专利名称：：包含表达低γ-消除活性的酶的微生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物，其中表达具有皿醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶中一种或几种活性、并且同时具有低y-消除活性的酶。本发明还涉及具有皿醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸和/或跣基高丝氨酸硫化氢解酶中一种或几种活性、同时具有低y-消除酵活性的重组酶，其被应用于氨基酸尤其是曱硫氨酸的发酵生产。
背景技术：
：>^硫化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、曱M酸或S-腺苷曱疏氟酸对细胞代谢至关重要，并被工业化生产以用作食品或飼料添加剂以及药物。尤其是曱硫氨酸这种不能被动物合成的必需氨基酸，在许多机体功能中扮演了重要角色。除了它在蛋白质生物合成中的作用以外，甲^t!L酸也参与转甲基作用以及硒和锌的生物利用。甲M酸也被直接用于治疗医学病症，如过敏和风湿热。然而，生产的大多数甲M酸都被添加到动物饲料中。在化学上，D，L-甲硫氨酸一般从丙烯醛、甲硫醇和氰化氢制得。但是，外消旋的混合物不如纯的L-甲硫氨酸效果好，比如在鸡饲料添加剂中(Saunderson，C丄"(1985)BritishJournalofNutrition54，621-633)。纯的L-曱硫氨酸可以利用外消旋曱疏氨酸通过例如酖基转移酶处理N-乙酰基-D，L-甲硫氨酸而制备，该处理大大增加了生产成本.对纯L-甲琉氬酸的只-,有微生物和植物能够进行甲硫氨酸生物合成。在许多微生物和植物中的L-曱>^酸合成途径已经很清楚了(图1)。;^杆菌(J^cAm'cA/flo//)中的甲M酸来源于氨基酸天冬氨酸，但是它的合成需要两条另外的途径迎半胱氨酸生物合成和CI代谢(N-甲基四氢叶酸)集中参与。天冬氨酸通过一系列三个反应被转变成高丝氨酸。高丝氨酸随后能够进入苏氨^/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途径。在U杆菌中，1甲硫氨酸途径中需要将高丝氨酸跣化成琥珀酰-高丝氨酸。该活化步骤使得随后与半胱氨酸发生缩合，生成含石克醚的胱硫醚，其被水解产生高半胱氨酸。生成甲硫氨酸的最终曱基转移则通过Bu依赖性或者B12非依赖性曱基转移酶来实现。大肠杆菌(五.③//)中曱硫氨酸的生物合成受曱疏氨酸生物合成基因经由MetJ和MetR蛋白的抑制和活化而调节。除了这种转录调节外，甲M酸特异途径受到编码高丝氨酸转琥珀醃基酶(EC2.3.1.46)的wWA严格调控。iMWA除了受MetJ和MetR的转录调控外，该酶也被该途径的主要终产物曱硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸所反馈调控(Lee，L,Wetal.(1996)Multimetabolitecontrolofabiosyntheticpathwaybysequentialmetabolites,JBC241(22)，5479-5780)。这两种产物介导的反馈抑制是协同的，即低浓度的每种代谢物单独作用只有轻微的抑制性，而联^来则具有强烈的抑制作用。在大肠杆菌中高丝氨酸被活化成琥珀酰-高丝氨酸，其^^j^醚-^合酶转变为y-皿醚，而革兰氏阳性细菌和螺旋体则活化高丝氨酸成为乙g-高丝氨酸，并能够利用乙Sfe^-高丝氨酸硫化氢解酶通过转化乙SfcJ^高丝氨酸而将H2S的硫直##入高半胱氨酸中，所述乙it^-高丝氨酸硫化氢解酶在革兰氏阳性菌中被称为MetY，在螺旋体中被称为MetZ。与真细菌中甲硫氨酸生物合成相比，植物中甲M酸和苏氨^/异亮氨酸生物合成的分支点位于磷酸高丝氨酸的层次。高丝氨酸被磷酸化生成磷酸高丝氨酸，其可以被苏氨酸合酶催化生成苏氨酸，或者利用具有胱硫醚个合酶和磷酸高丝氨酸硫化氢解酶活性的植物酶METB反应生成y-皿醚和/或高半胍氟酸。最近的数据表明，有类似的途径在古生菌(archaea)中起作用(White,2003,ThebiosynthesisofcysteineandhomocysteineinMe幼fl朋c0cc附/'a朋asc/t,7，BiochimBiophysActa,1624(l國3):46隱53)，但是相应的酶还没有被鉴定出来。因此，在植物中以及很可能在一些古生菌中，负责甲>^酸生产的步骤存在于从磷酸高丝氨酸合成？皿醚中。在植物中，曱硫氨酸生物合成通过两种关键酶的活性被调控，即胱硫醚个合酶(CGS)和苏氨酸合成酶(TS)。CGS经由在该细菌酶中尚未发现的N-末端调节区而受到转录后调控(Hachametal.2002PlantPhysiol.128，454-462)。TS被S-腺香甲^tt^^馈激活，S-腺苷甲M^A—种发送高甲M酸浓度信号的甲M酸衍生物。这两种调节机制都将碳^^曱a酸转向苏氨酸，但是在原核生物中没有此功能。不同的胱硫醚-y-合酶的表达已经在专利申请WO93/17112(Genencor)中有教导。在那时还缺乏对于皿醚个合酶的确切了解，而且其在植物中的序列也是未知的。专利申请JP2000-139471(Ajinomoto)描述了大肠杆菌胱硫醚个合酶的过表达，然而还未针对使用不同生物来源的皿醚个合酶用于任何生物中生产甲减裒酸进行评估。MetB酶及其对应物MetY/MetZ能接受多种不同的底物，它们列于表l中。这些酶能够催化四种不同的反应，所有反应都需要活化的高丝氨酸。活化的高丝氨酸可以是磷酸-高丝氨酸、乙酰基高丝氨酸或琥珀跣高丝氨酸。(i)与半胱氨酸J^醚个合酶一起生产Jj5t琉瞇，(ii)与硫化氲硫化氢解酶一起合成高半胱氨酸，(iii)与甲基琉醇甲^IL酸合酶一起生产甲M酸以及(iiii)在缺少第二底物时Y-消除酶催化该底物解离成a-酮基丁酸、氨和活化基团(乙酸盐(酯)，琥珀酸盐(酯)，磷酸盐(酯))。有些酶能催化多于一种>^应，但是催化效率有所不同。例如，大肠杆菌MetB在底物为半胱氨酸和琥珀酰-高丝氨酸时具有最高的催化效率，而且在缺乏半胱氨酸时具有相对较高的Y-消除酶活性(Ai汰enetal.2003,Biochemistry42,11297-11306)。植物酶也能同样好地生产皿瞇，但是具有较低的y-消除酶活性。实际上，拟南芥(A狄fl/,Vwifl)METB的Y-消除酶活性的k^只有所述大肠杆菌酶的1/1500。(Ravaneletal.1998Biochem.J.331，639-648)。一些具有低Y-消除活性的酶被导入大肠杆菌时应该有利于高产量生产甲硫氨酸。<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1.不同生物来源的具有自醚卞合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的优选底物。对于来自不同物种或组的酶标出了活化高丝氨酸以及偏好反应的类型。详见(Hachametal.2003,Mol.Biol.Evol.20:1513-1520)
发明内容本发明基于下iOL现，即在具有皿醚卞合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性、并且具有低，消除活性的酶表达时曱硫氨酸的生产被增强。使用这些酶减少了能转化成异亮氨酸的a-酮基丁酸的生成，其在发酵液中累积。因此，本发明涉及包含编码下述酶的基因的DNA片段，所述酶具有皿醚个合酶和/或砩酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或跣基高丝氨酸硫化氢解酶活性，并具有低Y-消除酶活性。本发明也涉及在曱琉氤酸生产中这些酶的表达，特别是过表达。更进一步地，本发明涉及微生物，优选肠杆菌科(enterobacteriaceae)、棒状细菌或酵母，其中表达前面提及的酶。另外，本发明描述了一种利用具有所述特性的微生物发酵生产甲琉氮酸、其前体或者衍生物的方法。发明详述甲M酸被用于动物营养和药物应用中。常常特定的立体异构体，在此情况下则是具有生物活性的L-型，是优选的种类。因为化学合成只能提供难于拆分的外消旋混合物，所以脊逸感兴趣的是利用发酵法生产L-甲硫氨酸。因此，本发明的一个目的是利用基因工程优化菌林以及改进大量生产L-甲硫氨酸、其前体或衍生物的发酵工艺。在植物和微生物中，一些酶;UL酵生产甲絲酸所必需的。