专利名称：：逆转录病毒储存方法
技术领域：
：本发明涉及在医学、药剂学、农业、林业和餘以及食物科学领fe加于通过基因转移转化细胞的逆转录病毒载体的纯化或储存的方法，以及与此相关的一系列技术。
背景技术：
：逆转录病毒载体可用于确保目的基因整合入宿主她体。因此，这些载体广泛应用于集中于耙向造血干细胞敬卜周血淋巴细胞的先体外后体内基因治疗方案的基因治疗领域。它们也作为基因表达分析的工具，广泛应用于基5她开究领域。这是因为它们可以用于实S^凍(插入的)基因的稳定^ii7K平。通常，将生产细胞的培养物上清液用过滤器过滤，并将滤液用作逆转录病毒载体。若要将逆转录病毒载体用于先体外后体内的基因治疗方案，则滤液可能要进行进一步纯化。但是，由于纯化病毒载体是复杂的，而且回收率低，因此上述方法存在问题。还未发现有描述纯化的病毒载体的稳定性的科学文献。逆转录病毒载体生产细胞的培养物上清液通常用过滤器过滤后以冷冻状态储存在深度冷冻机中。在溶液状态的解冻载体的稳定性低。已报道了半衰期为在《C下92小时、在(TC下18-64小时、在32。C下11-39小时或在37。C下7-9小时(非专利文献1、非专利文献2)。由于如上所述，逆转录病毒载体的稳定性低，所以冷藏的逆转录病毒载体通常在f顿时才解冻，并且要立即fOT。专利文献1描述了一种冻T^后储存重组逆转录病毒的方法。此方法要求冻干设备，，求在〗OT时重构储存的重组逆转录病毒的步骤。专利文献2、专利文献3或非专利文献3描述了在一种具有逆转录病毒结合活性的物质(特别是纤连蛋白片段)存在的情况下，感染逆转录病毒的基因转移方法。但该物质对逆转录病毒稳定性的影响尚属未知。专利文献l:US5792643专利文献2:WO95/26200专利文献3:WO97/18318非专利文献l:McTaggart，S.，Al-Rubeai，M.，Biotechnol.Prog.，16(5):859-865(2000)非专利文献2:Kaptein丄C.，等人，GeneTher.，4(2):172-176(1997)非专利文献3:H醒beig，H.等人，Nat.Med.，2(8):876~882(1996)
发明内容发明解决的问题如上所述，人们必须在将冷藏的逆转录病毒载体解冻后迅速对其进行处理，并立即用它感染细胞。因此，如果感染步骤的进度表由于某种原因被打乱了(例如，要用逆转录病毒载体感染的细胞的延迟生长)且解冻之后不旨泣即将逆转录病毒载体用于感染细胞，则可能不能实现充分感染的效率。因此，需要一种将逆转录病毒载体以准备着立即使用的状态稳定地储存的方法。解决问题的方式本发明的发明人试图开发出一种将逆转录病毒稳定储存在未冷冻的低温中同时保持基因转移活性的方法。作为充分研究的结果，本发明的发明人已发现通过在低温将逆转录病毒维持结合于涂有具病毒结合活性物质的固体支持体，可使逆緑病毒以准备着立即i顿的状态，甚至在解冻状态稳定地储存。因此，已经完成了本发明。本发明的第一个方面涉及一种储存逆转录病毒的方法，该方&^含在固定在固体支持体上的具有逆转录病毒结合活性的物质存在的条件下维持逆转录病毒。根据第一个方面，逆转录病毒會,以解冻状态维持。例如，在储存方法的一个实施方案中逆转录病毒可被维持在溶液中，该溶液不与空气接触。根据第一个方面，逆转录病毒可与期ti^转录病毒生产细胞衍生的组分相分离。例如，在该实施方案中逆转录病毒可维持在含有磷酸盐作为缓冲组分的缓冲液中。另外，逆转录病毒可i柳作为缓冲液的包含选自蛋白质和糖类的物质的溶液维持。根据第一个方面的逆转录病毒储存方法所使用的具有逆转录病毒结合活性的物质的实例包括具有纤连蛋白的肝素-n结构域的多肽、成纤维细胞生长因子、具有V型胶原的胰岛素结合结构域的多肽、DEAE-葡聚糖和^氨酸。本发明的第二方面涉及包含逆转录病毒的组合物，其中该组合物包含于带有固体支持体的容器中，所述的固体支持体上固定有具有逆转录病毒结合活性的物质，并且iM转录病毒结合在具有逆转录病毒结合活性的物质上。例如，第二方面的组^t/中的逆转录病毒可包含于容器内的溶液中，该溶液不与空气接触。在第二方面的组合物中，可包含从其jt!^转录病毒生产细胞衍生的组分分离出的逆转录病毒。该组合物可包含含有磷te作为缓冲组分的缓冲液。另外，该组合物可包含在溶液中的选自蛋白质和糖类的物质。