肌醇六磷酸酶的制作方法

专利名称：肌醇六磷酸酶的制作方法
肌醇六磷酸酶本发明涉及编码呈现肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列、相应编 码的肌醇六磷酸酶多肽、制备该多肽的方法及其在多种工业应用中，尤其 是在动物饲料中的用途。肌醇六磷酸或肌醇1，2，3，4，5，6-六二氢磷酸盐(也称为肌醇六磷酸盐)是 植物种子中肌醇的原始来源及磷酸盐的原始储存形式。事实上，其在种子 和谷粒成熟过程中天然地形成。在豆类种子中，砩酸盐含量为约70%,并 且在结构上与蛋白质体整合为肌醇六磷酸钓镁，即肌醇的混合的钾、镁和 钙盐。种子、谷粒和豆类是食物和饲料制品(尤其是动物饲料制品)的重要 组分。但是谷类和豆类也在人类食物中变得日益重要。肌醇六磷酸的磷酸部分螯合二价和三价阳离子，例如金属离子，即营 养必需的离子，钙、铁、锌和镁，以及微量矿物锰、铜和钼。除此之外，肌醇六磷酸也在一 定程度上通过静电相互作用结合蛋白质。 在pH值低于蛋白质等电点(pl)时，带正电荷的蛋白质直接与肌醇六磷酸盐 结合。在pH高于pl时，带负电荷的蛋白质通过金属离子与肌醇六磷酸盐 结合。由于肌醇六磷酸及其盐肌醇六磷酸盐不能从胃肠系统吸收，所以通常 不被代谢，即其砩化物、或螯合的金属离子、或结合的蛋白质都不能被营 养利用。相应地，由于磷是所有生物体生长的必需元素，所以食物和饲料制品 必需补充无机磷酸盐。通常也必须补充营养必需离子，例如铁和钙。而且， 给定食谙的营养价值因为肌醇六磷酸结合蛋白质而降低。因此，肌醇六磷 酸通常被称为抗营养因子。最后，由于肌醇六磷酸不被代谢，肌醇六磷酸的磷通过这些动物的胃 肠道，并随粪便排出，导致环境中不希望的磷酸盐污染，结果造成例如水 环境的超营养作用和藻类过度生长。肌醇六磷酸或肌醇六礴酸盐(除非另外说明，所述术语在本发明上下文 中被同义或任意使用)可以被肌醇六磷酸酶降解。在大多数包含肌醇六磷酸的那些植物种子中，也发现了内源的肌醇六 磷酸酶。这些酶在种子萌发过程中形成，用于释放磷酸盐以及作为最终产 物游离出在植物生长过程中使用的肌醇。当被摄入时，包含于食物或饲料组分中的肌醇六磷酸盐，理论上可被 所述种子中内源的植物肌醇六磷酸酶、消化道内菌群滋生的肌醇六磷酸酶 和肠粘膜的肌醇六磷酸酶水解。然而，实际上，内源的植物肌醇六磷酸酶 和肠粘膜的肌醇六磷酸酶(如果存在的话)，其水解能力不足以显著增加肌 醇六磷酸盐结合的或组成的成分的生物利用度。然而，当食物或饲料的制 备过程涉及萌发、发酵或浸泡时，内源的肌醇六磷酸酶可以促成最大程度 的肌醇六磷酸盐降解。在反刍动物或多胃动物中，例如马和母牛，胃肠系统宿主微生物能降 解肌醇六磷酸。然而，在单胃动物如人类、家禽和猪中则不是这样。因此， 上述指出的问题主要对于这样的单胃动物具有重要性。由植物以及微生物产生肌醇六磷酸酶已有报道。在微生物之中，已知 产生肌醇六磷酸酶的细菌和真菌。在植物界，例如小麦麸肌醇六磷酸酶是已知的(Thomlinson等人， Biochemistry 1 (1962), 166-171)。来自百合花粉的碱性肌醇六碼酸酶由 Barrientos等人，Plant Physiol.106 (1994)， 1489-1495所描述。在细菌中，从枯草杆菌(5fl"7/"s swM斷(Paver和Jagannathan， Journal of Bacteriology 151 (1982)， 1102-llO8)和假单胞菌属(i^M^to/w0mw) (Cosgrove， Australian Journal of Biological Sciences 23 (1970), 1207-1220) 得来的肌醇六磷酸酶已有描述。也有一些产生肌醇六磷酸酶的丝状真菌的描述。尤其是有一些关于产生肌醇六磷酸酶的曲霉(Js/;erg说MS)属子嚢菌的参考文献，例如土曲霉 (Aspergillus terreus) (Yamada 等人，Agric. Biol. Chem. 322 (1986)，
1275-1282)。而且对于来自黑曲霉变种(Aspergillus niger var.) awamori的 肌醇六磷酸酶基因的克隆和表达也有描述(Piddington等人，Gene 133 (1993)， 55-62)。 EP 0 420 358描述无花果曲霉(J印ergi7/附/ c""附)(niger)的 肌醇六磷酸酶的克隆和表达。EP 0 684 313描述Myceliophthora thermophila和土曲霉的子嚢菌的肌醇六磷酸酶的克隆和表达。EP 897 010
名为"修饰的肌醇六磷酸酶，，，公开烟曲霉(JS/Wg"/附/"IW&fl似力肌醇六磷
酸酶的某些变体。EP897 985名为"共有肌醇六磷酸酶"，公开真菌的共有 肌醇六磷酸酶，其可能基于一些子嚢菌肌醇六磷酸酶的多重比对而设计。 WO 99/48380名为"在食物制品和植物表达中的耐热肌醇六磷酸酶，，，涉 及使用耐热肌醇六磷酸酶的某些方面。WO 00/143503名为"改良的肌醇 六磷酸酶"，涉及增强热稳定性的某些肌醇六磷酸酶变体，其可以通过类似 于EP897985中描述的过程而设计。
从隔孢伏革菌(尸e"/o/7^m /y"7)衍生的肌醇六磷酸酶在WO 98/28408 中被公开，并且在WO 99/4卯22和WO 03/066847中公开其某些变体。
产生肌醇六磷酸酶的酵母也被描述例如，EP 0 699 762 A2描述西方 许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)的肌醇六磷酸酶的克隆和表达。
为了将肌醇六磷酸酶作为食物添加剂使用，需要在所需的80。C到 90°C的粒化过程中不会被热灭活的耐热产物。作为肌醇六磷酸酶粒化稳定 性的指示(其为当用作食物添加剂时所必需)，有两个令人高度感兴趣的参 数，即最适温度和温度稳定性。
因此，本发明根本的技术难题是提供具有高度的内部热稳定性的肌醇
这一难题通过提供实施方案而得以解决，如在权利要求中所表征。 因此，本发明涉及多核苷酸，其选自如下组成的组
(a) 多核苷酸，其包含编码具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽 的核苷酸序列；
(b) 多核苷酸，其包含SEQIDNO:l所示编码区的核苷酸序列；
(c) 编码多肽的多核苷酸，其氨基酸序列与SEQIDNO:2所示氨
基酸序列至少有60%同一性、且具有肌醇六磷酸酶活性；
(d) 多核苷酸，其包含编码多肽片段的核苷酸序列，其中所述多 肽片段由(a)、 (b)或(c)的多核苷酸编码，且具有肌醇六磷酸酶 活性；
(e) 多核苷酸，其包含的核苷酸序列的互补链与任一个(a)、 (b)和 (d)的多核苷酸杂交，其中所述核苷酸序列编码具有肌醇六磷 酸酶活性的蛋白质；和
(f) 多核苷酸，其包含由于遗传密码简并而偏离(e)中定义的核苷 酸序列的核苷酸序列。
因此，本发明涉及编码具有肌醇六磷酸酶活性多肽的多核普酸，所述 多核苷酸优选编码含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。更优选地， 该多核苷酸编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的2到462残基。
具有SEQ ID NO:2所示M酸序列的肌醇六磷酸酶和具有SEQ ID NO:2氨基酸残基2-462的变体从季氏毕赤氏酵母(i^/iZfl g",7/imi^/i&7)菌 抹LU124 (DSM 16949)中分离出来。尤其是通过实施例中所描述的纯化方 法从细胞中分离的肌醇六磷酸酶，其具有从SEQ ID NO:2的第2个残基开 始的氨基酸序列，即其缺少N-末端甲石克氨酸，正如N-末端测序所显示的。 已分离的相应核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。 令人惊奇的，已发现此肌醇六磷酸酶具有高度的内在热稳定性。其温度稳 定性值(T50),即在该温度酶仍然保持50%的自身活性，约为74。C。最适 反应温度约为71。C。鉴定的肌醇六磷酸酶的最适pH约为pH 4.0。
该鉴定的肌醇六磷酸酶与任何已知的肌醇六磷酸酶具有很低的同源 性，即发现已知肌醇六磷酸酶与来自西方许旺酵母(也称为Debaromyces castellii)的肌醇六磷酸酶在氨基酸水平上的最高同源性为50%。