；^杆菌中舰醚个合酶(SEQIDNO1)是参与曱硫氨酸生物合成的关键酶之一。>E.coli|EG10582|MetB:386aa-JJ^醚國y誦合酶MTRKQATIAV'RSGLNDDEQYGCWPPIHLSSTYNFTGFNEPRAHDYSRRGNPTRDWQRA.LAELEGGAGAVLTNTGMSAIHLVTTVFLKPGDLLVAPHDCYGGSYRLFDSLAKRGCYRVLFVDQGDEQALRAALAEKPKLVLVESPSNPLLRWDIAKICHLAREVGAVSW咖TFLSPALQNPLALGADLVLHSCTKYL鹏DWAGVV讓PDVVTELA丽ANNIGVTGGAFDSYLLL認TLVPRMELAQRNAQAIVKYLQTQPLVKKLYHPSLPENQGHEIAARQQKGFGAMLSFELDGDEQTLRRFLGGLSIrFTLAESLGGVESLISHMTMTHAGMAPEARMAGISETLL.MSTGIED域,DLIADLENGFRMNKG除了它的主要活性脱疏醚个合酶以外，其还具有不期望的副活性，即琥珀酰-高丝氨酸y-消除酶，其可以将琥珀酰-高丝氨酸转化为a-酮基丁酸、琥珀酸和氨。该活性在仅有低量的半胱氨酸存在下尤其明显。在大肠杆菌中，它导致甲硫氨酸生成的损失，这一问题可以通过利用与大肠杆菌酶相比具有降低y-消除酶活性的胱硫醚个合酶来避免。因此，本发明的目的是提供一种用于发酵生产氨基酸的微生物，其中表达一种或几种具有皿醚-y-合酶和/或磷酸高丝氨酸疏化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性、并具有低y-消除酶活性的酶。依据本发明，低y-消除酶活性优选地意指与天然大肠杆菌酶中观察到的所述活性相比更低的y-消除酶活性。另外，期望具有降低y-消除酵活性的所述酶具有特异性的皿醚-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性。所述活性可以最终低于该天然大肠杆菌酶的活性。所述表达的具有皿醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氳解酶活性、且具有低，消除酶活性的酶优选与同一生物中存在的天然酶不同。它们可以;l相同物种的突变基因，或是其它物种的天然或突变基因。依据本发明的一个优选实施方案，所述微生物被转化以引入编码具有这种低y-消除酶活性的酶的基因。这样的基因可以通过本领域技术人员可用的不同方式被引入—通过同源重组修饰天然基因，从而在所述基因所编码的酶中引入突变，以降低y-消除酶活性和保持所述酶活性；一将编码已知具有低y-消除酶活性的选定酶的外源基因整合到所述微生物的基因组中；所述外源基因处于宿主微生物中有功能的调节元件的调控之下；-导入包含外源基因的质粒，所述外源基因在该宿主微生物中有功能的调节元件的调控下编码已知具有低y-消除酶活性的选定酶。当所i^因被整合到微生物的基因组中时，它可以有利地引入到选用来替换天然基因的位置。用于转化微生物的方法在本领域是众所周知的，包括同源重组。已知植物胱硫醚个合酶具有比所述大肠杆菌酶更低的，消除酶活性(Ravanel&fl/.1998，Biochem.J331,639-648)。然而，从未显示过在甲硫氨酸的发酵生产中使用植物酶较天然大肠杆菌酶更具优势。因此本发明涉及使用植物皿醚个合酶以提高甲减JL酸的发酵生产。该植物酶使用磷酸高丝氨酸作为底物，而大肠杆菌酶则接受琥珀酰-高丝氨酸，并在某些程度上接受乙g-高丝氨酸。最近已显示古生菌中曱M酸生物合成可能通过磷酸高丝氨酸i^行。至今该酶还没有M征。因此，本发明也涉及在曱硫氨酸的发酵生产中使用具有皿醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶活性的古生菌酶。发现植物胱硫醚个合酶在细菌中的最接近同源物存在于光合细菌绿屈挠菌(CMwy/7狄"s)中。将该酶与植物的酶进行比对表明，结合磷^团所需的M酸在绿屈挠菌酶中是保守的(图2)(Steegbornetal.2001J.MolBiol311，789-801)，这些氨基酸已经由所述大肠杆菌和植物酶的结构比较确定。因此，表达所述绿屈挠菌基因如来源于橙色绿屈挠菌(CMwy/7""s做iYmft'"c"s)的基因>gil53798754|reflZP_00020132.2lCOG0626的同源物的微生物也是本发明的对象。本发明进一步的对象是具有胱硫醚个合酶/磷酸高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶，并且其在所示位置处保守下列氨基酸107E、111Y、165K、403S(参见比对图2)从而允许使用磷酸高丝氨酸作为底物，并因此表现出降低的Y-消除活性。#^酸位置是参照烟草(7V/c她'fl"fl似6flc"附)的序列给出的。相同的Jl^酸位置可以通过简单的序列比对、无需过度实验就可以确定(参见图2)。作为苏氨酸生物合成途径的一部分，磷酸高丝氨酸在大肠杆菌中被生成，并因此能够直接被转化成Y-胱硫醚和/或高半胱氨酸。与植物和肠杆菌科(e"te6flcteWflcefle)不同的是，一些革兰氏阳性细菌使用依赖于将乙酰基转移至高丝氨酸上而生成乙酖基-高丝氨酸的机制来活化高丝氨酸。随后，乙跣基-高丝氨酸通过利用乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶MetY经硫化氢解作用被转化成高半胱胺酸，或者利用胱硫醚个合酶被转化成Y-胱硫醚。如专利申请WO2004024933和EP1313871中所述，该反应已用于在棒状细菌(coryneformbaceria)中通itiL酵生产甲硫氨酸。然而，相应的基因从未在大肠杆菌中被测试过，且它们的y-消除酶活性也未被测定。因此，本发明也涉及在大肠杆菌中使用与所述大肠杆菌酶相比具有低"消除酶活性、但具有相当的或增加的减，化氢解酶活性的MetY酶。依据本发明的另一个实施方案，天然或引入酶的y-消除酵活性降低也能通过优化该酶而得到，例如通过Sambrook等人(1989Molecularcloning:alaboratorymanual.2ndEd.ColdSpringHarborLab.，ColdSpringHabor，NewYork.)所描述的定向进化或定点资变。也可以通过使用诱变剂如NTG或EMS进行随机诱变，或者如专利申请PCT/FR04/00354中所述通过体内进化来优化该酶。优化的酶也可以4^于天然基因且具有对宿主生物来说优化的密码子偏好及GC-含量的合成基因。因此，具有降低Y-消除酶活性或增强胱硫醚t合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的优化酶的应用是本发明的目的。优化酶的一个具体实例是优化的胱硫醚-Y-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶，尤其是大肠杆菌MetB酶，其中笫337位丙氨酸被在不同细菌属的酶中高度保守的脯氨酸所替代，和/或在第335位包含丙氨酸。除非另外指出，所给位置参照天然大肠杆菌酶。本发明进一步涉及编码如上定义的根据本发明的胱硫醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氬解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氬解酶的核苷酸序列、DNA或RNA序列。胱硫醚个合酶和磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或跣基高丝氨酸疏化氢解酶有利地选自对应于PFAM参考号PF01053以及COG参考号COG0626和COG2873的酶。PFAM(比对和隐藏Markov模型的蛋白质家族数据库；http:Vwww.sanger.ac.uk/Software/Pfam)形成了蛋白质序列比对的大汇集。每个PFAM使得有可能显示多重比对，观察蛋白质结构域，评估在生物中的分布，获得ii^其它数据库的途径，以及显示已知蛋白质结构。COG(蛋白质直向同源组絲；http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通过比较来自代表30个主要系统发生系的43个完全测序基因组的蛋白质序列而获得。每个COG由至少三条系统发生系确定，因此使识别古老的保守结构域成为可能。