用于根据第二个方面储存逆转录病毒的具有逆转录病毒结合活性的物质的实例包括具有纤连蛋白的肝素-n结构域的多肽、成纤维细胞生长因子、具有v型胶原的胰岛素结合结构域的多肽、DEAE-葡聚糖和，氨酸。本发明的效果根据本发明，可以储存逆转录病毒，从而使其可以立即进行基因转移。有可能进行可重复的基因转移，因为相同质量的逆转录病毒结合容器可被稳定地储存。此外，如果《顿透气的细胞培养袋或分离袋作为储存容器来保持封闭系统，那么本发明可使在低温下运输成为可能。附图简述图1显示相对于对照所观察至啲转移效率的基因转移效率值。图2显示相对于对照所观察到的转移效率的基因转移效率值。实施本发明的最佳方式对于根据本发明所用的逆转录病毒没有特别的限制。为了进行基因转移，根据本发明通常使用人工修饰的重组逆转录病毒(即逆转录病毒载体)。特别地，对于防止无限制的感染或基因转移，复制缺陷型逆转录病毒载体是雌的。这样的载体被制成复制缺陷型，从而使其在感染的细胞内不能自主复制，并因而无毒性。这样的载体可侵入宿主细胞，例如脊椎动物的细胞(尤其是哺乳动物的细胞)，以稳定姻繊Alt匕载体的夕卜，因^到染色体的DNA中。已知的复制缺陷型逆转录病毒载体的实例包,转录病毒载体(例如MFG载体、a-SGC载体(WO92/07943)、pBabe(MoiBenstem，J.R，Land,H.，NucleicAcidsResearch,18(12):3587-3596(1990))、pLXIN(clontech)或pDON画AI(TakaraBio))、慢病毒载体(人免疫缺陷病毒(HIV)衍生载体、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)衍生载体等)及其斷布。对于逆转录病毒载体携带的外来基因没有特别的限制。在目的细胞中想要敲的樹可基因都可被插入。其实例包彌码多肽(酶、生长因子、细胞因子、受体、结构蛋白等)的基因、反义RNA、核酶、诱杀剂和弓胞RNA干扰的RNA。根据本发明，可能〗OT在适当启动子(例如逆转录病毒载体中的LTR启动子或外来启动子)的控制下插A^转录病毒载体的外来基因。载体中可存在另一种与启动子和转录起始位点(例如增强子序列)协同的调节元件，以完戯卜来基因的转录。im地，转移的基因可包含在其下游的终止子序列。此外，可包括适当的标记基因(例如，抗药性基因，编码荧光蛋白的基因，编码可起报道分子例如3-半乳糖苷酶或萤光素酶作用的酶的基因)，所述标记基因使得育继择具有转移的基因的细胞。可按照已知方法制备逆转录病毒，并根据本发明使用该病毒。对制备方法没有特别的限制。如果4顿逆转录病毒载体，则根据本发明可4顿从适合于逆转录病毒的逆转录病毒生产细胞培养物中收集的上清液。逆转录病毒生产细胞可为上清液中稳定产转录病毒颗粒的细胞，或在用逆转录病毒载体质粒转染后短暂产顿转录病毒颗粒的细胞。已知的包装细胞系，例如PG13(ATCCCRL-10686)、PA317(ATCCCRL誦9078)、GP+E-86或GP+envAm-12(US5,278,056)或Psi画Crip(Danos，O.，Mulligan,R.C，Proc.Natl.AcadSci.USA，85(17):6460-6464(1988))可用来制备逆转录病毒生产细胞。转染效率高的293细胞或293T细胞可用来制备逆转录病毒生产细胞。根据本发明也可能j顿舰假型包装制备的逆转录病毒，其具有来源于病毒的被膜，所述病毒不同于得到逆转录病毒载体基因组的病毒。例如可使用具有来源于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、水泡性口膜炎病毒(vsv)或猫内源性病毒的被膜或可作为被膜起作用的蛋白质的假型逆转录病毒。此外，人们可制备在其表面具有进行擗连傲布的蛋白质的逆转录病毒载体。可用具有参与糖基化作用等的酶的转移基因的逆转录病毒生产细胞，来制备逆转录病毒载体。这样的逆録病毒载体也可根据本发明^顿。(A)本发明逆转录病毒的储存方法本发明提供了一种用于储存逆转录病毒的方法，该方法包含以解冻状态在固定在固体支持体上的具有逆转录病毒结合活性的物质存在的条件下维持逆转录病毒。对根据本发明的方齒顿的用于储存逆转录病毒的容器没有特别柳蹄lj，只要其适于储存生物学材料(例如细胞或，样品)或可用于培养细胞即可。其实例包括培养平板、培养瓶、分离袋和3tn的培养袋。