本发明也涉及编码多肽的多核苷酸，该多肽与SEQ ID NO:2所示的全 部氨基酸序列的同源性(也称为序列同一性)至少在60%，优选至少70%, 更优选至少80%,甚至更优选至少85%和尤其优选至少90%，特别优选 至少95%和甚至更优选至少98%，并且该多肽具有肌醇六磷酸酶活性。
而且，本发明涉及编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的多核苷酸，并
且其核苷酸序列与SEQ ID NO:l所示序列的编码区相比较，同源性(也称 为序列同一性)至少在65%，优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优 选大于85%，尤其优选至少卯％，特别优选至少95%，更尤其至少97% 和甚至更优选至少98%。
而且，本发明涉及编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的多核苷酸，并 且其互补链与在前面(a)、 (b)和(d)的任一部分提及的多核苷酸杂交。
本发明也涉及多核苷酸，其编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并且 其序列由于遗传密码简并而偏离上述多核苷酸的核苷酸序列。
本发明也涉及多核苷酸，其包含与上述序列之一的全部或部分互补的 核苷酸序列。
在本发明的上下文中，术语"杂交"指在常规杂交条件下的杂交作用， 优选在严格条件下，例如在Sambrook和Russell (2001)，分子克隆A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.中所描述 的。在特别优选的实施方案中，术语"杂交"指在如下条件下发生杂交作 用
杂交緩冲液2 x SSC; 10 x Denhardt杂交溶液(Fikoll 400 + PEG + BSA;
比例1:1:1); 0.1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HP04; 250 ng/ml绯精DNA; 50吗/ml tRNA;或 0.25 M砩酸钠緩沖液，pH 7.2; 1 mM EDTA 7% SDS
酸，原则上编码的多肽在任何表达此种多肽的生物体中具有肌醇六 活性，或能编码其修饰的形式。
杂交温度T = 60°C 洗脱緩冲液2 x SSC; 0.1% SDS 洗脱温度 T = 60°C.例如此种多肽可以从属于原核生物或属于真核生物的生物体(例如细
菌、真菌、植物或动物)的基因组文库或cDNA文库中分离出来。优选地， 此种多肽是真菌起源，更优选来自属于子嚢菌(Ascomycota)门的真菌，甚 至更优选来自属于Saccharomyconita亚门，尤其优选属于酵母纲的真菌。 在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸从酵母目(Saccharomycetales)的 真菌分离而来，甚至更优选酵母科(Saccharomycetaceae),尤其优选来自毕 赤酵母(Pichia)属的真菌，甚至更优选来自季氏毕赤氏酵母种，最优选来自 季氏毕赤氏酵母LU124 (DSM16949)菌林。可选地，此类多核苷酸可以通 过基因工程或化学合成来制备。
例如可能通过例如根据标准方法杂交(例如见Sambrook和Russell (2001)，分子克隆A Laboratory Manual, CSH P固，Cold Spring Harbor,
NY, USA),使用上述多核苷酸或其部分或其反向互补来鉴定和分离此种多 核苷酸。例如可以使用包含与SEQ ID NO:l所示核苦酸序列相同或基本相 同的多核苷酸或其部分作为杂交探针。用作杂交4笨针的片段也可以是合成 的片段，其通过常用合成技术制备，并且其序列与根据本发明的多核苷酸 的序列基本一致。
与本发明的多核苷酸杂交的分子也包含上述编码具有肌醇六磷酸酶活 性多肽的多核苷酸的片段、衍生物和等位变体。在此处，片段应理解为多 核苷酸的部分，其长度足够编码所述多肽，优选显示出如上所述本发明多 肽的生物活性。
更优选地，此类片段还具有如此处及以下所述的Tso值、最适温度和 最适pH的表征。尤其优选的片段是包含SEQ ID NO:2的2到462氨基酸 残基，即缺少N-末端甲硫氨酸残基的多肽。
在本上下文中，术语衍生物指这些分子的序列与上述多核苷酸的序列 在一个或多个位点有所不同，并显示与这些序列有高度同源性，优选在上 述同源性的优选范围内。
优选地，同源度的确定是通过将各自的序列与SEQ ID NO:l的编码区 核苷酸序列进行比较，甚至更优选与编码SEQ ID NO:l所示氨基酸序列的
2到462氨基酸残基的编码区进行比较。关于氨基酸序列，各自的序列与 SEQ ID NO:2所示氨基酸进行比较，优选与SEQ ID NO:2的2到462残 基比较。当比较的序列不具有相同的长度时，同源度优选指在较短序列与 较长序列中核苷^/氨基酸残基同一性的百分比。通常用公知的计算机程序 例如DNASTAR程序进行ClustalW分析，来确定同源度。这一程序可以 从DNASTAR, Inc" 1228 South Park Street, Madison, WI 53715或者 DNASTAR， Ltd., Abacus House, West Ealing, London W13 OAS UK "uDDort涵dnastar.com)获得,并可在EMBL分部办事处服务器上获得。
当使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列有例如80% 的同一性，优选的设置如下矩阵blosum30;开放空位罚分10.0;延 伸空位罚分0.05;延迟偏离(delay divergent): 40;空位缺口距离8，用 于比较氨基酸序列。对于核苷酸序列比较，延伸空位罚分优选设定为5.0。
可选择地，且优选地，当确定核苷酸或氨基酸的序列同一性时，使用 GCG Wisconsin程序包10.3, Accelrys Inc., San Diego， CA。此程序包包括 GAP和BestFit程序。
当比较氨基酸序列时，优选使用GAP,优选用标准参数，即标准交换 矩阵Blosum62; GAP-加权8; GAP-长度2。当用GAP和标准参数 比较DNA序列时，标准变换矩阵是GCG nwsgapdna.cmp。在GAP中使 用的算法是来自Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 (1970)， 443-453)。
优选地，多核苷酸同源度是在其编码序列全长之上计算的。还优选的 是，此类多核苷酸和特别是其中包含的编码序列，长度至少为300个核苷 酸，优选至少500个核香酸，更优选至少750个核苦酸，甚至更优选至少 1000个核苦酸，尤其优选至少1200个核苷酸和最优选至少1300个核苷酸。
优选地，与根据本发明的多核苷酸杂交的序列包含与上述多核苷酸同 一性至少为卯％，优选至少93%，更优选至少95%，仍然更优选至少98% 和尤其优选至少99%的同源区域，其中此同源区域长度至少为1000个核 苷酸，更优选至少250个核香酸，甚至更优选至少500个核苷酸，尤其优 选至少100个核苷酸和最优选至少1200个核苷酸。