作为适于大肠杆菌的合成基因，优选的酶是拟南芥(Jra6iVto/w/s^"/,Vm")胱硫醚-Y-合酶(登记号gi:1389725)，巴氏曱烷八叠球菌(3fe幼朋owwr!Vi6wA:en')的推测的lt^醚-"合酶和/或硫化氲解酶(登记号gi:48839517)，酿酒酵母(S"cc^fliwwj;cescwev/wVie)的乙ife^-高丝氨酸多危化氢解酶(登记号YLR303W)，橙色绿屈挠菌的推测的皿醚个合酶和/或硫化氢解酶(gi:53798753)和谷氨酸棒杆菌(Wfl"w/"附g/Mto附/cww)乙^L^-高丝氨酸疏化氢解酶(gi:41324877)。将这些序列与以下代M列进行比对>gil84395411gb|AAF7498aiAF082891_l舰醚？合酶同工型i[马铃薯(Solanumtuberosum)]>gi|495W32|gblAAD34548.1|AB41602_l舰醚个合酶前体[大豆(Glycinemax)^2198853l别AAB61348.1《胱硫醚？合酶[玉米(Zeamays)>gi|4322948|gb|AAD16143.lT胱硫醚？合酶前体[烟草(所础肌&tabacum)>gi|n602834|gblAAG38873.1|AF076495—l舰醚丫一合酶[水稻(017"sativa)^鄉04导lAAB0S(m.ll舰瞇Y-合酶^杆菌l表现出皿醚卞合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氩解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性、并且与上述JL^酸序列具有至少80%同源性、优选90%同源性、更优选95Q/。同源性的这些序列的同源序列同样是本发明的目标对象。鉴别同源序列和它们的同源性百分数的方法是本领域技术人员所熟知的，特别地包括BLAST程序，尤其是BLASTP程序，其可以从网站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/利用该网站指定的]|^人>#^:来4吏用。为了确定哪些酶在被引入相应的菌林时对甲硫氨酸的生产有利，可以通过酶学方法评估Y-消除酶活性。例如，可以用酶学检测法，利用活化的高丝氨酸以及(i)没有其它底物、或(ii)半胱氨酸、或(iii)H2S作为底物来测定脱^L醚个合酶、Y-消除酶活性和硫化氢解酶活性。该反应通过加入含有相应酶活性的蛋白质提取物而起始，并且在蛋白质沉淀和用珪烷化试剂衍生后通过GC-MS来监测高半胱氨酸和/或Y-皿醚的形成。编码胱硫醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因可通过染色体方式或染色体外方式进行编码。在染色体方式中，基因组上可能有一个或几个拷贝，其可通过本领域的专家所知晓的重组方法引入基因组中。在染色体外方式中，基因可以由不同类型的质粒所携带，所述质粒在其复制起点方面有不同，因而在细胞中的拷贝数不同。它们可以1-5个拷贝、约20个拷贝或多达500个拷贝存在，各对应于紧密复制型4绪贝ltt粒(pSC101，RK2)、低拷贝絲粒(pACYC，pRSF1010)或高拷贝^bt粒(pSKbluescriptII)。w"5基因可以利用不同强度、需要或不需要被诱导物分子所诱导的启动子进行表达。实例包括启动子Ptrc，Ptac，Plac，X启动子cl或本领域专家已知的其它启动子。耙基因的表达可以通过使相应的信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)或蛋白质(如GST标签，AmershamBiosciences)稳定化或去稳定化的元件来增强或降低。本发明还涉及含有编码本发明胱硫醚个合酶和/或跣基高丝氨酸和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶的一个或几个等位基因的微生物。这些菌林的特征在于事实上它们具有使得向甲硫氨酸的流量增加的甲石itlL酸代谢，这种流量增加是通过仅仅使用接受磷酸高丝氨酸的酶并由此降低生成的a-酮基丁酸的量，或者是通过使用接受磷酸高丝氨酸的酶以及接受醃基高丝氨酸的酶从而增加向甲疏氤酸的流动。特别地，本发明涉及通过培养新微生物和分离所生成的含硫化合物来制备L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物。L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物的生成的增加可以通过降低下列基因之一的表达水平或将其缺失来实现。基因Genbank登记号活性1788633醋酸激酶1788635磷酸转乙g酶17卯505醋酸合酶1786304丙酮亂阮氢酶E11786305丙酮^L氲酶E21786307丙酮,氬酶E31786948琥珀酰-辅酶A合成酶，p亚基SMC"1786949琥珀酰-辅酶A合成酶，a亚基1789807磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶1788160丙酮酸激酶II1787965丙酮酸激酶I1787096丙酮酸氧化酶i/vB1790104乙酰羟酸合酶I，大亚基,7vN1790103乙酰羟酸合酶I,小亚基!7vG17卯202乙酖羟^^酶n，大亚基1790203i/vM1790204乙酰羟酸合酶n，小亚基//vl1786265乙酰羟酸合酶ni，大亚基//vH1786266乙酰羟酸合酶m，小亚基1788953DAHP合成酶1786969DAHP合成酶1787996DAHP合成酶L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物生成的额外增加可通过it^达一种或几种以下基因来实现来自埃特里根瘤菌(Rhizobiumetli)的丙酮酸羧化酶(pyc，U51439),或其同源物之一，由以下基因编码的合成高丝氨酸的酶沩rA(高丝氨酸脱氢酶/天冬氨酸激酶，1786183)，优选具有降低的反馈灵敏性，附"L(高丝氨喊氢酶/天冬氨酸激酶，gl7卯376)或/"C(天冬氨酸激酶，1790455)和fl/(天冬氨酸半搭脱氢酶，1789841)或者它们的组合。L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物生成的更进一步增加有可能通过it^达参与硫酸同化和半胱氨酸生成的基因来实现。含硫化合物的量增加同样会降低Y-消除酶活性。这可以通过以下来实现过表达下列基因(见下)，或如Coyler和Kredich所述(1994MolMicrobiol13797-805)通过引入组成性O;sB等位基因接触对该途径的调控，以引入编码对于其抑制剂L-半胱氨酸具有降低灵敏性的丝氨酸乙g转移酶的等位基因(美国专利申请US6,218,168,Denk&Bock1987JGenMicrobiol133515-25)。以下的基因需要被it^达。1788761疏通透酵1788764半胱氨酸转运系统1788762膜结合硫酸盐转运系统1788753cysK上游的开放读码框1789108ATP硫酸化酶1789109硫^苷酰转移酶，C1789107腺普酰硫酸激酶，H1789121腺香絲酸还原酶O^I1789122亚硫酸还原酶，a亚基，J1789123亚硫酸还原酶，p亚基，E17卯035丝氨酸乙it^转移酶1788754半胱氨酸合酶c"M2367138o-乙et^-硫化氢解酶c"W1788762硫酸转运蛋白，T硫酸转运蛋白cpZ1788753硫酸转运蛋白s6/1790351周质硫酸结M白另外，参与CI(甲基)基团合成的基因可通过it4达下列基因而得到增强wrA1789279磷酸甘油酸脱氩酶，优选Jl馈抗性的1787136磷酸丝氨酸转氨酶g/jA1788902丝氨酸羟甲基转移酶附&F17卯3775,10-亚曱基四氢叶酸还原酶另外，直接参与甲疏氨酸生成的基因可以被it^达:i"B1790375附"C1789383鹏沮17卯450附"E2367304附WF17卯377附"R17卯262jJjt^醚-，合酶雌醚國P-裂合酶B12-依赖性高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶四氢蝶酰三M酸转甲基酶5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶metE和metH的正向调节基因以及自调节而且，可以降低降解曱硫氨酸或偏离曱硫氨酸生成途径的途径中的基因的表达，或者可以缺失所U因。