根据本发明，对固定有具有逆转录病毒结合活性的物质的固体支持体没有特别的限制。可以使用各种形式的固体支持体，包括珠和纤维。本发明使用由在细胞培养期间当与细胞接触时对细胞维持或生长无有害影响的材料制成的固体支持体。在一个的实施方案中，将以上所述用于储存逆转录病毒的容器用作固定具有逆转录病毒结合活性的物质的固体支持体。在该实施方案中，与内容物接触的容器表面涂上具有逆转录病毒结合活性的物质。具有逆转录病毒结合活性的物质包括纤连蛋白、具有肝素-n结构域的纤连蛋白片段(CH-296(RetroNectin)，CH-271,H-296等)、成纤维细胞生长因子、具有V型胶原的胰岛素结合结构域的多肽、DEAE-葡聚糖和聚赖氨酸。对将具有逆转录病毒结合活性的物质固定在固体支持体表面的方法没有特别柳蹄U。可选择适于要使用的具有逆转录病毒结合活性的物质的方法。在示例的方法中，使包含该物质的缓冲液与用i顿的固体支持体接触静置一定时间段。专利文件2和3也描述了固定该物质的方法。虽然不预期限制本发明，但根据本发明tm斷氐与包含逆转录病毒的溶液接触的空气量。本发明的一个实施方案以一种方法为例，其中使用的容器具有装盛溶液的结构，从而使溶液不与空气接触。如果4顿固定体积的容器，那么该实施方案可通过用包含逆转录病毒的溶液装满容器来实现。选择性地，可以容纳任意体积的溶液，从而溶液不与空气接触。根据溶液的体积，通过使用由薄膜样的基体组成的内体积可以改变的囊或袋形式的容器可以实现这一点。根据本发明使用的容器可以装盛在密封或不透气状态的包含逆转录病毒的溶液。更^[，地，根据本发明可JOT市场上可买到的细胞培养袋。^ffi逆转录病毒生产细胞收集的上清液、从上清液中纯化的逆转录病毒等可用作根据本发明储存的逆转录病毒。例如，根据本发明的方法可将以前冷藏的上清液或纯化的逆转录病毒在解冻状态下储存。在本发明的一个实施方案中，储存从其^^转录病毒生产细胞衍生的组分中分离出来的逆转录病毒。该实施方案通常按以下步骤进行(1)将在其上固定有具有逆转录病毒结合活性的物质的固体支持体与包含逆转录病毒的逆转录病毒生产细胞培养物上清液接触的步骤；(2)洗涤步骤(1)的固体支持体的步骤；以及(3)将步骤(2)所获得的固体支持体维持与缓冲液相接触的步骤。如果利用预先已纯化的逆转录病毒代替逆转录病毒生产细胞的上清液，则步骤(2)可省略。在该实施方案中，逆转录病毒的感染力保持在较高的水平，因为阻抑了由逆转录病毒生产细11±清^^含组分弓l起的逆转录病毒的灭活。对逆转录病毒结合具有逆转录病毒结合活性的物质的方法没有特别的限制。例如，结合可按如下所皿行；将逆转录病毒生产细胞培养物上清液与在其上固定有该物质的固体支持体接触静置；利用离心力使逆转录病毒沉淀在固体支持体表面；或摇动装有固体支持体和逆转录病毒的容器。从容器中取出上清液，作为战方法的结果，逆转录病毒M31结激转录病毒物质与所述容器相结合，任选地洗涤固体支持体(例如，容器本身)，并将适于储存逆转录病毒的溶液加入容器中。对用来洗涤结合有逆转录病毒的固体支持体的溶液没有特别柳蹄U，只要它不显著地降低储存的逆转录病毒的感染力。例如，可以使用生S^水、磷酸缓冲盐水或与用于培养逆转录病毒生产细胞的相同的培养基。特别是，使用如下所述用来储存逆转录病毒的溶液。由于逆转录病毒生产细胞的上清液包含抑制细胞被逆转录病毒感染的物质，所以与其他逆转录病毒生产细胞衍生的组分分开保存的逆转录病毒有利于用于感染细胞。根据本发明，通过与结合逆转录病毒物质相结合并与适当溶液相接触来储存逆转录病毒。虽然对该步骤所用的溶液没有特别的限制，只要其不显著降低储存的逆转录病毒的感染力即可，但tt^MCT包含磷酸盐(磷酸钠、磷酸钾等)作为缓冲组分的缓冲液。该溶液可进一步包含糖类(葡萄糖、半乳糖、乳糖、甘露糖醇等)、蛋白质(清蛋白、胶原(明胶)等)或另一种组分(无机盐、多元醇、AifiL清等)作为稳^转录病毒的组分。根据以上戶;M储存方法可将逆转录病毒在解冻状态下储存。然而，储存的逆转录病毒感染细胞的能力保持在比储存的逆转录病毒培养物上清液更高的水平上。虽然对本发明没有特别的限制，但是根据本发明低温储存逆转录病毒的时间段为24小时或以上，48小时或以上，更优选72小时或以上。如此处所《顿的，低温指15'C或以下，在戶服鹏要储存的溶液不冷冻。tt将逆转录病毒储存于O-l(TC。根据本发明的方t封诸存在容器中的逆转录病毒可按照原样用于感染。