同源性还指在相应多核苷酸或由其编码的多肽之间存在功能上和/或 结构上的等同。与上述分子和这些分子的代表性衍生物同源的多核苷酸， 通常是这些分子的变体，其代表具有相同生物学功能的修饰。它们可能是 例如来自其它真菌、种、菌林等序列的天然存在的变体，或者是突变，并 且所述突变可能是天然形成的或通过有意的诱变而产生的。此外，变体可 能是通过合成产生的序列。等位变体可能是天然存在的变体或合成产生的变体、或通过重组DNA技术产生的变体。上述多核香酸的偏离可能通过 例如缺失、取代、插入和/或重组而产生。由本发明的多核苷酸不同变体编码的多肽具有某些共同的特性。这些 包括例如生物活性、分子量、免疫反应性、构象等等，以及物理性质，例 如在凝胶电泳中的迁移行为、层析行为、沉降系数、溶解性、光语性质、 稳定性、最适pH、最适温度等等。尤其是，由本申请的多核苷酸编码的多肽具有肌醇六磷酸酶活性。在 本申请的上下文中，肌醇六磷酸酶活性指影响无机磷酸盐或磷从多种肌醇 磷酸盐中释放的能力。此类肌醇磷酸盐(肌醇六磷酸酶底物)的实例是肌醇 六磷酸和任何其盐类，例如肌醇六磷酸钠或肌醇六磷酸钾或混合盐。并且， 任何肌醇的单磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐、四磷酸盐或五磷酸盐的立体 异构体也可能作为肌醇六磷酸酶的底物。优选的肌醇六磷酸酶底物是肌醇 六磷酸或其盐类。互联网上的ENZYME地址(http:〃www.expasy.ch/enzyme/)是酶命名 相关的信息库。主要基于国际生物化学和分子生物学联盟(IUB-MB)命名委 员会的推荐，并且用所提供的EC(酶学委员会)号来描述所表征酶的每种类 型(Bairoch A.， The ENZYME database, Nucl. Acids Res. 28 (2000)， 304-305);也见NC-IUBMB的酶命名法手册(1992)。根据ENZYME地址，已知两种不同类型的肌醇六磷酸酶(i) 所谓的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8);和(ii) 所谓的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)。出于本发明的目的，两种类型都包括于术语"肌醇六磷酸酶"的含意中。肌醇六磷酸酶活性可以根据本领域技术人员所熟知的方法来测量。优 选地，肌醇六磷酸酶活性可以如附加实施例(见实施例2a)中所描述的进行 测量，或者根据"通过酶显色定量方法测定饲料中肌醇六磷酸酶活性"来 测定Collaborative Interlaboratory Study Engelen等人.Journal of AOAC International Vol. 84， No. 3， 2001。一个单位的肌醇六磷酸酶活性(-FTU)定义为在pH 5.5和37。C条件 下，每分钟从0.0051 mol/l肌醇六砩酸钠中释放l微摩无机磷的酶量。在这一方面，标准分析方法是基于从过量加入的肌醇六磷酸钠中无机 磷的释放。在pH 5.5和37°C孵育的时间为60分钟。释放的磷酸盐通过黄 色的钼钒复合物来测定，并在415nm波长下测量吸光度。已知活性的肌醇 六磷酸酶标准品用作平行对照。测量的产物样品吸光度的增加用相对于标 准品的比率来表示(比较法，正式的AOAC方法)。根据本发明的核酸分子编码的肌醇六磷酸酶多肽可能是糖基化的或非 糖基化的，优选糖基化的。此外，根据本发明的核酸分子编码的肌醇六磷酸酶多肽，从氨基^ 列推论，具有的分子量优选在50到53 kDa之间，更优选在51到52 kDa 之间。SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的计算分子量为51986 Da。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列但是缺少N-末端甲硫氨酸的蛋白质的计算分子量 为51855 Da。更优选地，当用SDS-PAGE测定时，蛋白质(这种情况下是糖基化的) 的分子量在70到120 kDa之间，甚至更优选在80到110 kDa之间，和最 优选为约90到100 kDa。由本发明的多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶蛋白质优选通过如下层析步 骤从天然细胞提取物中分离出来(i)用Q-琼脂糖FF进行的离子交换层 析，(ii)用Superdex大小排阻层析柱(Pharmacia)进行的大小排阻层析和(iii) 用Mono Q柱(Pharmacia)进行的高溶解离子交换层析，优选如实施例1中 所述。而且，由本发明的多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶蛋白质的温度稳定性 值(T50)大于65°C，优选大于68°C，甚至更优选大于70°C，尤其优选大于 72°C和最优选约为74°C。术语"T50值"指在所述温度预保温以后残余 活性为50%的温度。所指100%活性优选在室温测定，最优选在保温20 分钟以后测定。T50值优选通过使用表达各自肌醇六磷酸酶蛋白质的天然 细胞提取物来测定，最优选根据实施例1所描述的方法制备天然细胞提取 物。T50值也可使用纯化的酶制品来测定。此种情况下T50值可能与使用 天然细胞提取物测定的T50值有轻微的差别，即其可能会低一点，可能由 于在纯化过程中除去了稳定化的复合物，例如金属离子。T50值的测定最 优选在pH 5.5的乙酸盐緩沖液中进行，特别优选使用实施例中所描述的条和随后在标准条件(37。C)下残余活性的测量。此外，根据本发明的多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶蛋白质，其最适反 应温度优选在68。C到74。C范围内，更优选在69。C到73。C范围内，甚至 更优选在70°C到72。C范围内和最优选约为71°C。最适反应温度是在此 温度下肌醇六磷酸酶蛋白质显示其最高活性。其通过测量不同温度下肌醇 六磷酸酶的活性来确定，优选在实施例中所描述的反应条件下。最优选地， 通过使用表达肌醇六磷酸酶细胞的天然细胞提取物来确定肌醇六磷酸酶的 最适反应温度。尤其优选的细胞提取物是由实施例1中描述的方法制备。 特别地，最适反应温度和T50值的测量优选用肌醇六磷酸作为底物，通过 所谓的抗坏血酸(维生素C)测定。此方法定量从底物中释》文的磷酸盐。而且由本发明的多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶蛋白质优选显示在酸性 范围的最适pH值，更优选在pH 3.0和pH 5.0之间，甚至更优选在pH3.5 和pH4.5之间，且最优选最适pH约为pH4.0。而且，肌醇六磷酸酶蛋白 质在pH2.6到6.0范围内显示显著的活性。对于在不同pH值下测定肌醇 六磷酸酶活性的测量，优选通过使用覆盖pH2.6到9.0范围的不同緩冲液
系统进行。更优选的测量使用实施例2c中描述的方法进行。本发明也涉及与本发明的多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸。此类寡核 苷酸长度优选至少为10，尤其至少为15，且尤其优选至少为50个核苦酸。 有利地，它们的长度不超过IOOO，优选500,更优选200,仍然更优选IOO 和最优选50个核苷酸。它们的特征在于与本发明的多核苷酸特异性杂交， 即它们不能或仅以很小的程度与编码其它肌醇六磷酸酶的核酸序列杂交。 本发明的寡核苷酸能用作例如扩增技术(例如PCR反应)的引物，或者用作 分离相关基因的杂交探针。与编码具有肌醇六磷酸酶活性多肽的多核苷酸 相关的上述杂交条件和同源性值可能同样相关地应用于此处提及的寡核苷 酸。本发明的多核苷酸可能是DNA分子，尤其是基因组DNA或cDNA。 而且，本发明的多核苷酸可能是RNA分子。本发明的多核苷酸可能例如 从天然来源获得，或者可能通过合成或重组技术产生，例如PCR。另一方面，本发明涉及包含上述本发明的多核苦酸的重组核酸分子。术语"重组核酸分子"指除含有上述本发明的多核普酸以外，还包含至少一个其它异源编码或非编码的核苷酸序列。术语"异源"指所述多核苷酸来自不同的物种，或者来自相同物种，但是来自与所述加入的核苷酸序列在基因组中不同的另一位置。术语"重组"意味着通itA为干涉的帮助使核苷酸序列结合到一个核酸分子中。本发明的重组核酸分子可以单独使用 或作为栽体的部分使用。例如，重组核酸分子可能编码与标记序列(例如使融合多肽易于纯化的 肽)融合的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。标记序列可能是例如6-组氨酸 肽，例如在pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标签，其可供方便的纯化融合 多肽。另一适当的标记序列可能是HA标签，其对应于从流感血凝素多肽 衍生的抗原表位(Wilson， Cell 37 (1984)， 767)。作为又一个实例，标记序列 可能是谷胱甘肽-S-转移酶(GST),其除了提供纯化标签，还例如在细菌表 达系统中增强多肽稳定性。在优选的实施方案中，重组核酸分子还包含与重组核酸分子中包含的