17893371788043二氢吡咬二羧酸合酶可以通it^达下列基因而增强回补反应ppc1790393磷酸烯醇式丙酮酸^/化酶p/w1787994磷酸烯醇式丙酮酸合酶L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物生成的进一步增加可以通过缺失阻遏蛋白MetJ的基因来实现，该基因负责下调甲硫氨酸调节子，如JP2000157267-A/3所建i义(也可参见GenBank17卯373)。曱硫氨酸的生成可以通过使用改变的附WB等位基因来更进一步提高，所述等位基因优先或仅仅使用H2S，并因此从O-琥珀酰-高丝氨酸生成高半胱氨酸，正如专利申请PCTN。PCT/FR04/00354中所描述，该申请的内^it过参考并入本文中。在一种优选的应用中，所述生物是大肠杆菌，或谷氨酸棒杆菌，或酿酒酵母。本发明也涉及用于生产L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物的方法，通常其通ii发酵所设计的细菌菌林来制备。依据本发明，术语"培养"和"发酵"不区分地使用，指微生物在含有简单碳源的适宜培养基上的生长。依据本发明，简单碳源即能够被那些本领域技术人员使用来获得微生物、尤其是细菌的正常生长的碳源。特别地，它可以是可同化的糖，如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖或糖蜜，或这些糖的副产品。尤其优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。本领域技术人员能够确定本发明微生物的培养条件。特别地，所述细菌在20'C至55'C之间，优选地在25。C至40'C之间发酵，更具体地，对于谷氨酸棒杆菌在大约30'C发酵，对于大肠杆菌在大约37'C发酵。发酵通常在装有适合所用细菌的已知组成确定的无M养基的发酵罐中进行，其中含有至少一种简单碳源，如果必要的话也含有代谢物生产所必需的共底物。特别地，用于大肠杆菌的无机培养基可以与M9培养基(Anderson,1946，/Voc.7V"汰爿c^/.5V1USA32:120-128)和M63培养基(Miller,1992;AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookfor五sc/im'c/r/aco//andRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)或比如Schaefer等人定义的培;^基(1999，Jmi/.270:88-96)具有相同或相似的组成。类似地，用于谷氨酸棒状杆菌的无机培养基可以与BMCG培养基(Liebletal"1989，j//;/.A/iciy^zV/.丑i》tec/m"32:205國210)或比如Riedel等人描述的培养基(2001，丄A^/.Af/cn^iV/.丑,VtecA"o/.3:573-583)具有相同或相似的组成。可以向培养基中补充成分以便补偿由突变引入的营养缺陷。如果有必要，发酵后，可以回收并纯化L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物。在培养基中回收和纯化所生成的化合物如甲硫氨酸的方法是本领域技术人员所熟知的。L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物的发酵生产中应用的硫源可以是下述任何类型硫酸盐，硫代硫酸盐，硫化氢，甲硫醇。图1.将草酰乙酸转变成苏氨酸、异亮氨酸和曱硫氨酸的代谢途径。MetB同源物可以催化至少三个反应？胱硫醚的合成，已活化高丝氨酸的疏化氢解化或Y-消除。优先接受磷酸高丝氨酸的MetB同源物用红色显示，接受琥珀酰高丝氨酸的酶用蓝色标识，转化乙酰基高丝氨酸的酶(MetB/metZ)用绿色指示。图2.植物和细菌物种的具有皿醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸疏化氢解酶和/或乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的比对。灰色框内显示的残基使酶能特异性与磷酸高丝氨酸结合。高度保守的氨基酸用红色显示，保守的残基用蓝色显示。实施例1:仅使用具有低Y-消除酶活性的接受磷酸高丝氨酸的植物METB构建用于生产甲硫氨酸的菌株为了^^物CGS与大肠杆菌酶相比具有更低的Y-消除酶活性，在粗提物中测定拟南芥METB酶和大肠杆菌酶的y-消除酶活性和CGS活性之间的比例。为了这个目的，构建了这样的大肠杆菌菌林，其中缺失了附"B基因的染色体拷贝，并且由质粒表达;^杆菌或拟南芥CGS。伴随着附WB的缺失，附WJ基因也被消除(参见下文)。在含5g/1葡萄糖的基4^养基上培养携带野生型或异源的接受酰基高丝氨酸或磷酸高丝氨酸的胱硫醚-Y-合酶和/或硫化氲解酶的大肠杆菌A附^JB菌林，并且在晚对数期收集。细胞重悬在冷磷酸钾緩冲液中，在水上用超声波处理(Bransonsonifier，70W)。离心后，对上清中所包含的蛋白质定量(Bradford,1976)。将10nl的提取物在30'C与或者5mMO画琥珀酰國高丝氨酸或者O画乙g-高丝氨酸以及或者1.5mM硫化钠或者半胱氨酸一起孵育10分钟。用丙酮沉淀蛋白质，并且在用叔丁基二甲基曱硅烷基三氟乙酰胺(TBDMSTFA)衍生化之后用GC-MS对酶^Jl应期间生成的高半胱氨酸或Y-^f危醚进行定量。其中包括L-丝氨酸[1-13C作为内部标准。或者，可使用相同方案测量半胱氨酸的消失。使用如Datsenko和Wanner(2000)所描述的同源重组策略将we出和附etJ基因失活。该策略可以允许插入氯霉素抗性盒，同时缺失所涉及的大多数基因。为了这个目的，应用下列的寡核苷酸DmetJR(SEQIDNO2):tgabgtaggcctgataagcgtagcgcateaggcgattccactccgcgccgctottttttgctttagtattcccacgtctcTGTAGdCTGGAGCTGCTTCG其具有-与w"J基因的序列(4125596-4125675)同源的区域(小写字母)(参考序列见网，:htto:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/),—用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(参考序列见Datseiiko,K.A.&Wanner,B丄.，2000,PNAS,97:6640-6645)，DmeUBF(SEQIDNO3):taigcagctgacgacctttcgcccctgcctgcgcaatcacacteatttttaccccttgtttgcagcocggaagccattttCACKJCACCAGAGTAAACATT其具有-与WWB基因的序列(41274604127381)同源的区域(小写字母)以及与附"L的启动子同源的区域(41261164126^7)-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。寡核苷酸DmetJBR和DmetJBF用^M^质粒pKD3上扩增氯霉素抗性盒。然后将所得PCR产物通过电穿孔法导入MG1655菌抹(pKD46)中，其中表达Red重组酶，允许发生同源重组。选择氯霉素抗性转化林，然后利用以下定义的寡核苷酸MetJR和MetJF使用PCR分析来验汪该抗性盒的插入。所得菌#^命名为MG1655(Aw^JB::Cm)。MeUR(SEQIDNO:4):ggtadagaaaccagcaggctgaggateagc(与4125431至4125460的序列同源)。MetLR(SEQIDNO:5):aaataacacttcacatcagccagactactgccaccaaattt(与4127500至4157460的序列同源)。随后除去氯霉素抗性盒。通过电穿孔法将携带有作用于氯霉素抗性盒FRT位点的重组酶FLP的质粒pCP20引入重组菌林中。经过在42。C的一系列培养后，使用与先前相同的寡核苷酸通过PCR分析验证氯霉素抗性盒的丢失。为了使用来自拟南芥的接受磷酸高丝氨酸的METB生产甲疏氨酸，构建以下的大肠杆菌菌抹。