如果该逆转录病毒为携带外来基因的重组逆转录病毒，则可通过该方法将基因转移到细胞中。例如，可以通过在将容器中的溶液更换成适于用逆转录病毒感染细胞的溶液之后(或者，如果储存的溶液适于用逆转录病毒感染的话，则无须更换)，将想要感染的细胞加入容器来进行逆转录病毒的感染。替代地，可通过向取出了所装溶液的储存容器中加^胞悬浮液行逆转录病毒的感染。可在静置培养中进行感染步骤。可选择地，可根据方法进行感染步骤，在戶，方法中通过施用离心力将细胞沉淀到固定有具有逆转录病毒结合活性的物质的固体支持体表面上使逆转录病毒与细胞相接触。用逆转录病毒感染的耙细胞可以按照原样在容器中培养，或者也可在进行上述方法之后将其转移至拐一个容器中且然后培养。如果结合逆转录病毒的物质对耙细胞也有亲和力，则作为上述方法的结果，耙细胞与逆转录病毒共定位在容器表面。然后，高效发生逆转录病毒对耙细胞的感染。例如，可通过使用携带目的外因的重组逆转录病毒和具有造血干细胞结合活性的多肽CH-296,来高效地将基因方便地转移到造血干细胞中。本发明的另一个实施方案以一种逆转录病毒储存方法为例，其中4顿了固定有具有逆转录病毒结合活性的物质和具有耙细胞结合活性的物质的固体支持体。根据该方法，使用在其中与具有逆转录病毒结合活性的物质及具有耙细胞结合活性的物质一起储存逆转录病毒的容器，作为用于用逆转录病毒感染耙细胞的容器。因此，该方法对于需要高效和减细IM择性的基因转移的基因治疗领鄉其有用。用于上述实施方案的具有耙细胞结合活性的物质的实例包括但不限于，能识别靶细胞的蛋白质或肽(识别耙细胞表面组分的抗体或受体、耙细胞表面受体的配体(生长因子、激素、细胞因子等))、凝集素、辦连和糖脂。在非专利文献3中也描述了此类物质和其固定方法。(B)本发明的组合物本发明提供了适于储存形式的包含逆转录病毒的组合物。该组合物中的逆转录病毒包含于容器中，与在固体支持体上固定的具有逆转录病毒结合活性的物质结合。可根据关于逆转录病毒储存方法的上述说明制备该组合物。具有逆转录病毒结合活性的物质可由根据逆转录病毒的储存方法舰的战物质示例。在本发明的一个实施方案中，示例的组合物包含溶液中的逆转录病毒，该溶液不与空气相接触。可将组合物从其他逆转录病毒生产细胞衍生的组分中分离出来。这样，雌组合物进一步包含适于逆转录病毒储存的溶液。根据逆转录病毒储存的方法可^ffi的，溶液可用作适于逆转录病毒储存的溶液。尽管根据本发明4顿的容器没有特别的限制，只要它适于生物学材料的储存(例如，细胞或体液样品)或可用于培养细胞，但该容器能以密封或不透气状态来容纳包含逆转录病毒的溶液。例如，可使用市场上可买到的细胞培养袋。本发明的包含逆转录病毒的组合物具有极好的储存稳定性，并可立即用于用逆转录病毒感染细胞。因此，它对逆转录病毒的研究以及在医学领域，尤其是在{顿重组逆转录病毒载体的基因治疗领域中很有用。实施例下列实施例对本发明进行了更详细的说明，但不l鹏释为限制了其范围。实施例11.涂有CH-296的平板的制备将浓度为20iug/ml的500iLU纤连蛋白片段CH-296(产品名RetroNectin;TakamBio)加入到没有进行表面处理的2冬孔平板(Falcon)的旨孔中。使该平板在4。C静置过夜，在室，2%BSA/PBS封闭30射中，并用PBS洗涤。该平板ICT作涂有CH-296的平板，且在需要时制备。2.逆转录病毒载体的制备如下所述构，转录病毒载体质粒pDOG-polH。首先，利用限制酶Nhel和Notl切割rsGFP皿载体pQBI25(Qbiogene)以得到775-bpGFP基因片段。然后，利用限制酶NheI和NotI切割pQBIpoin(Qbiogene)，来取出rsGFP-NeoR融合基因。将此前获得的775-bpbGFP基因片段插入，以得到载体pQBIpoin(neo-)，其中在poin启动子控制下魏rsGFP基因。禾,限制酶Xho1消化pQBIpolH(neo-)，以获得包含在polH启动子控制下的GFP皿单位的DNA片段。用DNA平端化试剂盒(TakamBio)使末端平端化。将用限制酶Xhol和Sphl消化逆转录病毒载体质粒pDON-AI(TakaraBio)获得的4.58kbp载体片段的末端利用DNA平端化试剂盒(TakamBio)平端化，然后用碱性磷酸酶(TakamBio)去磷酸化。