而， 对于CHO衍生克隆，具有类似表达水平的克隆在存在rVKORCl共表达时显示出更高的活性。 至于CHO衍生细胞克隆和HEK293衍生细胞克隆这两种克隆的生产率，可得出结论与对 照样相比，rVKORCl共表达导致所述生产率平均提高两倍。此外，可得出如下结论除？ 羧基化之外，rFVII活性也受其它因子的影响，而这些因子受细胞代谢的蛋白质分泌和修饰能 力的影响。生产率和活性值与如实施例2和3所述rFVII/rVKORCl共表达实验的结果相符合。
参考文献European Pharmacopeia 5. Assay of Human Coagulation Factor VII. 5th Edition 2,7.10， 203. 2005.Ref Tyl叩e: GenericHallgren, K.W.， Hommema, E丄.，McNaIIy, B.A.， and Berkner, K丄，2002. Carboxylase overexpression effects full carboxylation but poor release and secretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependent proteins. Biochemistry 41, 15045-15055.Himly， M， Pfleiderer， M.， Holzer， G.， Fischer， U,， Hannak， E，， Falkner， F. G，, and Dorner， F,， 1998. Defective vaccinia virus as a biologically safe tool for the overproduction of recombinant human secretory proteins. Protein Expr. Purif. 14， 317-326.Lin， P.J.， Straight, D丄.，and Stafford, D.W.， 2004. Binding of the factor IX gamma-carboxyglutamic acid domain to the vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase active site induces an allosteric effect that may ensure processive carboxylation and regulate the release of carboxylated product. J. Biol. Chem. 279, 6560-6566.Moor， E，， Silveira， A., van't Hooft， F,， Suontaka， A.M., Eriksson, P.， Blomback, M., and Hamsten， A., 1995. Coagulation factor VII mass and activity in young men with myocardial infarction at a young age. Role of plasma lipoproteins and factor VII genotype. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 15， 655-664.Morrissey， J. H., Macik， B.G., Neuenschwander， P. F.， and Comp， P.C,， 1993. Quantitation of activated factor VII levels in plasma using a tissue factor mutant selectively deficient in promoting factor VII activation. Blood 81 ， 734-744.Mountford， P.S. and Smith, A.G" 1995. Internal ribosome entry sites and dicistronic RNAs in mammalian transgenesis. Trends Genet. 11 ， 179-184.
权利要求
1. 一种宿主生物体，其含有编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VK0RC1)或其功能活性 衍生物的重组核酸、以及编码依赖于维生素K的(VKD)蛋白质或其功能活性衍生物的重组 核酸，其中重组VK0RC1和重组VKD蛋白质在所述宿主生物体中都得到表达。
2. 如权利要求1所述的宿主生物体，其特征在于，所述编码重组VK0RC1的核酸或所 述编码重组VKD蛋白质的核酸分别地、或者两者同时地通过选自由诱导表达、瞬时表达和 固定表达所组成的模式组的表达模式进行表达。
3. 如权利要求1或2所述的宿主生物体，其特征在于，所述宿主生物体是哺乳动物细胞。
4. 如权利要求3所述的宿主生物体，其特征在于，所述哺乳动物细胞是从选自CHO细 胞和HEK293细胞的哺乳动物细胞株衍生的细胞。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的宿主生物体，其特征在于，所述重组VKD蛋白质 是促凝血因子或其功能活性衍生物。
6. 如权利要求5所述的宿主生物体，其特征在于，所述促凝血因子选自由因子II、因子 VII、因子IX和因子X所构成的因子组。
7. 如权利要求6所述的宿主生物体，其特征在于，所述促凝血因子是人类因子IX。
8. —种包含细胞的细胞培养系统，所述细胞含有编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VK0RC1)或其功能活性衍生物的重组核酸、以及编码依赖于维生素K的(VKD)蛋白质或其功能活性衍生物的重组核酸，其中重组VK0RC1和重组VKD蛋白质在所述细胞中都得 到表达。
9. 如权利要求8所述的细胞培养系统，其特征在于，所培养的细胞是哺乳动物细胞。
10. 如权利要求9所述的细胞培养系统，其特征在于，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞 和HEK293细胞。
11. 如权利要求8至10中任一项所述的细胞培养系统，其特征在于，所述重组VKD蛋 白质是促凝血因子或其功能活性衍生物。
12. 如权利要求ll所述的细胞培养系统，其特征在于，所述促凝血因子选自由因子II、 因子VII、因子IX和因子X所构成的因子组。
13. 如权利要求12所述的细胞培养系统，其特征在于，所述促凝血因子是人类因子IX。
14. 一种提高在宿主生物体中表达重组的依赖于维生素K的(VKD)蛋白质或其功能活 性衍生物的生产率的方法，其包括下述步骤 (a) 提供宿主生物体；(b) 将编码VKD蛋白质或其功能活性衍生物的重组核酸插入到步骤(a)的宿主生物体中；(c) 将编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VK0RC1)或其功能活性衍生物的重组核酸插 入到步骤(a)的宿主生物体中；以及(d) 表达步骤(b)和(c)所述重组核酸。
15. —种提高在宿主生物体中表达重组的依赖于维生素K的(VKD)蛋白质或其功能活 性衍生物的生产率的方法，其包括下述步骤(a) 提供一种编码VKD蛋白质或其功能活性衍生物的重组核酸被整合入其基因组的宿主 生物体；(b) 将编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VKORC1)或其功能活性衍生物的重组核酸插 入到步骤(a)的宿主生物体中；以及(c) 表达步骤(a)和(b)所述核酸。
16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，稳定地表达所述编码VKD蛋白质或其功 能活性衍生物的重组核酸。
17. —种提高在宿主生物体中表达重组的依赖于维生素K的(VKD)蛋白质或其功能活 性衍生物的生产率的方法，其包括下述步骤(a) 提供一种编码维生素K还原酶复合体亚基1 (VKORC1)或其功能活性衍生物的重组 核酸被整合入其基因组的宿主生物体；(b) 将编码VKD蛋白质或其功能活性衍生物的重组核酸插入到步骤(a)的宿主生物体中；以及。)表达步骤(a)和(b)所述核酸。
18. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，稳定地表达所述编码VKORC1或其功能 活性衍生物的重组核酸。
19. 一种重组的依赖于维生素K的(VKD)蛋白质，其可通过如下方法获得将编码维 生素K还原酶复合体亚基1 (VKORC1)或其功能活性衍生物的重组核酸以及编码所述重组 VKD蛋白质或其功能活性衍生物的重组核酸插入到宿主生物体中，表达所述核酸，以及回收 所述重组VKD蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种宿主生物体，其含有编码维生素K还原酶复合体亚基1(VKORC1)的重组核酸和编码依赖于维生素K的(VKD)蛋白质的重组核酸，其中重组VKORC1和重组VKD蛋白质在所述宿主生物体中都得到表达。本发明还涉及一种包含细胞的细胞培养系统，该细胞含有所述重组核酸。本发明还进一步涉及一种提高在宿主生物体中表达重组VKD蛋白质的生产率的方法，该宿主生物体在合适的体系中进行培养。
文档编号C12N9/04GK101124320SQ200680004712
公开日2008年2月13日 申请日期2006年1月27日 优先权日2005年2月28日
发明者弗里德里希·沙伊夫林格尔, 恩斯特·伯姆 申请人:巴克斯特国际公司;巴克斯特保健股份有限公司