如上所述缺失曱;^酸阻遏蛋白附wj以及^杆菌w"B。^缺失编码琥珀跣-高丝氨酸转移酶的附wA基因和/或编码苏氨酸合酶的^C基因，缺失策略已针对附WJB缺失进行了举例说明。所有其它基因的缺失均基于相同策略并使用所指出的寡核苷酸。下面列出了用于缺失挑WA和沩fC基因的寡核苷酸。括号中的数字指示与大肠杆菌染色体同源的区域。D开头的寡核苷酸用于实际的缺失，其它寡核苷酸用于构建体的验证或标明的特殊目的。对于wWA基因的缺失，使用以下寡核苷酸DmetAF(42118664211945;:SEQIDNO6):ttogtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtg幼gaaaacgtetttgtgatgacaactttcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDmetAR(4212785-4212706訂SEQIDNO7):atccagcgttggatteatgtgccgtagategtatggcgtgatctggtagacgtaatagttgagcck扭ggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAGMetAF(42117594211788;SEQIDNO8):tcaccttc幼catgcaggctcgacattggcMetAR(42128574212828;站QIDNO9):ataaaaaaggcacccg幼ggtgcctgaggt对于沩rC基因的缺失，使用以下寡核苷酸DthiCF(3740-3821;SEQ'IDNO10):ctctecaaictgaaagateacaacgagcaggtcagctttgcgcaagccgtaaccc鄉ggttg丝c^aia'atcaggggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDthrCR(5012-4932;SEQIDNO11):gattcatcatcaatttacgcaacgcagcaaaatcggcgggcaga加tgtgaaagcai鹏teaate孝"tgttctgcCATATCJAATATGCTCCTTAGthrCF(3柳-3511;SEQID由'12):cgct一cctaccgtgaacggthrCR(5284"5260;SEQIDNO13):gcgaccagtoccagggaaagtgcg为了更进一步提高高丝氨酸的生产，从质粒pCL1920(Lerner&Inouye，l外0，NARl8，l5p4631)利用启动子Ptrc表达天冬氨酸激酶/高丝氨酸，对苏氨酸具有降低反馈抗性的沩rAA等位基因。为了构建质粒pME101-thrA*l，使用下列寡核普酸通过PCR4因组DNA扩增f/^A:丑印HlthrA(SEQID1^014):tteTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggcS加althrA(SEQit)K915):ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc将经PCR扩增的片段用限制性酶必^HI和切割，并克隆到pTRC99A栽体(Stratagene)的A^IA9附"I位点。为了从>^#贝栽体进行表达，按照下述构建pME101质粒。使用寡核普酸PME101F和PME101R通过PCR扩增pCL1920质粒，将来自pTRC99A栽体带有基因和Ptrc启动子的i对Z17I-X/iml片段插入扩增后栽体中。将所得栽体和带有沩M基因的载体用Apal和Smal限制性酶切，并且将含^rA的片段克隆到pME101载体中。为了使ThrA解除反馈抑制，通过使用寡核苷酸ThrAFF318S和ThrARF318S进行定点诱变(Stratagene)引入F318S突变，得到pME101-thrA*l载体，称为pSBl。PME101F(SEQIDWO16):CcgacagtaagacgggteagcctgPME101R(SEQIDNO17):AgcttagtaaagccctegbtagThrAFF318S(Smal)(SEQIDNO18):Cc幼tctgaataacatggca^tccagcgtttctggg^gggThrARF318S(Smal)(《EQIDNOl外Cccgggccaaaaacgct纽a6attgccatgttattcagattgg为了将所生成的一部分高丝氨酸转化为磷酸高丝氨酸，将沩rB基因克隆到pSBl载体中。-/^B使用寡核苷酸thrA，BF和thrA，BR经PCR扩增得到thrA，BF(SEQIDNO20):tac^atetocatggccttaatctggaaaactggcthrA，BR(SEQIDNO21):娃cccgg^TAGTTTTCCAGTACTCGTGCGCCCPCR片段用5wGl和Swfll消化，并克隆到用相同限制性酶切割的pSBl栽体中，得到pSB2质粒，随后，使用寡核苷酸gapA-cgsAF和cgsAR从商品cDNA克隆(TAIR，hlip:〃arabid—s.oir—)PCR扩增来自拟南芥的METB酶。寡核苷酸gapA-cgsAF由METB的核苷酸1至38(粗体)以及大肠杆菌的属于GapA启动子区域的核苷酸1860761至1960799(下划线)组成。gapA-cgsAF(SEQIDNO22):dcttttattoactaacaaatagctgetggaalatatgttgagctccgntg認agccteactgtteatgccggcgsAR卿IDNO23):AATCGCGGATCCGAATCCGGTCAGATGGCTTCGAGAGCTTGAAGAATGTtAGG同时，使用寡核苷酸gapA-cgsAR和GapAF扩增大肠杆菌GapA基因的GapA启动子区域。寡核苷酸gapA-cgsAR携带MetB基因的第1至39位碱i以及大肠杆菌染色体中对应GapA启动子区域的1860799至1860761位威基。寡核苷酸GapAF对应大肠杆菌基因组的第1860639至1860661位>^。gapA-cgsAR(SEQIDNOi4):ccggcatg纽cagtgaggctcccatcggagctcaacatatattccaccagctatttsttaeteaataaaaggGapAF(SEQIDNO25):acgtccc鹏caagcceaaaggaagagtgaggc!^使用寡核苷酸cgsAR和GapAF将两种片段融合(Hortonetal.I989Gene77:61-68)，用限制性酶丑fl挑HI和5>"I切割，并克隆到pSBl和pSB2栽体相应的限制性位点内，分别得到载体pSB3(pMElOUhrA*國metBJ"和pSB4(pMElOlthrA*國thrB-metB^"。1^将pSB3栽体和pSB4载体引入Awe迅JA附WAA幼/C菌林中。实施例2:仅使用具有低Y-消除酶活性的植物METB构建菌株用于经由0一琥珀酰高丝氨酸生产甲硫氨酸。为了使用植物METB经由琥珀酰高丝氨酸生产甲硫氨酸，构建了△metBJmetA论菌林。该构^始采用实施例1中描述的菌林，其中在其基因组中引入了反馈抗性高丝氨酸转琥珀酰酶metA*ll(描述于专利申请PCTIB/加(M/001卯1)。为此目的，使用下列寡核苷酸从大肠杆菌染色体扩增metA"l等位基因。MetArcF(42117864211883;SEQIDNO26):ggcaaattttctggttatetteagctatotggatgtctaaacgtataagcgtatgtagtgaggtaatc昭gttatgccgattcgtgtgccggacgagcMetArcR(4212862-42127^0eQIDNO27):cggaaata助a幼ggcacccgaaggtgcct将pKD46质粒引入MG1655A附WA幼K:菌林以及MG1655A附WA菌林中，并用携带/MWAni等位基因的DNA片段转化。在改良M9平板上选择甲^^f、养型的克隆。随后，如上所述加入AmetBJ突变。将pSB3和pSB4质粒引入这两个菌株中。实施例3:使用具有低Y-消除酶活性的接受磷酸高丝氨酸的植物METB、并同时使用大肠杆菌MetB构建菌株。为了进一步提高甲硫氨酸的合成，构建了同时经由O-琥珀酰高丝氨酸和磷酸高丝氨酸产生甲硫氨酸的菌林。