4顿DNA连接试剂盒(TakaraBio)，将此前平端化的包含在polH启动子控制下的rsGFP皿单位的DNA片段插入该平端化载体，以获得rsGFP鞑重组逆转录病毒载体pDOG画poin。利用载体pDOG-polH和逆,病毒包装i式剂盒Eco(TakaraBio)进行瞬时病毒生产，来获得亲嗜性病毒DOG-poin。利用亲嗜性病毒DOG-polH，在RetroNectin(TakaraBio)存在的情况下，感染GaLV逆转录病毒^细胞PG13(ATCCCRL-10686),以获得基因-转化的细胞PG13/DOG-poin。将PG13/DOG-polH在包含10%胎牛血清(ThermoTrace)的Dulbecco氏改进Eagle培养基(DMEM，Sigma)中培养。当细胞生长到半汇合时，将培养基更换成0.1ml/cm2的包含10。/。胎牛血清的il羊DMEM。24小时之后，将上清液M:0.45|Lim过滤器(Mllipore)过滤，以获得GaLV/DOG-poin病毒的上清液。将如此得到的病毒上清液的等分试样保存在-8(TC的冷冻机中，并进行以后的储存和基因转移实验。3.病毒上清液效价的测量根据标准方法(Markowitz，D,等人，J.Virol.，62(4):1120-1124(1988))，利用HT-1080细胞(ATCCCCL-121)测量病毒上清液的效价。具体地说，将含有10%胎牛血清的2毫升DMEM中的5xl04HT-1080细胞加入到6孔组织培养平板的每个孔中，并在5%C02，37。C条件下培养过夜。通过吸取除去培养基将1毫升连续稀释的病毒上清液加入L中，另外向其中加入终浓度为8|ag/ml的海地美溴铵(溴化己二甲铵，Aldrich)。在5%C02、37。C条件下培养细胞4到6小时。另外向其中加入1毫，含10%胎牛血清的DMEM，并继纟彭咅养72小时。用'M细胞仪FACSVantage(Becton-Dickinson)对从平ISJ:收集的细M行分析，并测定皿rsGFP的HT-1080细胞的比率。根据由每L输/iffl胞的数目乘以，rsGFP的细胞的比率和病毒上清液的稀释比率所获得的值，计算在1毫升上清液中感染tW粒的数目(I.VP./ml)，来测定病毒效价。实施例1-2制备的病毒上清液的效价在1.9xl05I.VP./ml到4.5xl05I.VPyml范围内。实施例2《OT涂有CH-296的平ltt储存逆转录病毒(1)利用K-562细胞(ATCCCCL-243)估定GaLV/DOG-polH病毒上清液的活性。将K-562细胞在包含10。/。胎牛血清(ThemioTrace)的RPMI-1640培养基(Sigma)中培养。将250!xl的GaLV/DOG-polH病毒上清液(原始浓度)加入24孑L涂有CH-296的平板的^孔中，在37匸条件下在5%0)2培养箱中培养该平板4小时，以结合逆转录病毒载体。用500nl的PBS(磷酸缓冲S7jO、0.1%牛血清清蛋白(BSA，FractionV，Sigma)的PBS溶液、1%牛血清清蛋白的PBS溶液、X-VIVO15(Cambrex)、X-VIVO10(Cambrex)、IMDM(Invitrogen)或RPMI1640(Sigma)洗涤*孔两次。用500pl相同的溶液充满孔，并将该平板在4°C温育7天。另外，向針孔加入病毒上清液，并温育该平板7天，其中不进行洗涤(病毒上清液按照原#^显育)。在第7天，取出溶液，加入500W包含密度为4xl04个细lfi/ml的K-62细胞的悬浮液，并在5%C02，37。C^f牛下培养细胞，以用于基因转移。作为对照，用相同批次的病毒上清液和相同方法制备病毒结合的平板，并为了基因转移立即加入K-562细胞，而不在4X:温育。使用rsGFP基因的皿作为指标，测定细胞的基因转移效率。图1显示了温育7M后，相对于对照所观察到的转移效率的病毒基因转移效率的值。如图1戶标，i顿所有溶液的比按照原样静置的病毒上清^^观察到的保持更高的活性。因此，表明对从逆转录病毒生产细胞上清液分离出来的逆转录病毒的储存是有效的。特别地，证明了包含牛血清清蛋白的溶液在稳定储存上是有效的。实施例34OT涂有CH-296的平板储存逆转录病毒(2)在实施例2中表明通过洗涤逆转录病毒-结合的容器增加了储存稳定性。