多核苷酸有效连接的表达控制序列，更优选这些重组核酸分子是表达盒。 在本发明说明书中使用的术语"有效连接"，指在一个或多个表达控制序列 和所表达的多核苷酸编码区之间的连接，从而在适合表达控制序列的条件 下实现表达。表达包含异源DNA序列的转录，优选转录为可翻译的mRNA。在原 核和真核细胞，优选在真菌细胞中，保证表达的调控元件是本领域技术人 员所熟知的。它们包括启动子、增强子、终止信号、靶向信号等等。在下 面给出说明相关载体的实例。对于真核细胞的情况，表达控制序列可能包 含多聚腺苷酸信号，其保证转录终止和转录本的稳定。而且，本发明涉及载体，尤其是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它在 基因工程中常用的载体，其包含上述本发明的多核苦酸。在本发明的优选 实施方案中，本发明的载体适合转化真菌细胞、微生物细胞、细菌细胞、 动物细胞或植物细胞。在特别优选的实施方案中，此类载体适合转化真菌 细胞，尤其是酵母或丝状真菌。在本上下文中，细菌细胞是例如埃希氏菌 (Escherichia)属或杆菌(Bacillus)属的细菌。优选杆菌属的细菌，因为它们 能够向培养基中分泌蛋白质。其它合适的细菌来自链霉菌(Streptomyces) 属和假单胞菌(Pseudomonas)属。在本上下文中，酵母细胞是例如酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵 母属(Kluyveromyces)、汉森酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属、亚罗酵母 (Yarrowia)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的细胞。优选的酵母宿主细 月包为酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(也称为乳酸马克思克鲁维酵母变体(Kluyveromyces marxianus van lactis))、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、 解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)和粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。在本上下文中，丝状真菌是例如选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属 (Trichoderma)、 嫌胞属(Fusarium) 、 Disporotrichum 、 青霉菌属 (Penicillium)、 枝顶孢属(Acremonium)、 脉抱菌属(Neurospora)、Thermoascus 、 Myceliophtora 、 孢霉属(Sporotrichum)、 梭孢壳属 (Thielavia)和踝节菌属(Talaromyces)。 更优选的丝状真菌细胞为 Aspergillus oyzae、 Aspergillus sojae、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)种或 来自黑曲霉(Aspergillus niger)种群(如Raper和Fe證ll， The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344， 1965)的物种。这些包括(但不限于)黑曲霉素(Aspergillus niger)、泡盛曲霉 (Aspergillus awamori) 、 Aspergillus tubigensis 、 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、 日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和无花果曲 霉。在另外的优选实施方案中，丝状真菌细胞是里氏木霉(Trichoderma reesei)、 禾谷嫌刀菌(Fusarium graminearum)、 产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum) 、 Acremonium alabamense 、 Neurosporea crassa 、 Myceliophtora thermophilum 、 Sporotrichum cellulophilum 、 Disporotrichum dimorphosporum或Thielavia terrestris。在另一个优选实施方案中，载体还包含表达控制序列，其与包含在载 体中的多核苷酸有效连接。这些表达控制序列适合于在原核或真核细胞中 保证可翻译的RNA的转录和合成。本发明的多核苷酸在原核或真核细胞中，例如在大肠杆菌、酿酒酵母 或巴斯德毕赤酵母中的表达是令人感兴趣的，因为其允许编码的多肽具有 更精确的生物学活性特征。尤其是，重组表达的多肽可被用于鉴定通过其 活性转化的底物复合物。而且，可能在此类原核或真核细胞中表达这些多 肽，此类细胞不对多肽造成千涉。另外，可能通过分子生物学常用方法在 多核苷酸内部插入不同突变(例如见Sambrook和Russell (2001)，分子克隆: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)，导致合 成的多肽可能具有被修饰(优选改良)的生物性质，例如增加的特异活性、 增加的T50值或最适反应温度。在这一点上， 一方面可能产生缺失突变， 其中多核苷酸的产生是通过从编码DNA序列的5，或3，末端渐进性缺失， 并且所述多核苷酸导致合成相应缩短的多肽。另一方面，也可能在氨基酸
序列^f务饰的位点引入点突变，例如影响生物学活性、稳定性或多肽的调控。 能够制备具有修饰的底物或产物特异性的突变体。此外，可能制备具 有修饰的活性-温度-镨的突变体。优选地，此类突变体显示增加的活性和更高的温度稳定性(T50值)和/或最适反应温度。此外，对于表达的情况，例如在真菌细胞、尤其是酵母细胞中，向本率和/或活性降低或增加。对于原核细胞中的基因工程，本发明的多核苷酸或这些分子的部分能 够被引入质粒，该质粒允许通过DNA序列重组而产生诱变或序列修饰。 标准方法(见Sambrook和Russell (2001)，分子克隆A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)允许实现碱基交换或者添加天 然或合成的序列。DNA片段可以通过在片段上应用接头和连接体而彼此连 接。而且，可以使用提供合适限制性酶切位点、或除去剩余DNA或限制 性酶切位点的基因工程方法。在这些情况下，可以使用体外诱变、"引物修 补"、限制性酶切或连接，其中可能有插入、缺失或取代发生。 一般而言， 进行序列分析、限制性分析和生物化学和分子生物学的其它方法作为分析 方法。另外，本发明涉及产生基因工程宿主细胞的方法，包括向宿主细胞中 引入上述本发明的多核苷酸、重组核酸分子或载体。本发明的另一个实施方案涉及使用上述本发明的多核苷酸、重组核酸 分子或载体基因改造的、或通过上述产生基因工程宿主细胞的方法可获得 的宿主细胞(尤其是原核或真核细胞)，以及从此类转化细胞衍生的细胞， 且其包含本发明的多核苷酸、重组核酸分子或载体。在优选的实施方案中， 宿主细胞是经遗传修饰的，从而使其包含稳定整合到基因组中的多核苷酸。 优选地，本发明的宿主细胞是细菌、真菌、植物或动物细胞。更优选的是 丝状真菌细胞和最优选的是酵母细胞。在本上下文中细菌细胞是例如埃希 氏菌属或杆菌属的细菌。优选杆菌属的细菌，因为它们能够向培养基中分 泌蛋白质。其它合适的细菌来自链霉菌属和假单胞菌属。