该构建起始采用如实施例1中所描述的AmetA和AmetAAthrC菌林，其中使用如下寡核苷酸缺失了附^J基因具有100^1^的DmetJR(SEQIDNO:28):c鄉caccagagtaaacattgtgttaatggacgtc幼tacatetggacatctaaacthtttgcgta啤'.Jtgagcaa^CATATGAATATCCTCCTTAG具i100^1^的DmetJR(SEQIDNO:29):tgacgtaggcctgataagcgtagcgcatcaggcgattec3ctccgcgccgctettttt^ctttagtattcccacgtcteTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGMetJR(SEQIDNO:30):ggt^agaaaccigcaggctgaggatcagc(与4125431至4125460的序列同源)。MetBR(SEQIDNO:31):ttogtcgtcatttaaccogctacgcactgc(与4126305至4126276的序列同源)。随后，将具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶metA^1(描述于专利申请PCTIB2004/001卯1中)引4因组中.为此目的，使用下列寡核香酸从大肠杆菌染色体中扩增metA*ll等位基因。MetArcF(4211786-4211883;SEQIDNO32):ggcaaattttctggttatcttcagctatetggatgtctaaacgtataagcgtatgtagtgaggta^it鄉gttatgccga加卿gccggacgagcMetAicR(4212862-4212764;.SfiQIDNO33):cggaaataaaaaaggqacccg幼ggtgcctgaggtaaggtgctgaatcgcttaacg&拔gactatcacagaagattaatccagcgttggattcatgtgc将pKD"质粒引入用携带《i"A*ll等位基因的DNA片段转化的MG1655A/w^JA附CAA^rC和MG1655A附wJA附CA菌林。在改良M9平板(必要时补充苏氨酸)上选择曱硫氨酸原养型的克隆。与实施例1中使用metBA构建pSB3和pSB4类似，通过使用寡核香酸MetBF和MetBR进行扩增，并将PCR扩增产物克隆到限制性位点尸对I和历Vi必II中，将带有适当启动子的大肠杆菌附"B基因克隆到pSBl和pSB2载体中。Me氾F(4125957-4125982)(SgQIDNO34):ttagacag幼￡|g￡SgcgccgctecattcagccatgagatacMetBR(4127500-4127469》IDNO35):cgtaacgcccggg^aataacacttcacatcagccagactactgcc所得载体被命名为pSB5(pME10UhrA*-metBEc)以及pSB6(pME101thrA*-ttirB-metB￡c)。1C^，将质粒pSB3、pSB4、pSB5和pSB6引入MG1655A附WJw"A*ll和MG1655A挑CJ挑CA"1菌林中。实施例4:以硫酸盐或硫化氢作为硫源经由磷酸高丝氨酸和/或o"琥珀酰高丝氨酸生成甲硫氨酸。使用补充5g/lMOPS、5g/l葡萄糖并且可能还有2mM苏氨酸的改良M9培养基(Anderson,1946，/Voc.iV"rf.f/5L432:120-128)在小烧瓶培养物中对实施例1至3中所构建菌林的M酸生产进行分析。如果使用硫化氬作为硫源，所有的含硫酸根的盐都被替换成等摩尔量的含氯盐。硫化物以硫化铵(10mM)形式来提供。如果有必要，以浓度为100mg/l加入壮观霉素。用过夜培养物接种30ml培养物至OD600为0.2。在培养物的OD600到达4.5至5之后，加入1,25ml50%葡萄糖溶液和0.75ml2MMOPS(pH6.9)，振荡培养物l小时。随后，如果必要加入IPTG。在分批培养阶段分析细胞外代谢物。在OPA/Fmoc衍生化之后通过HPLC对M酸定量，在珪烷化之后使用GC-MS分析其它相关的代谢物。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表2携带大肠杆菌(pSB5)和拟南芥(pSB3)MetB的菌株的特异性曱硫氨酸生产，以及它们相应的皿醚个合酶(CGS)和y-消除活性。使用来自拟南芥的具有低y-消除酶活性的METB生产甲M酸通过y-消除酶^jl显著减少异亮氨酸的生成，而甲疏氮酸的合成则没有被显著影响。这与仅使用幻杨杆菌途径的试验形成对比，其中经由y-消除作用产生了大量副产物异亮氨酸。实施例5:使用接受乙酰基-高丝氨酸和H2S作为底物的酵母MetB酶生产甲硫氨酸的菌株的构建和评价为了测试酵母体内的Y-消除酶活性以及评价它用于生产甲a酸的潜力，构建了以下菌林。使用下列寡核普酸，通过PCR从基因组DNA中扩增编码酿酒酵母中高丝氨酸乙酖基转移酶的MET2基因Ptac-metAlevF(SEQIDNO36):tgctacagctggagctgttgacaattaatcatcggctogtataatgtgtgg幼ggaggacagaccat沐gcatacttta'aaatcgaaaacgctecaagagcPtac-metAlevR(SEQIDNO37):CGTACTGACGACCGGGTCCTACCAGTTGGTAACTTCTTCGGCCTCACiC随后将PCR片段克隆到pACYC184载体的户v"TI和Dnfl限制性位点，得到pSB7载体。寡核苷酸Ptac-metAlevF携带驱动pACYC184载体表达酵母MET2基因的pTAC启动子。使用寡核苷酸metBIev和gapA-metBlevF扩增酵母乙8*^-高丝氨酸硫化氢解酶(MET17)。同时，使用寡核苷酸gapA-metBlevR和GapAF扩增;^杆菌^pA启动子。随后，通过只使用^核苷酸metBIev和GapAF(详见上面)采用融合PCR法将MET17基因与ga/A启动子融合。gapA-metBlevR(38-75:1860797-1860761;SEQIDNO38):GGCCGGCGTGTAGTTGAACAGTATCGAAATGAGATGGCATATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGGg邻A-metBtevF(1-38:l節0761-1860797;(SEQDONO39):ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatatgccptctca询cg1atactgttcaactacacgccggccme仿lev(SEQIDNO40):TAATC6CGGATCCGCGTCATGGTTTTTGGCCAGCGG叩AF(1860639，1860661;SEQIDNO41):acgteccg能caagcccaaaggaagagtgaggc将融合片段克隆到实施例1中所述pSBl载体的S附fll和5amHI位点，得到pSB8载体。将pSB7和pSB8栽体均转化到AwWJA附WA菌抹中，得到DmetBJDmetCDmetApSB7pSB8。该菌#4迟滞期后以0.21/h的生^il率生长。IHit质粒和突变，并对甲M酸进行定量。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表3携带大肠杆菌(pSB5)和酵母(pS朋)MetB的菌林的特异性曱硫氨酸生产以及它们相应的O-琥珀酰高丝氨酸疏化氢解酶(OSHS)、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(OAHS)和y-消除活性。i数值是在AmetBJmetAnipSB5菌林中获得的。表3显示，甲疏氨酸的生成量在有酵母MET2和MET17基因存在下被显著提高。同时，所生成的异亮氨酸的量降低。这可以由MET17酶的低Y-消除酶活性(如实施例1所述体外测定酵母乙S^-高丝氨酸硫化氢解酶的Y-消除酶活性)来解释。实施例6:构建和评价表达来自于巴氏甲烷八叠球菌(ilfe*/;a/70sa/c//7a(Fusaro株)的古生菌鹏迅的甲硫氨酸生产菌株与植物中一样，在古生菌中甲疏氨酸生物合成被认为是经由磷酸高丝氨酸进行的。为此，我们假设与所述植物酶类似，来自甲烷八叠球菌(Me幼fl加ww"'"fl丄的MetB也可能具有低Y-消除酶活性。因此，使用寡核香酸metBmethano和gapA-metBme仇anoR通过PCR扩增曱烷/v叠球菌附WB。