接下来，检查下列物质对逆转录病毒储存的影响以寻找能更有助于增加储存稳定性的溶液，这，质包括无机盐(磷酸钠；氯化f丐和硫勝美的混合物；磷酸钠、氯化钙和硫酸镁的混合物)；糖类(葡萄糖；D"山梨糖醇；精制白糖；麦芽糖；果糖；乳糖；D-甘露糖醇)；大分子化合物(羧甲基纤维素钠；甲基纤维素；羟丙基纤维素；丙二醇；聚乙二醇400);蛋白质(纯化的明胶；AifiL清清蛋白(HSA))。战物质中，无机盐溶于注射用水，且其他物质溶于PBS。然后，测试其对逆转录病毒储存稳定性的作用。除了在37"C进行逆转录病毒-结合的容器的储存温育3小时外，研究方法謝盾实施例2。结果，与只用PBS相比，使用下列物质观察到逆转录病毒载体储存的稳定性增加，这些物质为40mM磷勝内缓冲液(pH7);0.5mM氯化转和1mM硫酸镁的20mM磷酸缓冲液溶液(pH7);1.5-20。/。AJL清清蛋白的PBS溶液；0.5-2.5%纯化的明胶的PBS溶液；或5。/。乳糖的PBS溶液。作为上述观赋的结果，禾,40mM磷M缓冲液作为基碰凝惧有优于PBS的倾向，而且蛋白质和糖类也增加了稳定性。然后，利用下列物质按照实施例2描述的方法在4。C进行7天的逆转录病毒储存的稳定性观赋，这働质为P/。牛血清清蛋白的PBS溶液；1.5G/。Aifil清清蛋白的40mM磷酸缓冲液溶液；0.5%纯化的明胶的40mM磷髒内缓冲液溶液；或5。/o乳糖的40mM磷酸钠缓冲液溶液。在所有情况中磷,缓冲液的pH均为7.0。计算了7天温育后，相对于对照所观察到的转移效率的病毒基因转移效率的值，并在图2显示。如图所示，表明在更换成各个溶液之后，与按照原样进t，转录病毒生产细胞上清液的储存相比，储存的储存稳定性有了显著增加。实施例4在各种功能性物质存在下储存逆转录病毒在该实施例中，用显^转录病毒结合活性和细鹏占着活性的功能性物质估定储存稳定性。除了CH-296之外，可使用下列物质作为显示逆转录病毒结合活性和细胞粘着活性的功能性物质CH-271或H-296(Kimizuka，F.等人，J.Biochem.，110(2);284-291(1991));DEAE-葡聚糖(Sigma);聚画L-赖氨酸(平均分子量30,000到70,000，ICN);DEAE-葡聚糖和纤连蛋白片段C-CS1的混合物(Kimizuka，F.等人，J.Biochem.，110(2):284-291(1991));或聚-L國赖氨酸和C-CS1的混合物。向未进行表面处理的24孑L平板(Falcon)的旨孔中加入500pl的纤连蛋白片段CH-296、CH-271或H-296(20|ug/ml)、DEAE-葡聚糖的PBS溶液(0.9mg/ml)或聚-L-赖氨酸的PBS溶液(40pg/ml)。ffl31向终浓度为4.4fig/ml的DEAE-葡聚糖溶液或聚-L-赖氨酸溶液中加入C-CS1，来制备DEAE-葡聚糖和C-CS1的混合物以及聚-L-赖氨酸和C画CSl的混恤将平板在4。C静置过夜，在室温利用2%BSA/PBS封闭30倂中，并用PBS洗涤。将此平板用作涂有功能性物质的平板，并用于逆转录病毒储存稳定性测试。根据如实施例2戶舰方法用涂有各种功能性物质的平,t彌转录病毒储存稳定性测试。以下列三种病毒储存方式进行测试按照原样储存病毒上清液;将其储存在40mM磷勝内缓冲液(pH7.0)中；及将其储存在1.5。/。Aifl清清蛋白的40mM磷聯内缓冲液溶液(pH7.0)中。计算了7天温育后，相对于对照所观察到的转移效率的病毒基因转移效率的值，并在表1显示。不仅^ffi涂有具有纤连蛋白的肝素-n结构域的多肽(CH-296、CH-271或H-296)的平板，而且j顿涂有DEAE-葡聚糖或繊氨酸的平板，来保持高水平的基因转移效率。表明用这样的物质储存逆转录病毒是有效的。另外，与具有细胞-结合活性的物质(C-CS1)共存不影响使用，物质进行的储存。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例5用透气培养袋储存逆转录病毒把CH-296用于未经表面处理的24孑L平板(Falcon)皿气培养袋(X-FOLD，85cm2，Nexell)中，并进行下列实验。如下戶;fii用CH-296涂布X-FOLD。首先，向齡袋中加入9mlCH-296(20|ag/ml)，并使袋在4。C静置过夜。然后用30ml的PBS洗涤^H次，来获f縣有CH-296的袋。