在本上下文中，酵母细胞是例如酵母菌属、克鲁维酵母属、汉森酵母 属、毕赤酵母属、亚罗酵母和裂殖酵母属的细胞。优选的酵母宿主细胞为 酿酒酵母、克鲁维酵母(也称为乳酸马克思克鲁维酵母变体)、多形汉森酵 母、巴斯德毕赤酵母、解脂亚罗酵母和粟酒裂殖酵母。在本上下文中，丝状真菌是例如选自曲霉属、木霉属、镰胞菌酶属、Disporotrichum 、青霉菌属、支顶孢属、链孢霉属、Thermoascus 、 Myceliophtora、侧孢霉属、Thielavia和踝节菌属。更优选的丝状真菌细胞 为Aspergillus oyzae、 Aspergillus sojae，构巢曲霉种或来自黑曲霉种群(如 Raper 和 Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344， 1965)。这些包括(但不限于)黑曲霉素、泡 盛曲霉、Aspergillus tubigensis、棘孢曲霉、臭曲霉、构巢曲霉、日本曲霉、 米曲霉和无花果曲霉。在另外的优选实施方案中，丝状真菌细胞是里氏木 霉、禾谷嫌刀菌、产黄青霉菌、Acremonium alabamense、 Neurosporea crassa 、 Myceliophtora thermophilum 、 Sporotrichum cellulophilum 、 Disporotrichum dimorphosporum或Thielavia terrestris。更优选地，表达多核苷酸导致产生具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。例 如在Methods in Enzymology 153(1987) ， 385-516、 Bitter等人(Methods in Enzymology 153 (1987)， 516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996)， 1-9) 、 Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、 Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994)， 456-463)、 Griffiths等人，(Methods in Molecular Biology 75 (1997)， 427-440)中包含对不同表达系统的概述。例如Hensing等人(Antonie van Le鼎enhoek 67 (1995)， 261-279) 、 Bussineau 等人(Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19)、 Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62 (1992)， 79-93、 Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992)， 486-496)、 Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991)， 742画745)和Buckholz (Bio/Technology 9 (1991)， 1067-1072)都给出了酵母表 达系统的概述。WO 99/32617中也描述了表达系统。例如Gellissen (Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 (2000)， 741-750)、 Gellissen等人(Antonie van Leeuwenhoek 62 (1992)， 79-93)、 Archer和Peberdy (Critical Reviews in Biotechnology 17 (1997)， 273-306)以及Radizio和Ktick (Process Biochem. 32 (1997)， 529-539)中描述了酵母或真菌细胞中异源蛋白质的产生。在文献中广泛描述了表达载体。通常，它们不仅包含选择性标记基因 和保证在所选宿主中复制的复制起点，而且也包含细菌或病毒启动子，并 且在大多数情况下包含转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常有至 少一个限制性酶切位点或多聚接头，使能够插入编码DNA序列。如果天 然控制相应基因转录的DNA序列在所选宿主生物中有活性，则用其作为 启动子序列。然而，也可以用其它启动子序列替换此类序列。可以使用保 证基因组成型表达的启动子，和允许人为控制基因表达的诱导型启动子。 在文献中详细描述了具有这些性质的细菌和病毒启动子序列。在微生物中 (例如大肠杆菌、啤酒酵母)表达的调控序列在文献中有充分的描述。允许 下游序列显著高表达的启动子有例如T7启动子(Studier等人，Methods in Enzymology 185 (1990)， 60-89)、 lacUV5、 trp、 trp-lacUV5 (DeBoer等人，in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger， New York, (1982)， 462-481; DeBoer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)， 21-25)、 lpl、 rac (Boros等人，Gene 42 (1986)， 97-100)。诱导 型启动子优选用于多肽合成。这些启动子通常比组成型启动子导致更高的 多肽产量。为了获得最优量的多肽，通常使用两阶段方法。首先，在最适 条件下培养宿主细胞，直到达到相对高的细胞密度。第二步，依赖所使用 的启动子类型来i秀导转录。在这一点上，尤其适合使用tac启动子，其可 以被乳糖或IPTG (-异丙基-I5-D-硫代半乳糖苷)所诱导(deBoer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983)， 21-25)。在文献中也描述了转录终止信号。 在酿酒酵母中表达的合适启动子是例如ADH 、 GAL1 、 GAP 、 PH05 、 ARG3 、 PGK或Mfalpha启动子。对于曱基营养酵母，合适的启动子如下AOXl、 AUGl和GAPl (对于毕赤酵母)；MOX、 FMD、 GAPl、 PMAl和TRSl (对 于汉森酵母)。在真菌细胞中合适的启动子有例如gpd启动子(来自构巢曲
霉或黑曲霉或来自宿主细胞的相应天然基因)，以及glaA启动子，例如来 自黑曲霉。其它合适的启动子有例如在里氏木霉中表达的cbhl和pkil启 动子、在米曲霉中表达的amy启动子或在黑曲霉中表达的alcA、 sucl、 aphA、 tpiA或pkiA。通过标准方法，例如在Sambrook和Russell (2001)，分子克隆 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990或在Guthrie和Fink: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 169 (1991) Academic Press, San Diego, USA中所描述的方法用才艮据本发明的多核苷 酸或载体转化宿主细胞。在巴斯德毕赤酵母中转化和表达的系统是表达试 剂盒K1710-01(Invitrogen)，其为商业上可获得的。例如在Debets和Bos (FGN 33 (1986)， 24)及Werner等人(Mol. Gen. Genet. 209 (1987)， 71-77)中 描述了黑曲霉的转化。宿主细胞在适合所用特定宿主细胞需要(尤其是关于 pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等)的营养培养 基中培养。根据本发明的多肽能够通过一些方法从重组细胞培养液中被恢复和纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取、阴离子或阳离子 交换层析、磷酸纤维素层析、疏7jC相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石 层析和凝集素层析。根据需要，可以使用多肽重折叠步骤来完成多肽构象。 最后，使用高效液相色镨(HPLC)进行最终的纯化步骤。因此，本发明也涉及产生如上所述由本发明多核苷酸编码的多肽的方 法，其中在允许多肽表达的条件下培养上述宿主细胞，并且从细胞和/或培 养基中分离出多肽。在优选实施方案中，此方法允许才艮据本发明的肌醇六 磷酸酶的大规模生产。而且，本发明涉及由根据本发明的多核苷酸所编码的多肽，或通过上 述产生本发明多核苷酸编码多肽的方法所获得的多肽。本发明的多肽可能是例如天然纯化的产物或化学合成操作的产物或通 过重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、真菌、植物、昆虫和动物