如先前所述，随后将大肠杆菌gfl/A启动子与metB基因融合在一起，其中对于该启动子的扩增使用寡核苷酸gapA-metBmettianoF和GapAF,对于实际的融合使用metBmethano和GapAF。将得到的片段克隆到pJB137栽体的限制性位点内，得到pSB9质粒.MetBmelh咖(SEQID鄉42):GTCCCCCGGGAATCTAGTCTAGATTAAATTACTTCAAGGGCCTGTTTQAGGgapA-metBmeth咖R(32-69:1860797-1860761)(SEQIDNO43):cacattttgttgcaaacttcacttctctttcc咖ta加caccagctafttgttagtgaataaaagggapA-metBmeth幼oF(l-3S:1柳761-1860797)(SEQIDNO44):ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatatggaaagagaagtgaagtttgcaacaaaatgtgGapAF(1860639-1860661)(SEQIDNO45):acgtecc鹏c幼gcccaaaggaagagtgaggc将pSB9质粒引入A/m"JiWA*ll、A附CJA挑WAA/mCB和AiCJA附"AAw&B菌林中，所得菌林如实施例2中所述进行发酵。与携带具有;^杆菌基因的pSB5质粒的A/wWJw"A*ll菌糾目比，曱减《氨酸的合成被提高，而异亮氨酸的合成被降低。这最可能是由于古生菌m^B酶的低y-消除酶活性所致。实施例7:表达橙色绿屈挠菌metB基因的菌株的构建和评价图2的比对显示橙色绿屈挠菌(C似wY/7d"s的MetB酶在识别磷酸高丝氨酸作为底物所需的位置处携带有一些氨基酸。为此，我们推测该酶^4lL物METB—样可能具有比该大肠杆菌酶更低的y-消除酶活性。为了^ii使用挑e迅酶对合成甲v^酸是否有利，使用寡核苷酸metBchloro和gapA-metBchloroR经PCR扩增绿屈挠菌附e出。如前所述，1^将;^杆菌的gapA启动子与附e出基因融合在一起，对于扩增启动子使用寡核苷酸gapA-metBchloroF和GapAF，对于实际的融合4吏用metBchloro和GapAF。将所得片段克隆到pACYC177(Biolabs)栽体的限制性位点5flwHI和5>"1中，得到pSB10栽体。咖fflchloro(犯QIDNO46):ACGTGGATCCGAATTCCTTATTCGTCGGCAAGAGCCTOTTGCgapA-mefflcMoroR(33-70:1860797-1860761)(SEQIDNO47):ggccgtacgggtccggtaaactgatcgatagccatatatt6caccag啦tttgttagtgaataaaagggapA-metBchloroF(1:38:,761-1860797)(SEQIDNO48):ccttttattcactaacaaatagct鹏辟atatatggctatcgatcigtttaccggacccgtacggccGapAF(1860639-1860661)(iSPQIt>NO49):acgtcccg雜caagcccaaaggaagagtga能c为了在甲硫氨酸生物合成中评价该酶，将pSB10质粒引入A附WJwCA*ll、A附e,JA/wWAAmCB和A附&JA附wAA附CBAf/rrC菌抹中，所得菌林如实施例2所述进行发酵。与携带具有大肠杆菌附WB基因的pSB6质粒的A/m^J/mWA*11菌^M目比，其中的甲琉氟酸生产显著提高。实施例8:表达酵母高丝氨酸乙酰基转移酶和来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶y^tY的菌株的构建为了体内测试谷氨酸棒状杆菌的y-消除酶活性并评价它用于生产甲琉氤酸的潜力，构建了以下菌林。使谷氨酸棒状杆菌乙g-高丝氨酸硫化氢解酶基因metY的密码子偏好改造为适于大肠杆菌，并在体外进行合成。同时添加大肠杆菌g，A启动子。随后将融合片段克隆到实施例1描述的pSBl载体的5"附fll和必"附HI位点，得到pSBll载体。将pSBll载体以及携带酵母高丝氨酸乙g转移酶的pSB7载体都转化入MG1655A附CJ/&A*11菌林和A/w"JA挑e迅A附WA菌林中，测定所生成的甲硫氨酸的量。可以显示，当以硫化氲或硫酸盐作为硫源生长时，在酵母高丝氨酸乙酰基转移酶以及经密码子改造的棒状杆菌乙酰基高丝氨酸硫化氩解酶metY存在下所生成的甲硫氨酸的量显著提高。同时，异亮氨酸的生成量显著降低。作为替代，可以使用经密码子^tit的棒状杆菌高丝氨酸转乙酰酶来代替所述酵母酶。实施例9:构建表达具有降低Y-消除活性的大肠杆菌高丝氨酸琥珀酰转移酶的菌株为了确保不经由其经典生物合成途径生成异亮氨酸，缺失了Z/vA基因和携带第二苏氨^t氨酶的tdcABCDEFG操纵子。使用如前所述的缺失策略以及以下寡核苷酸缺失/A，A基因DilvAF(SEQIDN050)Ggctgactegcaacccctgtccggtgctccggaaggtgcc^aitatttaagagcagtgctgcgcgcgccggtttacgaggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其具有—与//vA基因的序列(:3952954-3953033)同源的区域(小写字母)(参考序列在网址htto:〃fibnotistpasteur-ft/Colibri/)，—用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(参考序列在Datsenko，K.A.&WannerB丄.，2000，PNAS,97:6640-6645)，DilvAR(SEQIDN051)cctgaacgccgg^ttattggtttcgtcgt能caatogtagcccagctcattcagccgggtttcgaaatecggttcatggCATATGAATATCCTCCTTAG其具有-与,'/vA基因的序列(3954478-3954400)同源的区域(小写字母)-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。利用寡核苷酸DilvAR和DilvAF从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。随后将得到的PCR产物通过电穿孔法引入MG1655A附WBJ附WAll(pKD46)和Aw&JwCAll(pKD46)菌林中，其中表达的Red重组酶允许同源重组。然后，选择氯霉素抗性转化林，使用以下定义的寡核香酸ilvAR和ilvAF通过PCR分析验证抗性盒的插入。得到的菌林是AmetBJmetA*11A,7vA。ilvAR(3954693-3954670)(SgQ.IDNO52):gccccgaaccggtgcgtaaccgcgilvAF(3952775-3952795)(SEQIDNO53):ggtaagcgatgccgaactggc除了IlvA之外，已知苏氨酸脱水酶(TdcB)可在厌氧或微氧条件下催化苏氨^氨生成a-酮基丁酸。为了排除由该酶生成a-酮基丁酸的可能性，从A附WBJw"A*llA//vA菌林的基因组中缺失该基因。TdcB是tdcABCDEFG操纵子的一部分，该操纵子如针对前述突变体所述以相似方式使用下述四种寡核苷酸而被缺失。利用DtdcGR和DtdcAF扩增所述盒，利用tdcGR和tdcGF进行^ii。DtdcGR(3255915-3255993)'(SEQIDNO54)gctgacagc幼tgtcagccgcagaccicltttaatggccagtectecgcgtgatgtttcgcggtettlatcgttoatatcCATATGAATATCCTCCTTAGDtdcAF(3264726-3264648)(SEQIDNO55)Ggtaattaaogtaggtegttatgagcactatt^HcttccgaaaacgcagcacctggtagtcttteaggaagtcattagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGtdcGR(3255616O255640)(S￡QIDNO56)gcgtctgcaatgacgccttta加gtdcAF(3264922-3264899)(SEQtDNO57)Cgccataaaatatggttatccccg所得菌#^称作Awe氾Jm^A*l1MvAAfefcABCDEFG。