根据如实施例1戶腿的方法用CH-296涂布24孑L平板。向涂有CH-296的24孑L平板的^h孔中加入500|iilGaLV/DOG-polU病毒上清液的4倍##物，并在37。C在5%C02培养箱中温育平板4小时以结激转录病毒载体。向X-FOLD中加入22ml相同的GaLV/polD病毒上清液稀释物，从袋中除去空气，给袋密封，并在5%C02，37X:温育4小时以结傻转录病毒载体。用40mM磷勝内缓冲液(pH7.0)或1.5。/oAlfil清清蛋白的40mM磷勝内缓冲液溶液(pH7.0)(24孑L平板舰500^U，袋舰30ml)洗涤容器两次。用相同溶液充满L或袋；如果是袋，在排出空气后密封袋；在4。C温育该平板或袋7天。另外，向涂有CH-296的平板或涂有CH-296的袋中加入相同的病毒上清液稀释物；如果是袋，在排出空气后密封袋；并仍然在4"C温育该平板職7天。在第7天，从容器中取出溶液，加入包含密度为4xl04个细胸ml的K-562细胞的悬浮液(24孑L平板4顿500|il，袋{顿22ml)，并在5%C02，37。C温育此平板或袋，皿行基因转移。作为对照，用相同批次的病毒上清液和同样的方法制鍋眷结合的容器，并立即加入K-562细胞，而不在4'C下温育，鄉行基因转移。计算了7天温育后，相对于对照所观察至啲基因转移效率的基因转移效率的值。当按原样将逆转录病毒上清液稀释物保存在平板中时，与对照相比，观察到基因转移效率仅为10%#低。另一方面，当在密封袋中进行储存或当将逆转录病毒与CH-296结合后洗涤容器(平板或袋)来更换溶液时，观察到基因转移效率与对照相比超过了60%。根据这些结果，表明当转录病毒在具有逆转录病毒结合活性的物质存在下储存时，通过防止包含逆转录病毒的溶液接触空气和/劍每逆转录病毒与逆转录病毒生产细紙清液分离，显著阻抑了逆转录病毒感染力的降低。实施例6逆转录病毒的长期储存利用包含10%胎牛血清的RPM-1640培养^释GaLV/DOG-poin病毒上清液(3.3xl0M.VP./ml)，来制备2倍，物。向按照实施例1所述制备的涂有CH-296的24孑L平板的針孔中加入500##物，在37°。在5%(302培养箱中温育此平板4小时以结合逆转录病毒载体。用500的40mM磷,缓冲液(pH7.0)或1.5。/。Ml清清蛋白的40mM磷,缓冲液溶液(pH7.0)来洗》評板的每个孑L两次。用相同的缓冲液充满孔，在4"C温育该平板。另外，向每个孔中加入病毒上清液的2倍##物，并在4'C温育该平板，不进份先涤(按照原样温育病毒上清液)。在温育开始后l、2、3或4周取出溶液，加入500W包含密度为4xl04个细鹏ml的K-562细胞的悬浮液，并在5%C02，37。C培养细胞，5j6i行基因转移。对于按照原样与病毒上清液温育的孔，用500(al的40mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤L一次，加入500^1的包含密度为4xl04个细鹏ml的K-562细胞的悬浮液，并在5%0)2，37'C培养细胞，^S行基因转移。作为对照，用相同批次的病毒上清液和同样方法制鍋^"结合的平板，并立即加入K-562细胞，其中不在4匸进行温育，鄉行基因转移。测定接受基因转移的细胞的基因转移效率。计算各自实验组的相对于对照所观察到的转移效率的病毒基因转移效率(即剩余效价(remainingtiters))的值，并在表2显示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(表格中显示百分比值)如表2所示，当按照原样储存病毒上清液时，两周后效价减少了1/10或更低。另一方面，当从培养物上清液(用另一种缓冲液替代培养物上清液)中分离出逆转录病毒时，储存4周后{親40%或更高的效价。当4柳包含蛋白质(AlfiL清清蛋白)的缓冲液时，观察至肿寺别优良的储存稳定性。实施例7^f華的逆转录病毒的储存利用包含10%胎牛血清的RPM-1640培养^释GaLV/DOG-poin病毒上清液(3.3x105I.VPyml)，来制备2、4、8或16倍^f鞭。向按照实施例1所述制备的涂有CH-296的24孔平板的每个孔中加入500稀释物，在37'C在5%C02培养箱中温育此平板4小时以结，转录病毒载体。用500|al的40mM磷勝内缓冲液(pH7.0)或1.5。