细胞，尤其是培养的哺乳动物细胞)中产生。依据在重组生产操作中所使用 的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽可以 包括起始甲硫氨酸残基或者可以缺失。根据本发明的多肽可以进一步被修 饰，以包含不是多肽正规部分的附加化学部分。那些衍生的部分可以例如 改良多肽的稳定性、可溶性、生物学半衰期或吸光度。这些部分也可以减 少或消除多肽的任何不希望的副作用等等。这些部分的概述可以在例如Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版,Mack Publishing Co., Easton， PA (1990))中找到。聚乙二醇(PEG)是此类化学部分的实例，其已 被用于制备治疗性多肽。附加于多肽的PEG已显示能保护它们抵抗蛋白 水解作用(Sada等人，J. Fermentation Bioengineering 71 (1991)， 137-139)。 有多种合适的方法在多肽上附加某些PEG部分(综述见Abuchowski等人， in "Enzymes as Drugs"; Holcerberg和Roberts,编辑(1981)， 367-383)。通 常，PEG分子通过多肽上找到的反应基团连接在多肽上。例如其中在赖氨 酸上的氨基或多肽氨基端的氨基对于此类附加是适宜的。此外，本发明也涉及特异性识别根据本发明的多肽的抗体。抗体可以 是单克隆或多克隆的，并且可以根据本领域熟知的方法制备。术语"抗体" 也包含仍然保留结合特异性的抗体片段。根据本发明的多肽、其片段或其它的衍生物、或表达它们的细胞可被 用作产生其抗体的免疫原。本发明也特别包括嵌合体、单链和人化抗体， 以及Fab片段、或Fab表达文库的产物。可使用本领域中已知的多种操作 来产生此类抗体和片段。直接抗本发明的多肽的抗体可以通过例如直接向动物注射多肽而获 得、或通过向动物(优选非人动物)施用多肽而获得。然后，这样获得的抗 体将结合多肽自身。在此种方法中，甚至仅编码多肽片段的序列都可以用 于产生结合完整天然多肽的抗体。然后，此类抗体可以例如被用于从表达 那种多肽的组织中分离多肽、或以探针检测多肽。对于单克隆抗体的制备， 可以使用任何通过传代细胞系培养而产生抗体的技术。此类技术的实例包 括杂交瘤技术(K6hler和Milstein， Nature 256 (1975)， 495-497)、三源杂交
瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today 4 (1983)， 72) 和EBV-杂交瘤技术产生人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)， 77-96)。描述产生单链抗体 的技术(例如美国专利4，946，778)可以适用于产生以根据本发明的多肽作为 免疫原的单链抗体。此外，可使用转基因小鼠表达直接抗本发明的多肽免 疫原的人化抗体。此外，本发明涉及产生转化的宿主细胞的方法，其包含向宿主细胞中 引入本发明的至少一个上述多核苷酸、重组核酸分子或载体的步骤。本发明还涉及保藏号为DSM16949的季氏毕赤氏酵母细胞菌林，或保 持其产生根据本发明的肌醇六磷酸酶多肽能力的其突变体或衍生物，优选 当在天然细胞提取物中测定时，具有T50值约为74°C和最适反应温度约 为71。C的肌醇六磷酸酶，更优选具有实施例中所描述的纯化和生物化学 特性的肌醇六磷酸酶。而且，本发明还涉及制备肌醇六磷酸酶的方法，包括如上所述在允许 表达肌醇六砩酸酶的条件下培养季氏毕赤氏酵母细胞，以及从培养物(尤其 是从细胞中)恢复肌醇六磷酸酶的步骤。在优选的实施方案中，此过程也包 含进一步纯化肌醇六磷酸酶的步骤，例如在实施例中所述。在更优选的实 施方案中，此过程允许肌醇六磷酸酶蛋白质的大少见;漢生产。通过此种方法可获得的、已经获得的或产生的肌醇六磷酸酶也是本发明的对象。 本发明还涉及包含至少一种根据本发明的多肽的组合物。此类组合物优选是食物或饲料、或食物或饲料的添加剂。"饲料"和"食物，，分别指对于动物和人类，任何天然的或人工的饮食、膳食或其类似物，或预期或适合于被食用、摄入、消化的此类膳食的组分。根据本发明的肌醇六磷酸酶可以在体外或体内，即分别在个体摄入之前或在胃中发挥其作用。也可能是结合的进行。根据本发明的包含肌醇六磷酸酶的组合物可以例如是液态的或干燥的。液态的组合物可以只包含肌醇六磷酸酶，优选为高度纯化的形式。然
而，通常加入稳定剂，例如甘油、山梨醇或单丙二醇。液态组合物也可能包含其它添加剂，例如盐、糖、防腐剂、pH调整剂、蛋白质或肌醇六磷 酸酶底物。通常液态组合物是溶于水的或基于油的浆液。在其可选择的粒 化过程之后，可以将液态组合物加入食物或饲料中。干燥组合物可以是喷雾-干燥的组合物。在此种情况下，组合物不需要 包含任何干燥形式酶以外的组分。然而，通常干燥组合物是所谓的颗粒状， 其可以容易地与例如食物或饲料组分混合，或者更优选地形成预先混合的 组分。酶颗粒的微粒大小优选与混合物的其它组分一致。这样提供将酶掺 入到例如动物饲料中的安全和方^f更的方法。颗粒的制备是本领域技术人员所公知的。凝聚颗粒通常例如通过使用凝聚技术在高切力混合机(例如L6dige)中 制备，在其过程中填充材料和酶共凝聚形成颗粒。通常通过具有载体材料 的核心制备吸收颗粒来吸收酶和/或以酶包被。填充材料的实例为盐，例如硫酸二钠盐。其它填充材料有高呤土、滑 石粉、硅酸镁铝和纤维素纤维。可选地，在凝聚颗粒中也包括粘合剂，例 如糊精。栽体材料的实例是淀粉，例如来自木薯、玉米、马铃薯、稻和小麦或盐。可以用包^皮混合物包被颗粒。此类混合物包含包被剂，优选疏水包被 剂，例如氢化棕榈油和牛油，并且如果希望还可以包含其它添加剂，例如 碳酸钧或高岭土。根据本发明的肌醇六磷酸酶组合物还可以包含其它取代物，例如着色 剂、香料复合物、稳定剂、矿物、维生素、其它饲料或食品增强酶即增强 祠料/食物营养性质的酶，等等。术语"食品或饲料添加剂"指预期或适合加入到食物或饲料中的基本 纯的复合物或多组分组合物。尤其是通过其预期使用能成为食物或祠料产 品的组分、或影响食物或饲料产品的任何性质的物质。优选包含上述表明 的肌醇六磷酸酶组合物。典型的添加剂通常包含一个或多个复合物，例如
维生素、矿物或饲料增强酶和适当载体和/或辅料。在优选的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶组合物额外包含有效量的一个或多个饲料增强酶。此类酶是本领域所公知的，包括例如a-半乳糖 苷酶、p-半乳糖苷酶、尤其是乳糖酶，其它肌醇六磷酸酶、p-葡聚糖酶、 尤其是卩-l，4-葡聚糖内切酶和卩-l，3(4)-葡聚糖内切酶、纤维素酶、木糖苷 酶、半乳聚糖酶(galactanase)、尤其阿拉伯半乳聚糖-l，4-p-半乳糖苷内切酶 (arabinogalactan endo曙l，4-p-galactosidases)和阿4立伯半孝L聚糖-l，3-p-半享L 糖普内切酶(arabinogalactan endo-l，3画p陽galactosidases)、 葡聚糖内切酶、 尤其1，2-P-葡聚糖内切酶、1，3-a-葡聚糖内切酶和1，2-卩-葡聚糖内切酶、果 胶降解酶、尤其是果胶酶、果胶甲酯酶、果胶裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonase)、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖 酶(rhamnogalacturonase)、 鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶 (rhamnogalacturonan acetyl esterase)、鼠李并唐半享L糖趁酸聚糖-a画鼠李津唐脊 酵(rhamnogalacturonan誦a-rhamnosidase)、 果股酸裂合酵(pectate lyases)、 和a-galacturonisidase 、甘露聚糖酶(mannanase) 、 |3-甘露糖苷酶 (P-mannosidase)、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖 酶、阿拉伯木聚糖酶(arabinoxylanase)和脂解酶，例如脂肪酶、磷脂酶 (phospholipase)和角质酶(cutinase)。根据本发明的动物饲料添加剂可以在饮食之前或同时补充给动物，尤 其是单胃动物。优选地，在饮食的同时补充给动物。更优选地，其以颗粒 或稳定液态形式添加在々大食中。根据本发明的组合物包含有效量的肌醇六磷酸酶。在食物或饲料中的 有效量优选为约10-20,000，优选从约10到10,000，尤其是从约100到5,000， 特别从约100到约2,000 FTU/kg饲料或食物。根据本发明的组合物可以包含根据本发明的肌醇六磷酸酶的任何可能 形式。肌醇六磷酸酶的形式可以是例如细胞提取物、培养物上清液、含有 表达肌醇六磷酸酶细胞的培养基、表达肌醇六磷酸酶的细胞或从此类细胞 衍生的生物质。优选的肌醇六磷酸酶是纯化的，例如部分纯化的。最优选