为了降低大肠杆菌皿醚个合酶/硫化氢解酶(MetB)的y-消除酵活性，在参与底物半a酸结合的区域内引入突变。为此目的，使用寡核苷酸MetBF和MetBR(括号中的数字对应于大肠杆菌基因组的位置)从基因组DNA中PCR扩增大肠杆菌附WB。用尸对I和历w必I1限制性酶切消化该PCR片段，将其克隆到plJC18中相同的限制性位点内。MetBF(4125957-4125982)(SgQIDNO58):ttagacagaa￡jg￡2gcgccgctccattcagccatgagatacMetBR(4127500-4127469).(SEQEDNO59):cgtaacgcccs_^gs^aaataacacttcacatcagccagac加tgcc向;U^杆菌皿醚-y-合酶/疏化氢解酶中引入突变，导致M酸变化T335A/A337P、R49L和D45V。按照Stratagene的QuickchangeTM定点突变试剂盒，采用定点诱变方法，利用下述寡核苷酸对引入每种突变。引入限制性位点(粗体)以便一wmetBT335A/A337PF(SEQ3TO'WO60):cgcgcttctggtgccatgccfiggatgtgccatggttgcggegmetBT335A/A337PR(SEQIPNO61):cg(icgcaaccsrtggcacat￡￡gggcatggcaccagaagcgegmetBR49LF(SEQIDNO62):gaacctc欲gcgcalyattactcgcpftctgpffliaflcccaacgcgcgme舰49LR(SEQIDNOcpcfmpttgprgttofcccagacgcgagtaateatgcgctc瞎gRttc咖tBD45VF(SEQIDft4)'Raacctepapcgcatetgtact印cptepcegcaaoccaacgcgcgatmetBD45VR(SEQIDNO65):atcgcgcgttgggttgccgcgacgcgagtacacatgcgctcgaggttc通过测序a^t所得到的修饰鹏相序列，用户wi和i7/flcnn限制性酶切，并克隆到pSBl载体的相同位点。将所得质粒转化到A鹏出J鹏M,llA//pAAWMBCDEFG菌林中。如前所述在小烧^养物中评价菌株。通过厂消除作用生成的异亮氨酸的量显著降低，而甲琉氟酸的合成只有轻微影响。这与低Y-消除活性以及保留显著的toSL醚，-合酶活性有关。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>权利要求1.一种微生物，其中表达具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶中一种或几种活性、并且同时具有低γ-消除活性的酶。2.权利要求1的微生物，其中胱硫醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的Y-消除活性与大肠杆菌胱硫醚-Y-合酶相比至少低两倍，优选至少低10倍。3.权利要求1或2的微生物，其中表达接受磷酸高丝氨酸的胱硫醚个合酶/磷酸高丝氨酸硫化氢解酶。4.权利要求3的微生物，其中所述的胱硫醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶是植物的METB基因，优选拟南芥04m幼iV^/w/s幼"//"/1")的METB基因。5.权利要求1或2中任一项的微生物，其中所述的胱硫酸-Y-合酶和/或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶是酿酒酵母(5Vicc/^WYwy;cMcwev/wVie)的METB基因。6.权利要求1或2中任一项的微生物，其中所述的胱硫瞇-Y-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶来源于古生菌，优选巴氏甲烷八叠球菌7.权利要求1或2中任一项的微生物，其中所述的胱硫醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶来源于绿屈挠菌科(Chloroflexaceae)，优选樣色绿屈挽菌(C7r/tf!Yii/ZejcMS做m"&'ac"s)。8.权利要求1或2中任一项的微生物，其中所述的酶具有以下位置氨基酸中的至少两个107E、111Y、165K、403S。9.权利要求1或2中任一项的微生物，其中所述的胱硫醚个合酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶是革兰氏阳性细菌的w^Y和/或we迅基因。10.权利要求1至9中任一项的微生物，其中所述的天然或异源胱疏醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氲解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶被优化，并因而具有较低的Y-消除酶活性，从而允许以异亮氨酸为代价增强甲硫氨酸的选择性。11.权利要求l的微生物，其中表达在337位具有脯氨酸的被优化的胱硫醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶。12.权利要求l的微生物，其中表达在335位具有丙氨酸的被优化的胱硫醚卞合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶。13.权利要求1的微生物，其中表达在335位具有丙氨酸、在337位具有脯氨酸的被优化的胱硫醚-Y-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氳解酶。14.权利要求1至13中任一项的微生物，其中编码所述胱硫醚-Y-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的多核苷酸被过表达。15.权利要求1至13中任一项的微生物，其中所述的胱硫醚个合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氲解酶的催化性质被提高。16.权利要求1至15中任一项的微生物，其中引入异源高丝氨酸酰基转移酶，其允许利用相应的接受酰基高丝氨酸的胱硫醚个合酶和/或酰基高丝氨酸硫化氲解酶。17.权利要求1至16中任一项的微生物，其中数种不同的杂合途径从高丝氨酸活跃地生产高半胱氨酸和/或胱硫醚。18.权利要求1至17中任一项的微生物，其中待生产的期望氨基酸的生物合成途径中的其它基因也额外得到增强。19.权利要求1至17中任一项的微生物，其中减少期望JL^酸产生的代谢途径至少被部分降低。20.利用如权利要求1至19中任一项所述的微生物发酵制备氨基酸、特别是曱M酸、其前体或衍生物的方法，包括如下步骤a)对生产所述期望氨基酸的微生物进行发酵，b)浓缩细菌细胞或培养基中的期望产物，和c)分离发酵液和/或生物质中的期望M^/组分，任选地部分或全部(0-100%)保留在终产物中。21.权利要求20的方法，其中将硫分子/化合物从半胱氨酸转移至任何活化的高丝氨酸。22.权利要求20的方法，其中将硫分子/化合物直接从H2S转移至任何活化的高丝氨酸。23.权利要求20的方法，其中培养基中的硫源是硫酸盐或衍生物。24.权利要求20的方法，其中培养基中的硫源是硫代硫酸盐。25.权利要求20的方法，其中培养基中的硫源是H2S。26.权利要求20的方法，其中培养基中的硫源是甲基琉醇。全文摘要本发明涉及一种微生物，其中表达具有一种或几种下述活性的酶胱硫醚-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶，并且所述酶同时具有低-消除活性。本发明还涉及具有一种或几种下述活性的重组酶胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶，所述重组酶同时具有低γ-消除酶活性，并用于发酵生产氨基酸、尤其是甲硫氨酸。文档编号C12N5/00GK101374940SQ200680004126公开日2009年2月25日申请日期2006年2月7日优先权日2005年2月7日发明者格温埃勒·贝斯泰尔-科雷,菲利普·苏卡勒,雷纳·菲格申请人:代谢探索者公司