/。AlfiL清清蛋白的40mM磷,内缓冲液溶液(pH7.0)来微評板的^孔两次。用500W相同的缓冲液充满孔，并在4。C温育该平板。另外，向每个孔中加入病毒上清液的一种稀释物，并在4'C温育该平板，不进t节先涤(按照原样温育病毒上清液)。在温育开始后1、2、3或4周取出溶液，加入500iol包含密度为4xl04个细胞/ml的K-562细胞的悬浮液，并在5%C02，37"C培养细胞，皿行基因转移。对于按照原样与病毒上清液温育的孔，用500pi的40mM磷勝内缓冲液(pH7.0)洗涤孔一次，加入500pl的包含密度为4xl04个细胞/ml的K-562细胞的悬浮液，并在5%C02，37卩培养细胞，，行基因转移。作为对照，用相同批次的病毒上清液和同样方法制鍋眷结合的平板，并立即加入K-562细胞，而不在4'C温育，^3t行基因转移。测定接受基因转移的细胞的基因转移效率。计算了各自实验组的病毒基因转移效對目对于对照所观察到的转移效率的值，如表2所示。计算储存后相对于对照所观察到的转移效率的病毒基因转移效率(即剩余效价)的值，并在表3显示。3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>如表3所示，当按照原样储存病毒上清液的,物时，不管稀释比率如何，观察到的效价都fflil斷氐。另一方面，当将病毒上清液的,物结合在平板上，并用另一种缓冲液替代培养物上清液时，效价的降低被显著阻抑了。使用的病毒上清液的稀释比率对于病毒效价的储存稳定性没有明显影响。特别地，当使用包含蛋白质(AifiL清清蛋白)的缓冲液时，根本观察不到稀释比率的影响。根据这些结果，表明本发明的方法对于储剤氐效^^转录病毒或##的病毒上清液是有效的。工M用性本发明提供了一种储存逆转录病毒的方法和包含逆转录病毒的组合物。根据该储存方法，可将逆转录病毒以准备着立即用于感染细胞的状态来保存。因此，它顿转录病毒研究和包括基因治疗在内的医学领域中是有用的。组合物在相同领域中也是有用的。权利要求1.一种储存逆转录病毒的方法，该方法包含在固定在固体支持体上的具有逆转录病毒结合活性的物质存在下维持逆转录病毒。2.根据权利要求i的方法，其中戶;M^转录病毒以解冻状态维持。3.根据权利要求1的方法，其中所，转录病毒维持在溶液中，该溶液不与空气接触。4.根据权利要求1的方法，其中所，转录病毒与其^M转录病毒生产细胞衍生的组分分开维持。5.根据权利要求4的方法，其中朋，转录病毒维持在包含磷酸盐作为缓冲组分的缓冲液中。6.根据权利要求4的方法，其中所^M转录病毒维持在包含选自蛋白质和糖类的物质的溶液中。7.根据权利要求1的方法，其中戶脱具有逆转录病毒结合活性的物质选自具有纤连蛋白的肝素-n结构域的多肽、成纤维细胞生长因子、具有V型胶原的胰岛素结合结构域的多肽、DEAE-葡聚糖和HM氨酸。8.包含逆转录病毒的组合物，其中该组合物包含于带有固体支持体的容器中，所述的固体支持体上固定有具有逆转录病審结合活性的物质，并且该逆转录病毒结合在具有逆转录病毒结合活性的物质上。9.根据权利要求8的组合物，其中戶/f^转录病毒包含于容器内的溶液中，该溶液不与空气接触。10.根据权利要求8的组合物，其中所，转录病毒包含于容器内，与其fe^转录病毒生产细胞衍生的组分分离。11.根据权利要求10的组合物，其进一步包含含有磷酸盐作为缓冲组分的缓冲液。12.根据权利要求10的组合物，其进一步包含溶液中的选自蛋白质和糖类的物质。13.根据权利要求8的组合物，其中戶脱具有逆转录病^"结合活性的物质是选自具有纤连蛋白的肝素-n结构域的多肽、成纤维细胞生长因子、具有V型胶原的胰岛素结合结构域的多肽、DEAE-葡聚糖和繊氨酸的物质。全文摘要一种逆转录病毒储存方法，其特征在于在固定在固相上的具有逆转录病毒结合活性的物质存在下维持逆转录病毒。进一步地，提供了一种逆转录病毒组合物，其特征在于将以结合到具有逆转录病毒结合活性的物质上的形式的逆转录病毒密封在容器中，所述容器中带有在其上固定有具有逆转录病毒结合活性的物质的固相。文档编号C12N15/09GK101115830SQ20068000420公开日2008年1月30日申请日期2006年2月6日优先权日2005年2月7日发明者加藤郁之进,奥山洋美,峰野纯一,浅田起代藏,片山康,蝶野英人申请人:宝生物工程株式会社