的是高度纯化的。在本上下文中"高度纯化"指至少80%纯的，优选至少 90%纯，更优选至少95%纯和最优选至少99%纯。本发明也涉及制备饲料或食物的方法，包含向饲料或食物组分中添加 根据本发明的多肽的步骤。可以根据本领域技术人员所熟知的方法进行添 加。最后，本发明也涉及本发明的多肽在从肌醇六磷酸或肌醇六磷酸盐中 释放无机磷酸盐中的用途，以及此类多肽在制备食物或饲料、或食物或饲 料添加剂中的用途。根据布达佩斯条约的要求，季氏毕赤氏酵母LU124菌林于2004年11 月29日在DSMZ (德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung ftir Mikroorganismen und Zellkulturen)，不伦瑞克(Braunschweig)，德国)，保 藏号为DSM 16949。


图1显示从季氏毕赤氏酵母菌林LU124(DSM16949)中纯化的肌醇六 磷酸酶的SDS-PAGE分析。箭头表示肌醇六磷酸酶条带。图2显示在纯化前测定来自季氏毕赤氏酵母菌林LU124 (DSM 16949) 的肌醇六磷酸酶热稳定性的结果。在pH 5.5的乙酸盐緩冲液中进行测量。 粗提物的T50值是74°C。图3显示来自季氏毕赤氏酵母LU124 (DSM 16949)的肌醇六磷酸酶的 pH镨。图4显示用EcoRI (l泳道)和HindIII (3泳道)消化、并且用扩增的 肌醇六磷酸酶PCR产物作为探针进行的季氏毕赤氏酵母染色体DNA的 Southern印迹。实施例以下实施例用于进一 步说明本发明。 实施例1:蛋白质分离 除非特殊说明，所有的化学试剂以可获得的最高纯度使用，并从Sigma 获得。所有培养基组分已通过加热(1.5巴和121°C下20分钟)或过滤除菌 灭菌。组分可以一起灭菌，或者如果需要分别灭菌。酵母菌林季氏毕赤氏酵母LU124 (DSM 16949)在去除磷酸盐的酵母蛋 白胨(YP)培养基，ISF100发酵罐(Infors)中以3升体积培养，条件如下去除磷酸盐的酵母蛋白胨(YP)培养基國 1。/o酵母提取物(Difco)、 r/o细菌用蛋白胨(Difco)、 2%葡萄糖、2g/l肌醇六磷酸，pH5.5- 去除酵母提取物和细菌用蛋白胨的10x储存液中的磷酸盐是通过加入10 mM MgCl2,调整pH值到8.6，在4。C搅拌过夜， 并且通过离心(4000 rpm， 10分钟)澄清溶液发酵参数起始体积3.5 L培养基 温度30 。C通气速率2 L/min (常数) pH 6，用10% HC1 / 25% NaOH调节旋转频率300 rpm (开始) 按需要补料(50%葡萄糖)通过旋转频率调节P02 P02最小值30%在48小时以后，通过离心(10000g, 4。C)收获生物质将360g LU124的湿细胞悬浮在pH 5.0的1 L的20mM乙酸钠中。在 500巴于^:流化器(Z04)中匀浆处理该容量两次。观察到蛋白质沉淀。通过 离心除去细胞碎片。蛋白质终浓度达到0.7 mg/ml(电导3mS)。此细胞内蛋白质通过几个层析步骤纯化为接近同质，其包括离子交换 层析(Q-琼脂糖FF柱)、大小排阻层析(Superdex大小排阻层析柱， Pharmacia)、和高溶解的离子交换层析(MonoQ柱,Pharmacia):a)离子交换层析使用体积为400 ml的Q琼脂糖FF柱(直径5cm)。柱子用緩冲液A (20mM乙酸钠，pH4.9)平衡。在流速10 ml/min下进行匀浆(1340ml)。用 2倍柱容积的緩沖液A洗涤后，应用120分钟过程的线性梯度至100%的 緩冲液B (含1.5 M NaCl的緩冲液A)。收集活性部分(150ml， Fr. 45-60) (53 mg蛋白质)。b) 大小排阻层析有活性的肌醇六磷酸酶通过超微滤(YM10)膜浓缩到体积为5到10 ml。离心之后，于緩冲液A中以流速lml/min上样该体积于Superdex大 小排阻层析柱(Pharmacia)。收集活性部分(9.7 mg蛋白质，55ml)。c) 高溶解的离子交换层析Mono-Q (1 ml， Pharmacia)柱用緩冲液A平衡。将25 ml来自前面柱 的活性部分以1 ml/min分两步上样。用緩冲液A洗涤10分钟以后，该蛋 白质用线性梯度至100%的緩冲液B洗脱60分钟。收集活性部分(7，8)。分离的蛋白质在SDS-Page分析中显示的大小约为100kDa(见图1)实施例2:分离的酶的特征2a)酶活性用肌醇六磷酸作为底物，并且在肌醇六磷酸酶活性水平适当(标准 0.6U/ml)的条件下，在250 mM乙^/乙酸钠/吐温20 (0.1%)、 pH 5.5緩冲 液中测量酶活性。将该测定标准化用于微滴板(MTP)的应用中。将10 jtl的酶溶液与140 pl 6.49 mM的肌醇六磷酸盐溶液，在pH5.5 的250 mM乙酸钠緩冲液(肌醇六磷酸盐肌醇六磷酸的十二钠盐)中混合。 在37 。C孵育1小时，通过加入等体积的15%三氯乙酸(150 iLil)终止反应。 将此混合物的等份试样(20 jtl)转移到280 nl含有0.32 N H2S04、 0.27%钼 酸铵和1.08%抗坏血酸的溶液中，随后在50°C孵育25分钟。在820 nm 测量蓝色溶液的吸光度。2b)温度镨的测定通过测量不同温度下肌醇六磷酸酶活性来测定最适温度。热稳定性测 试包含在不同温度下的胁迫测试(20分钟)和随后在2a)中所述的标准条件 下(37。C)残余活性的测量。T50值描述在该温度下残余活性为50%的温度。来自季氏毕赤氏酵母的肌醇六磷酸酶在粗提取物中最适反应温度为
71。C， T50值为74°C (见图2)。这些值与可作为NATUPHOSTM (BASF AG) 商购的无花果曲霉肌醇六磷酸酶相比约高15。C。 2c) pH镨的测定在不同pH值的测定中使用4种不同緩冲液系统 甘氨酸緩冲液(250 mM): pH 2.6 - 3.2 乙酸盐緩冲液(250 mM): pH 3.6 - 5.5 咪唑緩冲液(250 mM): pH 5.9 - 7.0Tris緩冲液(250 mM): pH 7.5 - 9.0将50 pi酶溶液加入具有所希望pH值緩冲液的700 pi 6.49 mM肌醇 六磷酸钠中，并且于37。C培育1小时。随后如2a)中所述测量酶活性。结 果在图3中显示。实施例3:测定N-末端序列和胰蛋白酶消化片段切下SDS-Page胶中的90到100 kDa蛋白质条带(见图1)，洗涤、洗 脱并用胰蛋白酶消化。在反相毛细管HPLC (UltiMate， Dionex; C18)上分 离收集该肽，并且用自动埃德曼降解(cLC-494, Applied Biosystems)测序。 从 印 迹 确 定N- 末 端 序 列 VAIQKALVPGLYLASNY画RDVATPELAARDQYNIV。实施例4:来自季氏毕赤氏酵母的肌醇六磷酸酶的克隆和测序除非特殊说明，所有DNA操作和转化都使用分子生物学标准方法进 行(Sambrook等人(1989)分子克隆A laboratory manual. Cold Spring Harbor lab.; Cold Spring Harbor NY; Ausubel, F.M.等人(编辑)"Current protocols in Molecular Biology", John Wiley和Sons, 1995; Innis等人(1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press》4a)简并寡核苷酸的构建首先简并的寡核苦酸Haf236: 5，-GTNGCNATHCARAARGC-3， (SEQ ID NO:3)从N-末端序列VAIQKA演绎出来。从纯化的酶的胰蛋白酶消 化的测序片段获得的氨基酸序列QNEENY，用于产生反向寡核苷酸 Haf259 5，-RTARTTYTCYTCRTTYTG-3， (SEQ ID NO:4)。4b)克隆染色体DNA的制备在20mlYPD培养基中(1。/。酵母提取物、1%细菌用蛋白胨、2%葡 萄糖)在30 。C培养细胞过夜，并通过离心收集。200mg沉淀重悬于800^U H20中。用红色Ribolyser管(Hybaid, matrix C)装满700 pl细胞悬液和780 |nl酚/氯仿(TE緩沖的，pH 7.5)。细胞在6级裂解2 x 30秒(之间在冰上冷 却)，并离心(5分钟，10000 rpm, 4 。C)， 650 pl上清用2 pl RNAse (10 mg/ml) 在37 。C消化30分钟，然后用65 pl 3M乙酸钠和1.3 ml乙醇沉淀。DNA 沉淀(IO min， 13000 rpm， 4 0C, Biofuge Fresco, Heraeus， Hanau， Germany) 用70%乙醇清洗，空气干燥并且重悬于100 nlH20中(-染色体DNA)。PCR将1 jil模版(=如上述分离的染色体DNA)、每种寡核苷酸 Haf236/Haf259和Haf236/Haf257各2 pl、各0.5 pl的dNTP (10 mM)、 5 jil 緩冲液、1 ialPfu超聚合酶(Stratagene)混合，加水至终体积为50 jil。 PCR 程序参数94 。C， 5 min; (94 。C， 30 s; 45 。C， 30 s; 72 。C， 90 s) x 30个循环； 72。C10min。由于所使用的低退火温度45 。C，在电泳胶上检测到几条条 带。使用标准方法从凝胶上分离所有PCR片段(QiaEXII凝胶提取试剂盒， Quiagen)，并连接到pBlueScript载体(Stratagene)的EcoRV限制酶位点。根据Sanger等人,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74 (1997)， 5463-5467测序获得的质粒的插入部分。使用ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)进行测序反应的分离和分析。所获得的DNA序列之一翻译产生包含先前确定的N-末端氨基酸序 列的连续肽。用反向PCR扩增全长序列首先，使用扩增的片段作为探针进行Southern印迹分析(Sambrook 等人(1989),分子克隆.A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)。用几 种限制性内切酶(Roche Diagnostics, Mannheim)消化染色体DNA。用 HindIII和EcoRI消化产生清楚的杂交带，分别为3.4 kb和4.4 kb的中等
大小片段(图4)。由于HindIII切割毕赤酵母肌醇六磷酸酶的测序的3，-末 端区域，该片段包括测序的5，-末端约2.5 kb的上游片段。EcoRI片段包括 来自已知片段两端的序列。HindIII消化和EcoRI消化用于反向PCR。因此，从凝胶中分离适当 大小(约3.4 kb和4.4 kb)的DNA,并且在连接反应中环化。用Haf271 5'-GTGGTTGTACTTTGCTCTG画3" 和 Haf2725，-CCCGATTATCTGGACGAG-3，进行PCR，其与最初测序的PCR片段 互补并且向外延伸。反向PCR染色体DNA (3 pl)用3 jil酶在50 pl总体积中、在推荐温度下消化3 小时。凝胶电泳以后，将通过Southern分析确定的近似大小的DNA片段 用GFX-柱(GFX DNA和凝胶条带纯化试剂盒，Amersham Bioscience, UK) 分离。30 inl纯化的DNA用2 j^l连接酶(快速连接试剂盒，Roche Diagnostics, Mannheim)在40iLil总体积中连接15分钟，然后用GFX柱纯化。此DNA (10 pl)在标准的50 |nl PCR中用作模板(Innis等人(19卯)PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press》PCR程序94 0C, 5 min; (94 。C， 30 s; 58 。C， 30 s; 72 。C, 270 s) x 25个循环；72 。C 10 min。两种消化反应(HindIII、 EcoRI)产生预期长度的PCR产物，其被克隆 至'pBlueScript载体中并观'序。正如所预期的，肌醇六磷酸酶的5，-区域从HindHI片段获得。EcoRI 片段给予缺失的肌醇六磷酸酶的3，-末端。从不同PCR产物组装来自季氏 毕赤氏酵母的肌醇六磷酸酶的完整序列，并在SEQIDNO:l中显示。编码 的M酸序列在SEQ ID NO:2中显示。
权利要求
1.多核苷酸，其选自由以下组成的组(a)多核苷酸，其包含的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO1所示编码区的核苷酸序列；(c)多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO2所示氨基酸序列有至少60％同一性，且该多肽具有肌醇六磷酸酶活性；(d)多核苷酸，其包含的核苷酸序列编码多肽的片段，所述多肽由(a)、(b)或(c)的多核苷酸编码，其中所述片段具有肌醇六磷酸酶活性；(e)多核苷酸，其包含的核苷酸序列的互补链与(a)、(b)和(d)的任一多核苷酸杂交，其中所述核苷酸序列编码具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质；和(f)多核苷酸，其包含的核苷酸序列由于遗传密码的简并性而偏离(e)中定义的核苷酸序列。
2. 权利要求1的多核苷酸，其为DNA或RNA。
3. 包含权利要求1或2的多核苷酸的重组核酸分子。
4. 权利要求3的重组核酸分子，还包含与所述多核苷酸有效连接的表 达控制序列。
5. 载体，其包含权利要求1或2的多核苷酸、或权利要求3或4的重 组核酸分子。
6. 权利要求5的载体,还包含与所述多核苷酸有效连接的表达控制序 列。
7. 产生基因工程宿主细胞的方法，其包括向宿主细胞中引入权利要求 1或2的多核苷酸、权利要求3或4的重组核酸分子或权利要求5 或6的载体。
8. 宿主细胞，其使用权利要求1或2的多核苷酸、权利要求3或4的重组核酸分子、或权利要求5或6的载体基因工程改造，或能够通 过权利要求7的方法获得。
9. 权利要求8的宿主细胞，其为细菌、酵母、真菌、植物或动物的细 胞。
10. 产生由权利要求1或2的多核苷酸编码的多肽的方法，其中在允许 多肽表达的条件下培养权利要求8或9的宿主细胞，并且其中从细 胞和/或培养基分离该多肽。
11. 多肽，其由权利要求1或2的多核苷酸编码，或能够通过权利要求 IO的方法获得。
12. 保藏号为DSM 16949的季氏毕赤氏酵母细胞菌林或其突变体或衍 生物，其保持了产生肌醇六砩酸酶的能力，所述肌醇六磷酸酶在天 然细胞提取物中测定时T50值约为74°C，并且最适反应温度约为 71。C。
13. 从才艮据权利要求12的毕赤酵母细胞获得的肌醇六磷酸酶。
14. 特异性识别权利要求11的多肽的抗体。
15. 包含权利要求11或权利要求13的多肽的组合物。
16. 权利要求15的组合物，其为饲料、食物、或伺料或食物的添加剂。
17. 制备饲料或食物的方法，其包括向饲料或食物组分中加入权利要求 11或权利要求13的多肽的步骤。
18. 权利要求11或权利要求13的多肽用于从肌醇六磷酸中释放无机磷 酸盐的用途。
全文摘要
本发明描述了编码呈现肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列、相应编码的肌醇六磷酸酶多肽、制备该多肽的方法及其在多种工业应用中的用途。
文档编号C12N9/16GK101160395SQ200680012527
公开日2008年4月9日 申请日期2006年4月19日 优先权日2005年4月21日
发明者A·克尼施, E·朔尔腾, O·策尔德尔, S·哈夫纳, T·布鲁格, T·弗里德里希 申请人:巴斯福股份公司